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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Évaluation de la neurotoxicité chez Danio rerio adulte à l’aide d’une batterie de tests comportementaux dans un seul réservoir

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Ici, nous présentons une batterie complète de tests comportementaux, y compris le nouveau réservoir, les bancs et les tests de préférence sociale, pour déterminer efficacement les effets neurotoxiques potentiels des produits chimiques (par exemple, la méthamphétamine et le glyphosate) sur les poissons-zèbres adultes en utilisant un seul réservoir. Cette méthode est pertinente pour la recherche sur la neurotoxicité et l’environnement.

Abstract

La présence d’effets neuropathologiques s’est avérée être, pendant de nombreuses années, le principal critère d’évaluation de la neurotoxicité d’une substance chimique. Cependant, au cours des 50 dernières années, les effets des produits chimiques sur le comportement des espèces modèles ont été activement étudiés. Progressivement, les paramètres comportementaux ont été incorporés dans les protocoles de dépistage neurotoxicologique, et ces résultats fonctionnels sont maintenant couramment utilisés pour identifier et déterminer la neurotoxicité potentielle des produits chimiques. Les tests comportementaux chez les poissons-zèbres adultes fournissent un moyen standardisé et fiable d’étudier un large éventail de comportements, notamment l’anxiété, l’interaction sociale, l’apprentissage, la mémoire et la dépendance. Les tests comportementaux chez les poissons-zèbres adultes consistent généralement à placer le poisson dans une arène expérimentale et à enregistrer et analyser son comportement à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo. Les poissons peuvent être exposés à divers stimuli, et leur comportement peut être quantifié à l’aide d’une variété de mesures. Le nouveau test en réservoir est l’un des tests les plus acceptés et les plus largement utilisés pour étudier le comportement anxieux chez les poissons. Les tests de bancs et de préférences sociales sont utiles pour étudier le comportement social du poisson-zèbre. Ce test est particulièrement intéressant puisque le comportement de l’ensemble du banc est étudié. Ces tests se sont avérés hautement reproductibles et sensibles aux manipulations pharmacologiques et génétiques, ce qui en fait des outils précieux pour étudier les circuits neuronaux et les mécanismes moléculaires sous-jacents au comportement. De plus, ces tests peuvent être utilisés dans le criblage de drogues pour identifier les composés qui peuvent être des modulateurs potentiels du comportement.

Nous montrerons dans ce travail comment appliquer des outils comportementaux en neurotoxicologie des poissons, en analysant l’effet de la méthamphétamine, une drogue récréative, et du glyphosate, un polluant environnemental. Les résultats démontrent la contribution significative des tests comportementaux chez le poisson-zèbre adulte à la compréhension des effets neurotoxicologiques des polluants environnementaux et des médicaments, en plus de fournir des informations sur les mécanismes moléculaires qui peuvent altérer la fonction neuronale.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est une espèce de vertébré modèle populaire pour l’écotoxicologie, la découverte de médicaments et les études de pharmacologie de sécurité. Son faible coût, ses outils de génétique moléculaire bien établis et la conservation des processus physiologiques clés impliqués dans la morphogenèse et le maintien du système nerveux font du poisson-zèbre un modèle animal idéal pour la recherche en neurosciences, y compris la toxicologie neurocomportementale 1,2. Le critère d’évaluation principal de la neurotoxicité d’un produit chimique était, jusqu’à récemment, la présence d’effets neuropathologiques. Dernièrement, cependant, les paramètres comportementaux ont été incorporés dans les protocoles de dépistage neurotoxicologique, et ces résultats fonctionnels sont maintenant couramment utilisés pour identifier et déterminer la neurotoxicité potentielle des produits chimiques 3,4. De plus, les paramètres comportementaux sont très pertinents d’un point de vue écologique, car même un changement de comportement très léger chez les poissons pourrait mettre en danger la survie de l’animal dans des conditions naturelles5.

L’un des tests comportementaux les plus utilisés dans la recherche sur le poisson-zèbre adulte est le nouveau test en réservoir (NTT), qui mesure le comportement anxieux 6,7. Dans ce test, les poissons sont exposés à la nouveauté (les poissons sont placés dans un aquarium inconnu), à un léger stimulus aversif et à leurs réponses comportementales sont observées. Le NTT est utilisé pour évaluer l’activité locomotrice basale, la géotaxie, la congélation et les mouvements erratiques des poissons, principalement. L’erratique8 se caractérise par des changements brusques de direction (zigzag) et des épisodes répétés d’accélérations (dards). Il s’agit d’une réaction d’alarme qui est généralement observée avant ou après les épisodes de gel. Le comportement de congélation correspond à un arrêt complet des mouvements du poisson (à l’exception des mouvements operculaires et oculaires) lorsqu’il est au fond de l’aquarium, par opposition à l’immobilité causée par la sédation, qui provoque l’hypolocomotion, l’akinésie et le naufrage8. Le gel est généralement lié à un état élevé de stress et d’anxiété et fait également partie d’un comportement de soumission. Les comportements complexes sont d’excellents indicateurs de l’état d’anxiété des animaux. Il a été démontré que NTT est sensible aux manipulations pharmacologiques et génétiques9, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les bases neuronales de l’anxiété et des troubles apparentés.

Le poisson-zèbre est une espèce très sociale, nous pouvons donc mesurer un large éventail de comportements sociaux. Le test de haut-fond (ST) et le test de préférence sociale (SPT) sont les tests les plus utilisés pour évaluer le comportement social10. Le ST mesure la tendance des poissons à se regrouper11 en quantifiant leur comportement spatial et leurs schémas de déplacement. Le ST est utile pour étudier la dynamique de groupe, le leadership, l’apprentissage social et la compréhension du comportement social de nombreuses espèces de poissons12. Le SPT chez le poisson-zèbre adulte a été adapté du test de préférence de Crawley pour la nouveauté sociale pour les souris13 et est rapidement devenu un test comportemental populaire pour l’étude de l’interaction sociale chez cette espèce modèle14. Ces deux tests ont également été adaptés pour être utilisés dans des tests de dépistage de drogues et se sont révélés prometteurs pour l’identification de nouveaux composés qui modulent le comportement social15,16.

En général, les tests comportementaux chez le poisson-zèbre adulte sont des outils puissants qui peuvent fournir des informations précieuses sur les mécanismes comportementaux ou les neurophénotypes des composés actifs et des drogues consommées17. Ce protocole détaille comment mettre en œuvre ces outils comportementaux7 avec des ressources matérielles de base et comment les appliquer dans des tests de toxicité pour caractériser les effets d’un large éventail de composés neuroactifs. De plus, nous verrons que les mêmes tests peuvent être appliqués pour évaluer les effets neurocomportementaux d’une exposition aiguë à un composé neuroactif (méthamphétamine) mais aussi pour caractériser ces effets après une exposition chronique à des concentrations environnementales d’un pesticide (glyphosate).

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Protocol

Le strict respect des normes éthiques garantit le bien-être et le bon traitement du poisson-zèbre utilisé pour l’expérimentation. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies par les comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux (CID-SCCI). Les protocoles et les résultats présentés ci-dessous ont été réalisés dans le cadre de la licence accordée par le gouvernement local (numéro d’accord 11336).

1. Logement des animaux pour les tests comportementaux

  1. Effectuer tous les tests (présentés dans la figure 1) dans une pièce comportementale isolée à 27-28 °C entre 10h00 et 17h00.
  2. Laver les poissons témoins et exposés plusieurs fois dans de l’eau propre [eau purifiée par osmose inverse contenant 90 mg/L de sel pour les systèmes d’aquarium, 0,58 mM de CaSO4·2H2O et 0,59 mM de NaHCO3] avant de commencer les expériences afin d’éviter toute contamination potentielle du bassin expérimental.
  3. Acclimater les animaux à la salle de comportement 1 h avant de commencer les expériences.
  4. Assurez-vous que les animaux (≈50 :50 mâle/femelle) sont expérimentalement naïfs et effectuent tous les tests comportementaux à l’aveugle avec des observateurs ignorants du groupe expérimental.
  5. Pour obtenir des résultats significatifs dans les tests comportementaux, avoir un nombre total de 18 sujets par condition (n = 18), idéalement obtenu entre deux ou plusieurs expériences indépendantes. Par exemple, dans les tests individuels, analysez le comportement de 9 animaux par condition, par répétition. Dans les tests de groupe, analysez le comportement d’un banc de 6 à 9 animaux par condition et par répétition.
  6. Effectuer tous les tests en suivant une approche de test de batterie (voir les propositions de planification à la figure 2). Éthiquement plus adaptée, cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, en respectant le principe de réduction 3R7.
  7. La plupart du temps, les tests comportementaux sont liés à des tests biologiques, donc sacrifiez les animaux en suivant les directives d’euthanasie18 avant de prélever et d’analyser des échantillons (OMIC ou produits chimiques). S’il ne s’avère pas qu’il s’agit d’un échantillonnage, ré-stabilisez le groupe témoin à la fin de l’expérience. Réutilisez les animaux témoins à des fins de reproduction ou d’expérimentation après quelques jours.

Figure 1
Figure 1 : Montages expérimentaux. Trois configurations du bac carré pour étudier un large éventail de comportements chez les poissons-zèbres adultes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chronologie expérimentale. Deux propositions de planification pour l’enregistrement des tests comportementaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Configurations expérimentales du réservoir

  1. Comportement anxieux : le nouveau test en réservoir (NTT)
    1. Ajustez la configuration expérimentale (nombre de bassins, de caméras et d’ordinateurs) pour enregistrer le nombre maximal de poissons simultanément. Les tests de comportement individuels prennent du temps, alors optimisez le temps, le matériel et l’espace.
    2. Préparer les bassins expérimentaux pour NTT : Réservoir carré (20 cm de longueur, 20 cm de largeur, 25 cm de hauteur) recouvert de panneaux acryliques sur les parois latérales et le fond pour éviter les reflets et les interférences entre les sujets.
    3. Remplir les bassins expérimentaux avec 7 L (hauteur de la colonne d’eau : 20 cm de hauteur) d’eau de poisson bien oxygénée à 28 °C.
    4. Ajustez la position du réservoir devant la caméra pour éviter une distorsion de l’image.
    5. Vérifiez la configuration de l’éclairage. Le rétroéclairage LED (10000 lux) fournit un éclairage homogéné sur toutes les parties de la cuve pour un enregistrement vidéo dans de bonnes conditions.
    6. Allumez les caméras et réglez-les conformément à la section 3.
    7. Introduisez les sujets, un par un, dans le fond des bassins expérimentaux avant de commencer à enregistrer le plus rapidement possible.
      REMARQUE : Il est important de commencer à enregistrer avec l’animal au fond de l’aquarium.
    8. Veillez à ne pas déranger les animaux pendant l’enregistrement. Utilisation d’un rideau ou d’un panneau pour limiter l’interaction visuelle non seulement entre les réservoirs, mais aussi entre le support et l’extérieur.
    9. À la fin de l’enregistrement (la durée d’enregistrement standard est de 6 min), transférez les animaux qui ont déjà passé le test dans un autre bac afin de ne pas les mélanger avec les animaux naïfs.
    10. Répétez la procédure avec tous les sujets disponibles. Il est conseillé d’avoir un nombre total de 18 sujets par condition pour obtenir des résultats significatifs dans les essais individuels (à partir de deux ou plusieurs répétitions indépendantes).
    11. Randomisez le groupe expérimental assigné à chaque réservoir entre les essais afin d’éviter tout effet potentiel sur le réservoir (si vous enregistrez plusieurs conditions en même temps).
  2. Comportement social groupé : le test de haut-fond (ST)
    1. La configuration expérimentale de ST est la même que celle de NTT (les mêmes réservoirs peuvent être réutilisés directement).
    2. Suivez les étapes 2.1.1-2.1.6. pour configurer le ST.
    3. Introduire le banc (6 à 9 sujets en même temps) au fond des bassins expérimentaux avant de commencer à enregistrer le plus rapidement possible.
      REMARQUE : Il est important de commencer à enregistrer avec l’animal au fond de l’aquarium.
    4. Suivez les étapes 2.1.8 à 2.1.11. pour effectuer le ST.
    5. Répétez la procédure avec tous les sujets disponibles. Pour obtenir des résultats significatifs dans ce test, faites au moins deux répétitions indépendantes avec la même taille de banque dans chaque répétition.
    6. Maintenir la taille du haut-fond cohérente pour tous les groupes expérimentaux et les répétitions à l’intérieur d’une même expérience.
  3. Comportement social individuel : le test de préférence sociale (SPT)
    1. Ajustez la configuration expérimentale pour optimiser l’espace expérimental et le temps d’enregistrement.
    2. Préparer les bassins expérimentaux pour le SPT : Bac carré (20 cm de longueur, 20 cm de largeur, 25 cm de hauteur) transparent (verre ou plastique) pour offrir une visibilité latérale. Le poisson à foyer unique est libre d’interagir avec une zone virtuelle conspécifique - un banc de poissons placé dans le réservoir externe unilatéral, ou avec la zone virtuelle non spécifique - un réservoir externe vide unilatéral.
    3. Remplir les bassins expérimentaux avec 5 L (hauteur de la colonne d’eau : 15 cm, même hauteur que la colonne d’eau dans les bassins extérieurs) d’eau de poisson propre à 28 °C.
    4. Ajustez la position du réservoir devant la caméra pour éviter une distorsion de l’image.
    5. Vérifiez que le système reçoit un éclairage homogène.
    6. Introduisez les sujets, un par un, dans le fond des bassins expérimentaux avant de commencer immédiatement l’enregistrement avec l’animal au centre.
    7. Évitez les interactions visuelles entre les observateurs et les animaux pendant l’enregistrement.
    8. À la fin de l’enregistrement de 6 min, transférez les animaux présents dans un autre bac afin de ne pas les mélanger avec les animaux naïfs.
    9. Répétez la procédure avec tous les sujets disponibles. Avoir un nombre total de 18 sujets par condition pour obtenir des résultats significatifs dans les essais individuels (à partir de deux ou plusieurs répétitions indépendantes).

3. Enregistrement vidéo pour les tests comportementaux

  1. Ouvrez le gestionnaire de caméras pour vérifier la disponibilité de la caméra GigE sur chaque ordinateur.
  2. Lancez le logiciel de contrôle de la caméra GigE (tel que uEye Cockpit, décrit ici). Ouvrez l’option Appareil photo , sélectionnez le mode Monochrome et ajustez la taille de l’image (1 :2).
  3. Ouvrir les propriétés de la caméra
    1. Sous Appareil photo, réglez l’horloge des pixels sur Maximum, réglez la fréquence d’images sur 30 images par seconde (ips) et ajustez l’exposition (réglage automatique ou manuel si l’image est trop sombre).
    2. Sous Image, réglez le gain sur 0 (Auto) et les niveaux de noir (réglage automatique ou manuel pour obtenir un bon contraste).
    3. Sous Taille, ajustez la taille de la fenêtre à la zone à graver (Largeur : Largeur-Gauche, Hauteur : Hauteur-Haut). Cette étape permet de réduire la taille de l’image et, par conséquent, la taille finale de la vidéo.
    4. Fermez les propriétés de la caméra.
  4. Créez un dossier général pour la session de test afin d’enregistrer les paramètres de la caméra et les vidéos.
  5. Pour enregistrer les paramètres de l’appareil photo, définissez Fichier > Enregistrer les paramètres > Fichier et sélectionnez le dossier de test récemment créé.
    REMARQUE : Le fichier de réglages de l’appareil photo peut ainsi être rechargé dans l’application pour continuer à travailler avec les mêmes paramètres d’image à tout moment (par exemple, lorsque l’appareil photo est soudainement éteint ou pour réutiliser les mêmes réglages, ce qui réduit le temps de réglage et homogénéise les conditions expérimentales). Si, à un moment donné, la caméra se fige entre les vidéos, arrêtez l’enregistrement, quittez et éteignez la caméra. Rallumez-le, rechargez les paramètres de la caméra en accédant à Fichier > Charger les paramètres > Fichier et redémarrez l’enregistrement. Vérifiez si la vidéo actuelle a été complètement acquise pour jeter ou répéter le poisson (avant de répéter, donnez aux animaux un peu de temps pour se réacclimater).
  6. Répétez cette procédure de configuration de la caméra (étapes 3.1 à 3.5) sur toutes les caméras.
  7. Lorsque toutes les caméras sont correctement configurées, ouvrez Enregistrer une séquence vidéo.
  8. Sélectionnez Créer pour enregistrer en tant que nouveau fichier vidéo, sélectionnez le dossier de test récemment créé et indiquez dans le nom du fichier vidéo les informations sur le sujet, le type d’expérience et la date.
  9. Sélectionnez Nombre maximal d’images. Tapez 10800 dans la boîte de cadre. La vidéo standard enregistre 6 min (vidéo 1) à 30 ips au format AVI ; Par conséquent, 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 images au total.
  10. Sélectionnez Calculer la fréquence d’images ou indiquez manuellement la fréquence d’images (vitesse d’enregistrement : 30 ips).
  11. Répétez la procédure de création du fichier vidéo sur tous les ordinateurs.
  12. Présentez les sujets, un par un, au fond de chaque bassin expérimental. Tous les tests seront effectués en même temps.
  13. Démarrez rapidement les enregistrements en cliquant sur Enregistrer et attendez d’obtenir le nombre maximum d’images demandées (étape 3.10).
  14. Une fois les vidéos enregistrées, une boîte de discussion apparaît avec le message Nombre maximal d’images réalisées !. Sélectionnez Accepter.
  15. Sélectionnez Fermer pour terminer l’enregistrement et fermer le fichier vidéo.
  16. Retirez les poissons qui viennent d’être observés. Attention à bien les séparer des poissons naïfs.
  17. Sélectionnez directement Créer et répétez le processus pour continuer à enregistrer des vidéos.
  18. Une fois tous les enregistrements terminés, sélectionnez Quitter.
  19. Pour éteindre les caméras, sélectionnez Fermer la caméra et quitter le programme.

4. Analyse des vidéos enregistrées

  1. Lancez le logiciel d’analyse (voir Tableau des matériaux).
  2. Pour élaborer sur un nouveau modèle, cliquez sur Nouveau à partir d’un modèle > Application d’un modèle prédéfini > à partir d’un fichier vidéo, puis sélectionnez une vidéo pour commencer à configurer le modèle. Essayez de choisir une vidéo représentative de l’expérience avec un sujet présentant une bonne mobilité et de bonnes conditions d’enregistrement.
  3. Dans Paramètres, configurez les paramètres dans les fenêtres suivantes (1 à 4/7). Sélectionnez le modèle Poisson > Poisson-zèbre adulte, l’arène Open Field Square > One Arena, le nombre de sujets par arène (pour le ST, un package multi-tracking [suivre plusieurs sujets dans une arène] est requis), le type de détection par point central et enfin ajustez la fréquence d’images à 30 fps. Dans les fenêtres suivantes (5 à 7/7), ne modifiez pas les paramètres ; la configuration par défaut est OK.
  4. Nommez l’expérience en tant que modèle et placez-la dans le même dossier que le reste de la vidéo stockée. Le modèle sera créé sous la forme d’un dossier d’expérience avec plusieurs subdivisions contenant toutes les informations de configuration.
  5. Sous Paramètres de l’expérience, vérifiez la configuration définie (à partir du fichier vidéo, de l’arène, du nombre de sujets, de l’image par seconde). Ici, les unités système peuvent être modifiées.
  6. Sous Paramètres de l’arène, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le centre de l’écran et sélectionnez Saisir. À partir d’un fichier à l’écran. Choisissez une image vidéo de bonne qualité et acceptez pour capturer cette image pour les paramètres d’arrière-plan. Tout d’abord, calibrez l’image, en générant une règle calibrée. Utilisez la largeur du réservoir comme balance (19 cm). Ensuite, dessinez l’arène. Attention à faire le carré juste assez pour éviter les reflets de l’animal lorsque ce dernier s’approche de la surface ou toute confusion éventuelle du logiciel du poisson avec les zones noires de l’aquarium. Enfin, dessinez les zones de forme à l’aide de la fonction Cadre .
    1. Pour NTT et ST, divisez l’avant du réservoir en deux zones virtuelles égales, en haut et en bas (voir Figure 1). Dessinez deux cases horizontales égales. Des boîtes couvrent la moitié d’une arène pour chacun d’entre eux. Nommez respectivement le haut et le bas pour les zones supérieure et inférieure. Veillez à ce que les boîtes aient la même largeur (9-10 cm) et la même longueur (8-9 cm), ne dépassent pas les limites de l’arène (carré orange) et ne se chevauchent pas, en vérifiant que chaque zone fléchée indique exactement ses zones.
    2. Pour le SPT, divisez conceptuellement l’arène expérimentale en trois zones de taille égale : vide, centrale et conspécifique (voir la figure 1). Dessinez trois cases verticales égales. Nommez la boîte orientée vers le bassins du haut-fond comme Conspécifique, la boîte orientée vers le réservoir vide comme Vide et celle du milieu comme Centre. Veillez à ce que les boîtes aient la même largeur (6 cm) et la même longueur (18-19 cm), qu’elles ne dépassent pas les limites de l’arène et qu’elles ne se chevauchent pas.
  7. Sous Paramètres de détection, vérifiez la vidéo à traiter dans le fichier vidéo. Ensuite, vérifiez la qualité de détection (poisson en jaune, point central rouge). Cliquez sur Détection automatique pour ajuster la détection, en remettant au point l’animal (choisissez une image que l’animal nage de profil sur le fond blanc, dessinez l’image en prenant tout son corps, et validez la détection avec Oui). Ouvrez Avancé pour améliorer la détection en sélectionnant Soustraction dynamique, Sujet plus sombre, Paramètres d’arrière-plan, Apprentissage en arrière-plan, Taille du sujet, Réduction du bruit, etc.
  8. Sous Paramètres des essais, placez un essai et supprimez les autres (cliquez avec le bouton droit de la souris et supprimez)
  9. Sous Paramètres de données, créez des fenêtres de dialogue Résultats . Paramétrez les résultats par heure et par zone. Par exemple, créez une fenêtre Résultats pour la sortie de données par minutes et une autre pour la sortie de données par temps total (6 min). Demandez la sortie de données pour chaque zone (demandez-la si la distance dans chaque zone est nécessaire). Reliez les différentes fenêtres de résultats à la fenêtre d’accueil à l’aide de flèches.
  10. Sous Paramètres d’analyse, sélectionnez les paramètres à analyser et le type de statistiques pour chaque paramètre. Ces paramètres seront automatiquement calculés en fonction des données acquises à partir du suivi.
    1. Pour NTT et SPT, sélectionnez les options définies ci-dessous :
      1. Sélectionnez Distance parcourue (sélectionnez Total) pour obtenir la distance parcourue dans l’arène (cm) et la distance parcourue dans les zones respectives (cm).
      2. Sélectionnez Dans les zones (sélectionnez Zones, Fréquence, Cumul et Latence jusqu’à la première) pour avoir le temps passé dans les zones et la latence jusqu’à la première entrée dans les zones.
      3. Sélectionnez Transition de zone (sélectionnez Seuil : 0 cm, Ajouter une zone 1 > une zone 2 ; Zone 2 > Zone 1, dans toutes les zones, Fréquence) pour obtenir le nombre d’entrées dans les zones.
      4. Sélectionnez Mobilité ( renseignez High mobile above 70%, Immobile below 3%, minimum 150 frames, et sélectionnez la fréquence, le cumul et la latence en premier) pour avoir la durée de l’hypermobilité (s), la durée de gel (s).
        REMARQUE : Voir la section Discussion pour plus de détails sur l’approximation du comportement de congélation à l’aide de l’analyse automatisée et le nombre et la durée (s) des épisodes de congélation.
      5. Sélectionnez Accélération et Angle de braquage (sélectionnez la fréquence et le cumul) pour évaluer l’occurrence de comportements complexes tels que les sauts et les mouvements erratiques (accélérations rapides).
    2. Pour le ST, en plus des paramètres exploratoires ci-dessus, sélectionnez l’option Distance entre les sujets (sélectionnez tous les sujets, moyenne, maximum, minimum) pour obtenir la distance moyenne entre les poissons (cm), la distance moyenne entre le voisin le plus proche (cm) et la distance moyenne entre le voisin le plus éloigné.
  11. Le modèle est prêt à être utilisé. Enregistrez les dernières modifications et fermez le modèle sans acquérir de données de la vidéo (maintenez le fichier modèle, il est léger et facile à gérer et à copier). S’il existe plusieurs licences logicielles, analysez les vidéos du même modèle copiées sur chaque ordinateur.
  12. Pour copier et utiliser le modèle, deux options s’offrent à vous :
    1. Ouvrez le fichier modèle avec le logiciel d’analyse comportementale, accédez à Fichier > Enregistrer sous pour créer un nouveau fichier identique.
    2. Dans l’interface d’accueil, sélectionnez Nouveau à partir d’un modèle > Application d’un modèle personnalisé > à partir d’un fichier vidéo (choisissez un modèle. EthXV). Nommez la nouvelle expérience et sélectionnez son emplacement. Le logiciel peut prendre quelques minutes pour copier les informations à partir du fichier modèle.
  13. Accédez aux paramètres de l’arène pour réajuster le modèle si la vidéo a été enregistrée avec une autre caméra (suivez les étapes 4.6 et 4.7).
  14. Accédez à Paramètres de détection ou à Acquisition pour vérifier quelle vidéo est sélectionnée et modifiez le fichier vidéo si nécessaire.
  15. Sous Acquisition, sélectionnez DDS > Ready to Start (DDS prêt à démarrer). Le traitement de la vidéo par le logiciel peut prendre quelques minutes.
  16. Une fois l’acquisition terminée, allez dans l’éditeur de pistes. Sélectionnez l’accélération x16 pour lire la vidéo traitée plus rapidement et vérifier si le suivi est correct.
    REMARQUE : Parfois, il peut y avoir des « pertes » dans le suivi (en raison de réflexions ou de confusion du logiciel lui-même). Ils peuvent être édités manuellement à partir de cette partie s’ils sont peu nombreux ; Dans le cas contraire, il est préférable de retraiter l’ensemble de l’expérience, en améliorant la définition du canevas et la détection.
  17. Sous Statistiques, cliquez sur Calculer > exporter les données. L’exportation des données se trouve directement dans le dossier de test.
  18. Sous Visualisation des pistes ou Cartes thermiques, générez et exportez (clic droit, exporter l’image, sélectionnez le dossier Exporter les fichiers de l’expérience pour enregistrer ces données avec le rapport de feuille de calcul) des images de suivi de l’animal.
  19. Accédez à Fichier pour fermer l’expérience active et répétez cette procédure pour la vidéo suivante.

5. Analyse statistique

  1. Analyser la normalité (test de Shapiro-Wilk) des données dans chaque groupe.
  2. Évaluez l’homoscédasticité avec le test de Levene.
  3. Utiliser l’ANOVA à un facteur suivie des tests de comparaison multiples de Dunnett et Tukey pour tester les différences entre les groupes lorsque les critères de normalité et d’homoscédasticité ne peuvent être rejetés.
  4. Utilisez le test de Kruskal-Wallis suivi d’une comparaison par paires à l’aide de la correction de Bonferroni pour tester les différences entre les groupes lorsque les critères de normalité et d’homoscédasticité sont rejetés.
  5. Tracez les données à l’aide d’un logiciel graphique.

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Representative Results

Dans cette section, nous examinerons quelques applications possibles de ces outils comportementaux en neurotoxicologie des poissons. Les résultats suivants correspondent à la caractérisation des effets aigus ou excessifs de la méthamphétamine (METH), une drogue récréative, et des effets subchroniques du glyphosate, l’un des principaux herbicides présents dans les écosystèmes aquatiques.

Caractérisation d’un modèle de neurotoxicité excessive de méthamphétamine chez le poisson-zèbre adulte
Lors de l’évaluation de l’effet de 40 mg/L de METH sur NTT (Figure 3), le test de Kruskal-Wallis a confirmé que les animaux exposés présentaient une géotaxie positive, caractérisée par une diminution du temps d’exploration dans la zone supérieure du bassin expérimental (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), ainsi que de la distance parcourue dans cette partie (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) et dans le nombre de visites (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Nous avons également observé une augmentation significative du temps de latence précédant la première visite dans la zone supérieure (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Il est important de noter que les différences observées dans les paramètres mesurés dans le NTT après exposition à METH sont constantes dans le temps, comme le confirme la correction de Bonferroni (P > 0,8). Un effet significatif du temps d’exposition a été observé pour le comportement de congélation (H(2) = 13,120, P = 0,0014).

Figure 3
Figure 3 : Comportement anxieux évalué dans un essai standard de 6 minutes en bassin neuf (NTT) de poissons-zèbres adultes exposés à 40 mg/L de méthamphétamine (METH) pendant 3 h et 48 h. Les données de chaque expérience ont été normalisées en fonction des valeurs de contrôle correspondantes. Les données combinées sont présentées sous la forme d’un nuage de points avec la médiane (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Test de Kruskal Wallis avec correction de Bonferroni pour les paramètres NTT. Données issues de 2 expériences indépendantes. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Bedrossiantz et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les mouvements de congélation peuvent être quantifiés en évaluant la fréquence, la latence, la durée ou l’emplacement du gel. La meilleure façon de les noter est sans aucun doute l’œil d’un observateur expérimenté, ce qui est assez laborieux et complexe, nous avons donc essayé une alternative automatisée utilisant le logiciel EthoVision pour détecter le comportement de gel19. Nous avons constaté que le nombre, la latence et la durée des attaques de gel calculés par le logiciel (tableau 1A) sont en corrélation avec une bonne précision avec les épisodes notés manuellement par l’observateur (tableau 1B). Alors que les deux méthodes sont équivalentes en termes de résultats (P = 0,958, test de Student), nous avons utilisé l’approche automatisée pour évaluer la congélation ici. Après 3 h d’exposition à la méthamphétamine, le temps de congélation a augmenté de manière significative (p = 0,0012), alors qu’aucune différence n’a été observée avec le témoin après 48 h d’exposition (p = 0,16). La METH n’a produit aucun effet sur les mouvements erratiques à l’un ou l’autre moment.

Nous avons utilisé deux paradigmes expérimentaux pour évaluer les effets sur le comportement social après une exposition aiguë à la METH. L’IST (figure 4) a révélé que la distance moyenne et la distance la plus éloignée entre les individus étaient significativement plus élevées pour les poissons traités à la méthamphétamine (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12 ; H(2) = 52,504, P = 3,97 x 10-12 pour les distances inter-poissons moyennes et les plus éloignées, respectivement), ce qui indique un phénotype comportemental d’isolement social. Encore une fois, nous remarquons qu’aucun effet temporel n’a été trouvé en utilisant le test post hoc de Bonferroni (P > 0,5).

Figure 4
Figure 4 : Comportement social d’un poisson-zèbre adulte exposé à 40 mg/L de méthamphétamine (METH) pendant 3 h et 48 h. Résultats des tests de hauts-fonds, y compris les distances entre poissons moyennes et les distances les plus éloignées. Les données combinées sont présentées sous la forme d’un nuage de points avec la médiane (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Test de Kruskal Wallis avec correction de Bonferroni. Données issues de 2 expériences indépendantes. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Bedrossiantz et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans le SPT (figure 5), les poissons traités présentent une diminution significative du temps passé et de la distance parcourue dans la zone conspécifique (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6 ; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 pour le temps passé et la distance parcourue dans la zone conspécifique, respectivement). Ces résultats confirment le phénotype d’isolement social suggéré par les résultats du TS. Le test post-hoc Honest Significant Difference (HSD) de Tukey n’a exclu aucune différence possible entre les deux temps d’analyse (P > 0,5).

Figure 5
Figure 5 : Comportement social d’un poisson-zèbre adulte exposé à 40 mg/L de méthamphétamine (METH) pendant 3 h et 48 h. Les résultats du test de préférence sociale (SPT), y compris le temps et la distance des poissons dans chacune des trois zones virtuelles de l’aquarium expérimental : vide, centrale et conspécifique. Les données de chaque expérience ont été normalisées en fonction des valeurs de contrôle correspondantes. Les données combinées sont présentées sous la forme d’un nuage de points avec la médiane (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Dunnett. Données issues de 2 expériences indépendantes. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Bedrossiantz et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Effet comportemental de l’exposition subchronique aux niveaux environnementaux de glyphosate
L’analyse comportementale des effets d’une exposition subchronique à 3 μg/L de glyphosate sur le NTT (Figure 6) révèle une diminution significative du temps passé à explorer le sommet (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), de la distance parcourue dans cette partie (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) et du nombre de visites (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Ces effets sont caractéristiques d’un comportement positif de la géotaxie, tout comme l’effet accru observé sur le temps de latence précédant la première visite au sommet du réservoir (H(2) = 9,628, P = 0,008). L’expression des comportements erratiques et de congélation des animaux exposés a également été analysée dans le NTT. La durée (H(2) = 17,261, P = 0,025) et le nombre d’épisodes erratiques (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) ont été significativement augmentés par le glyphosate. En revanche, aucune différence de congélation n’a été trouvée avec le témoin (Khi-deux de Pearson(2) = 2,964, P = 0,253). Appliquées à un contexte écologique, les observations faites à NTT suggèrent que le glyphosate pourrait diminuer considérablement le comportement exploratoire des poissons, mettant en péril leur capacité à survivre dans la nature.

Figure 6
Figure 6 : Comportement anxieux évalué dans un essai standard de 6 minutes en bassin neuf (NTT) de poissons-zèbres adultes exposés à 0,3 μg/L et 3 μg/L de glyphosate pendant 2 semaines. Paramètres comportementaux analysés, ainsi qu’un dessin animé du bassin expérimental divisé en deux zones virtuelles égales, en haut et en bas. Données présentées sous la forme d’un nuage de points avec la médiane (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Dunnett (Distance totale, Distance en haut, Temps en haut, Transitions vers le haut, Épisodes erratiques, Fréquence de mobilité élevée) ou le test de Kruskal Wallis avec correction de Bonferroni (Latence vers le haut, Durée erratique). Aucune différence (P > 0,05) n’a été constatée en ce qui concerne la durée de congélation et les épisodes de congélation. Données provenant de 2 à 4 expériences indépendantes. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Faria et al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La scolarisation, c’est-à-dire des groupes non polarisés de congénères qui sont maintenus ensemble par la pression sociale pour se protéger des prédateurs, est une tendance naturelle de Danio rerio. Le banc peut se « resserrer » ou « s’étendre » en fonction du niveau d’anxiété ou de peur des animaux, un effet visuel particulier qu’il est très facile d’identifier expérimentalement (Figure 7). Dans l’expérience du glyphosate, l’essai de bancs a révélé une augmentation de l’anxiété chez les poissons exposés à 3 μg/L, reflétée par un regroupement des bancs et donc une diminution significative de la distance moyenne et de la distance la plus éloignée entre les individus (F2,56 = 5,664, P = 0,006 et F2,56 = 7,413, P = 0,001, pour les distances interpoissons moyennes et les plus éloignées, respectivement) par rapport au contrôle.

Figure 7
Figure 7 : Comportement social d’un poisson-zèbre adulte exposé à 0,3 μg/L et 3 μg/L de glyphosate pendant 2 semaines. Données présentées sous forme de nuage de points avec la médiane (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Dunnett (distance moyenne entre poissons et distance la plus éloignée) Données de 2 à 4 expériences indépendantes. Cette figure a été reproduite avec l’autorisation de Faria et al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Approximation du comportement de congélation à l’aide d’une analyse automatisée. Les données présentées dans ce tableau proviennent du même enregistrement (vidéo 1) analysé à l’aide de deux méthodes différentes. (A) Approximation du comportement de congélation par calcul automatisé avec le logiciel EthoVision V13. La mobilité variable est calculée à partir du changement de la zone de sujet entre deux échantillons, elle dépend donc de la fréquence d’acquisition de cette zone. Nous avons fixé un seuil d’immobilité très bas (moins de 3% de mobilité) ainsi que la fréquence d’échantillonnage à un temps continu minimum de 5 s (plus de 150 images). (B) Analyse du comportement de congélation avec le logiciel interactif de recherche sur l’observation comportementale (BORIS, logiciel libre et open-source). BORIS est un logiciel d’enregistrement d’événements pour le codage vidéo et les observations en direct. Avec BORIS, l’observateur peut coder l’épisode de gel en tant qu’événement d’état, en définissant les points de départ et d’arrivée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Vidéo 1 : Contrôlez les poissons dans le nouveau test en bassin. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Les comportements anxieux caractéristiques observés dans le NTT ont été positivement corrélés avec les niveaux de sérotonine analysés dans le cerveau21. Par exemple, après exposition à la parachlorophénylalanine (PCPA), un inhibiteur de la biosynthèse de la 5-HT, les poissons ont présenté une géotaxie positive ainsi qu’une diminution des taux cérébraux de 5-HT22, des résultats très similaires à ceux obtenus avec la METH. Par conséquent, la diminution des niveaux de sérotonine dans le cerveau et l’affichage d’une géotaxie positive chez le poisson-zèbre exposé à la méthamphétamine suggèrent que le comportement anxieux produit par la drogue est médié par la voie sérotoninergique. Il est intéressant de noter qu’un phénotype comportemental similaire, c’est-à-dire un effet anxiogène sur la géotaxie, peut être observé chez les poissons-zèbres adultes exposés pendant 2 semaines à 0,3 3 μg/L et 3 μg/L, deux concentrations de glyphosate pertinentes pour l’environnement. Une augmentation de la géotaxie a également été précédemment rapportée chez les poissons-zèbres adultes avec l’acrylamideneurotoxique 6,23. Dans tous ces cas, ce phénotype comportemental (augmentation de la géotaxie dans le NTT, caractéristique de la substance anxiogène) a été associé à la diminution des niveaux de neurotransmetteurs monoaminergiques. Par conséquent, le paradigme NTT combiné à l’analyse neurochimique du cerveau fournit des informations écologiquement pertinentes, un comportement exploratoire et une efficacité de recherche de nourriture et relie les neurophénotypes comportementaux aux modulations des neurotransmetteurs.

D’autre part, une altération des comportements sociaux dans les deux essais, le ST et le SPT, a également été observée chez les poissons traités à la méthamphétamine. Le résultat obtenu dans cette étude est cohérent avec plusieurs études avec des rats et des singes, où l’exposition aiguë et chronique des animaux de l’étude à la METH entraîne un retrait social24. Les changements de comportement social associés à l’abus de METH ont été expliqués chez l’homme par des altérations de la fonction sociocognitive24. Un effet anxiogène sur la taille des bancs a été observé chez des poissons-zèbres exposés pendant 2 semaines à 3 μg/L de glyphosate. Nous avons observé une phénocopie de cet effet chez des poissons-zèbres exposés à 53 mg/L (0,75 mM) d’acrylamide pendant 3 jours 6,23.

Les tests NTT, ST et SPT permettent de déterminer efficacement les effets neurotoxiques potentiels25 d’un large éventail de produits chimiques, comme l’illustre l’étude de modèles de toxicité aiguë de la méthamphétamine et du glyphosate subchronique chez le poisson-zèbre adulte. Le comportement est, en toxicologie, un paramètre apical pertinent, caractérisant les effets au niveau de l’organisme d’un produit chimique pour la neurotoxicité et la recherche environnementale. En plus d’être un critère d’évaluation sublétal dans des conditions de laboratoire, les changements de comportement, tels que le comportement exploratoire ou social, peuvent être de nature délétère. De plus, la batterie d’analyse comportementale proposée est une méthode semi-automatisée facile à mettre en œuvre11 et, par conséquent, très efficace si les tests sont planifiés consciemment (principe de réduction)26. La réalisation de ces tests sous forme de batterie d’essai à l’aide d’un seul réservoir réduit le nombre d’animaux, le temps expérimental et la production de déchets.

L’ordre des dosages dans la batterie est une considération importante si nous voulons étudier le profil de réponse d’un individu dans chaque essai. À cette fin, la réalisation des tests individuels suivis (voir Figure 2) permet de garder l’animal identifié et de relier son comportement exploratoire à sa préférence sociale. De plus, les réponses comportementales de l’animal peuvent être liées à d’autres données biologiques, telles que son profil de neurotransmetteurs ou l’expression de ses gènes, si les poissons sont identifiés jusqu’au point final de l’échantillonnage (Figure 2A).

Habituellement, l’analyse comportementale permet d’observer les différences entre les groupes. Dans un premier temps, les réponses individuelles sont calculées sur la base du suivi des animaux27 avant de regrouper les données par groupe. Ensuite, les moyennes et la différence de variance par rapport au groupe témoin sont comparées pour chaque paramètre comportemental calculé. Dans le cas de l’analyse des bancs12, il est essentiel d’être très clair sur le fait que l’unité de variance est le groupe de poissons d’essai, et non les poissons individuels, car le comportement de chaque poisson est influencé par les autres poissons du banc. C’est la méthode utilisée dans la plupart des articles pour traiter les données comportementales28. Cependant, il pourrait être utile de repenser l’analyse des paramètres comportementaux non pas sur une base paramètre par paramètre, mais comme une réponse globale par essai. Par exemple, on pourrait calculer la covariance de chaque mesure effectuée dans un essai et la rapporter comme une façon différente de mesurer la même chose : un comportement anxieux, exploratoire ou grégaire. Il existe de nombreuses façons de calculer et d’interpréter les données comportementales28,29. En fonction du nombre de conditions, du type de tests et de l’acquisition d’images (2D ou 3D)30,31, l’analyse peut être complètement repensée afin de tirer le meilleur parti des données.

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Disclosures

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’Agencia Estatal de Investigación du Ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (projet PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centre d’Excellence Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz a bénéficié d’une bourse de doctorat (PRE2018-083513) cofinancée par le gouvernement espagnol et le Fonds social européen (FSE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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References

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