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Neuroscience

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Aqui, apresentamos uma bateria de teste comportamental abrangente, incluindo o novo tanque, Shoaling e testes de preferência social, para determinar efetivamente os potenciais efeitos neurotóxicos de produtos químicos (por exemplo, metanfetamina e glifosato) em peixes-zebra adultos usando um único tanque. Este método é relevante para neurotoxicidade e pesquisa ambiental.

Abstract

A presença de efeitos neuropatológicos provou ser, por muitos anos, o principal desfecho para avaliar a neurotoxicidade de uma substância química. No entanto, nos últimos 50 anos, os efeitos de produtos químicos sobre o comportamento de espécies-modelo têm sido ativamente investigados. Progressivamente, desfechos comportamentais foram incorporados em protocolos de triagem neurotoxicológica, e esses desfechos funcionais são agora rotineiramente usados para identificar e determinar a potencial neurotoxicidade de produtos químicos. Ensaios comportamentais em peixes-zebra adultos fornecem um meio padronizado e confiável para estudar uma ampla gama de comportamentos, incluindo ansiedade, interação social, aprendizagem, memória e dependência. Ensaios comportamentais em peixes-zebra adultos normalmente envolvem colocar os peixes em uma arena experimental e registrar e analisar seu comportamento usando software de rastreamento de vídeo. Os peixes podem ser expostos a vários estímulos, e seu comportamento pode ser quantificado usando uma variedade de métricas. O novo teste do tanque é um dos testes mais aceitos e amplamente utilizados para estudar o comportamento semelhante à ansiedade em peixes. Os testes de cardume e preferência social são úteis no estudo do comportamento social do peixe-zebra. Este ensaio é particularmente interessante uma vez que o comportamento de todo o cardume é estudado. Estes ensaios têm se mostrado altamente reprodutíveis e sensíveis a manipulações farmacológicas e genéticas, tornando-os ferramentas valiosas para o estudo dos circuitos neurais e mecanismos moleculares subjacentes ao comportamento. Adicionalmente, estes ensaios podem ser utilizados na triagem de fármacos para identificar compostos que possam ser potenciais moduladores do comportamento.

Mostraremos neste trabalho como aplicar ferramentas comportamentais em neurotoxicologia de peixes, analisando o efeito da metanfetamina, uma droga recreativa, e do glifosato, um poluente ambiental. Os resultados demonstram a significativa contribuição dos ensaios comportamentais em peixes-zebra adultos para a compreensão dos efeitos neurotoxicológicos de poluentes ambientais e drogas, além de fornecer informações sobre os mecanismos moleculares que podem alterar a função neuronal.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) é uma espécie de vertebrado modelo popular para estudos de ecotoxicologia, descoberta de drogas e farmacologia de segurança. Seu baixo custo, ferramentas genéticas moleculares bem estabelecidas e conservação dos principais processos fisiológicos envolvidos na morfogênese e manutenção do sistema nervoso fazem do peixe-zebra um modelo animal ideal para pesquisas em neurociências, incluindo toxicologianeurocomportamental1,2. O principal desfecho para avaliar a neurotoxicidade de um produto químico era, até recentemente, a presença de efeitos neuropatológicos. Ultimamente, no entanto, desfechos comportamentais têm sido incorporados em protocolos de triagem neurotoxicológica, e esses desfechos funcionais são agora comumente usados para identificar e determinar a potencial neurotoxicidade de substâncias químicas 3,4. Além disso, os desfechos comportamentais são altamente relevantes do ponto de vista ecológico, pois mesmo uma mudança comportamental muito leve em peixes poderia colocar em risco a sobrevivência do animal em condições naturais5.

Um dos ensaios comportamentais mais utilizados na pesquisa do peixe-zebra adulto é o novel tank test (NTT), que mede o comportamento semelhante à ansiedade 6,7. Neste ensaio, os peixes são expostos à novidade (os peixes são colocados em um tanque desconhecido), a um estímulo aversivo leve e suas respostas comportamentais são observadas. O NTT é utilizado para avaliar principalmente a atividade locomotora basal, geotaxis, congelamento e movimentos erráticos de peixes. A errática8 é caracterizada por mudanças bruscas de direção (ziguezagueamento) e episódios repetidos de acelerações (ousadia). É uma reação de alarme e geralmente é observada antes ou depois de episódios de congelamento. O comportamento de congelamento corresponde à cessação completa dos movimentos dos peixes (exceto os movimentos operculares e oculares) no fundo do tanque, diferentemente da imobilidade causada pela sedação, que causa hipolocomoção, acinesia e afundamento8. O congelamento geralmente está relacionado a um alto estado de estresse e ansiedade e também faz parte do comportamento submisso. Comportamentos complexos são excelentes indicadores do estado de ansiedade dos animais. As NTT têm se mostrado sensíveis à manipulação farmacológica e genética9, tornando-se uma ferramenta valiosa para o estudo das bases neurais da ansiedade e transtornos relacionados.

O peixe-zebra é uma espécie altamente social, por isso podemos medir uma ampla gama de comportamentos sociais. O teste de cardume (TS) e o teste de preferência social (TCP) são os ensaios mais utilizados para avaliar o comportamento social10. O TS mede a tendência dos peixes aagruparem-se 11 quantificando seu comportamento espacial e padrões de movimento. O TS é útil para estudar dinâmicas de grupo, liderança, aprendizagem social e compreensão do comportamento social de muitas espécies de peixes12. O TCP em zebrafish adultos foi adaptado do teste de preferência de Crawley por novidade social para camundongos13 e rapidamente se tornou um ensaio comportamental popular para o estudo da interação social nesta espécie modelo14. Esses dois testes também foram adaptados para uso em ensaios de triagem de drogas e têm se mostrado promissores na identificação de novos compostos que modulam o comportamento social15,16.

Em geral, ensaios comportamentais em peixes-zebra adultos são ferramentas poderosas que podem fornecer informações valiosas sobre os mecanismos comportamentais ou os neurofenótipos de compostos ativos e drogas abusadas17. Este protocolo detalha como implementaressas ferramentas comportamentais7 com recursos materiais básicos e como aplicá-las em ensaios de toxicidade para caracterizar os efeitos de uma ampla gama de compostos neuroativos. Além disso, veremos que os mesmos testes podem ser aplicados para avaliar os efeitos neurocomportamentais da exposição aguda a um composto neuroativo (metanfetamina), mas também para caracterizar esses efeitos após exposição crônica a concentrações ambientais de um pesticida (glifosato).

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Protocol

O estrito cumprimento das normas éticas garante o bem-estar e o tratamento adequado do peixe-zebra utilizado para experimentação. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (CID-CSIC). Os protocolos e resultados apresentados a seguir foram realizados sob a licença concedida pela prefeitura local (convênio número 11336).

1. Alojamento de animais para testes comportamentais

  1. Realizar todos os testes (apresentados na Figura 1) em sala comportamental isolada a 27-28 °C entre 10:00 e 17:00.
  2. Lavar os peixes controle e expostos várias vezes em água limpa para peixes [água purificada por osmose reversa contendo 90 mg/L de sal em sistemas de aquário, 0,58 mM de CaSO4·2H2O e 0,59 mM de NaHCO3] antes de iniciar os experimentos para evitar qualquer potencial contaminação do tanque experimental.
  3. Aclimatar os animais à sala de comportamento 1 h antes do início dos experimentos.
  4. Garantir que os animais (proporção macho:fêmea ≈50:50) sejam experimentalmente ingênuos e realizar todos os testes comportamentais de maneira cega com observadores que desconhecem o grupo experimental.
  5. Para obter resultados significativos em ensaios comportamentais, ter um número total de 18 sujeitos por condição (n = 18), idealmente obtidos entre dois ou mais experimentos independentes. Por exemplo, em testes individuais, analise o comportamento de 9 animais por condição, por repetição. Nos testes em grupo, analisar o comportamento de um cardume de 6 a 9 animais por condição, por repetição.
  6. Realize todos os testes seguindo uma abordagem de teste de bateria (consulte as propostas de planejamento na Figura 2). Eticamente, mais adequado, esse método permite reduzir o número de animais necessários para o estudo, obedecendo ao princípio de redução de3R7.
  7. Na maioria das vezes, os ensaios comportamentais estão ligados a ensaios biológicos, portanto, sacrificar os animais seguindo as diretrizes de eutanásia18 antes de coletar e analisar amostras (OMICs ou produtos químicos). Se o desfecho não for amostrado, reestável o grupo controle no final do experimento. Reutilizar os animais de controle para fins reprodutivos ou experimentais após alguns dias.

Figure 1
Figura 1: Montagens experimentais. Três configurações do tanque quadrado para estudar uma ampla gama de comportamentos em peixes-zebra adultos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Linha do tempo experimental. Duas propostas de planejamento para o registro de ensaios comportamentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Configurações experimentais do tanque

  1. Comportamento semelhante à ansiedade: O novo teste do tanque (NTT)
    1. Ajuste a configuração experimental (número de tanques, câmeras e computadores) para registrar o número máximo de peixes simultaneamente. Os ensaios de comportamento individual são demorados, portanto, otimizam tempo, material e espaço.
    2. Preparar os tanques experimentais para NTT: Tanque quadrado (20 cm de comprimento, 20 cm de largura, 25 cm de altura) coberto com painéis de acrílico nas paredes laterais e fundo para evitar reflexão e interferência entre os sujeitos.
    3. Encher os tanques experimentais com 7 L (altura da coluna de água: 20 cm de altura) de água de peixe bem oxigenada a 28 °C.
    4. Ajuste a posição do tanque na frente da câmera para evitar imagens distorcidas.
    5. Verifique a configuração da iluminação. A luz de fundo LED (10000 lux) fornece uma iluminação homogeneizada em toda a parte do tanque para gravação de vídeo em boas condições.
    6. Ligue as câmeras e ajuste-as seguindo a seção 3.
    7. Introduza os sujeitos, um a um, no fundo dos tanques experimentais antes de começar a gravar o mais rápido possível.
      OBS: É importante iniciar a gravação com o animal no fundo do tanque.
    8. Tome cuidado para não perturbar os animais durante a gravação. Uso de uma cortina ou painel para limitar a interação visual não apenas entre os tanques, mas também entre o suporte e o exterior.
    9. Ao final da gravação (o tempo padrão de gravação é de 6 min), transfira os animais que já passaram pelo teste para outro tanque para não misturá-los com os animais ingênuos.
    10. Repita o procedimento com todos os assuntos disponíveis. É aconselhável ter um número total de 18 indivíduos por condição para obter resultados significativos em ensaios individuais (a partir de duas ou mais réplicas independentes).
    11. Randomize o grupo experimental atribuído a cada tanque entre os ensaios para evitar quaisquer efeitos potenciais do tanque (se você estiver gravando várias condições ao mesmo tempo).
  2. Comportamento social agrupado: O Shoaling Test (TS)
    1. A configuração experimental do ST é a mesma do NTT (os mesmos tanques podem ser reutilizados diretamente).
    2. Siga os passos 2.1.1-2.1.6. para configurar o ST.
    3. Introduzir o cardume (6 a 9 indivíduos ao mesmo tempo) no fundo dos tanques experimentais antes de começar a gravar o mais rápido possível.
      OBS: É importante iniciar a gravação com o animal no fundo do tanque.
    4. Siga os passos 2.1.8-2.1.11. para realizar o TS.
    5. Repita o procedimento com todos os assuntos disponíveis. Para obter resultados significativos neste ensaio, faça pelo menos duas réplicas independentes com o mesmo tamanho de banco em cada réplica.
    6. Manter o tamanho do cardume consistente para todos os grupos experimentais e replicar dentro do mesmo experimento.
  3. Comportamento social individual: o Teste de Preferência Social (TCP)
    1. Ajustar o arranjo experimental para otimizar o espaço e o tempo experimentais de gravação.
    2. Preparar os tanques experimentais para SPT: Tanque quadrado (20 cm de comprimento, 20 cm de largura, 25 cm de altura) transparente (vidro ou plástico) para oferecer visibilidade lateral. O único peixe focal é livre para interagir com uma zona virtual conespecífica - um cardume de peixe colocado no tanque de alojamento externo unilateral, ou com a zona virtual inespecífica - um tanque de alojamento vazio externo unilateral.
    3. Encher os tanques experimentais com 5 L (altura da coluna de água: 15 cm, mesma altura da coluna de água nos tanques de alojamento externos) de água limpa para peixes a 28 °C.
    4. Ajuste a posição do tanque na frente da câmera para evitar imagens distorcidas.
    5. Verifique se o sistema recebe iluminação homogênea.
    6. Introduzir os sujeitos, um a um, no fundo dos tanques experimentais antes de iniciar imediatamente a gravação com o animal no centro.
    7. Evitar interações visuais entre observadores e animais durante a gravação.
    8. Ao final dos 6 min de gravação, transfira os animais presentes para outro tanque para não misturá-los com os animais ingênuos.
    9. Repita o procedimento com todos os assuntos disponíveis. Ter um número total de 18 indivíduos por condição para obter resultados significativos em ensaios individuais (a partir de duas ou mais réplicas independentes).

3. Gravação de vídeo para testes comportamentais

  1. Abra o gerenciador de câmera para verificar a disponibilidade da câmera GigE em cada computador.
  2. Inicie o software de controle de câmera GigE (como o uEye Cockpit, descrito aqui). Abra a opção Câmera , selecione Modo monocromático e ajuste o tamanho da imagem (1:2).
  3. Abrir propriedades da câmera
    1. Em Câmera, defina o Pixel Clock como Máximo, defina a Taxa de quadros para 30 quadros por segundo (fps) e ajuste a Exposição (ajuste automático ou manual se a imagem estiver muito escura).
    2. Em Imagem, defina o Ganho como 0 (Auto) e os Níveis de Preto (ajuste Automático ou Manual para obter um bom contraste).
    3. Em Tamanho, ajuste o tamanho da janela para a região que precisa ser gravada (Largura: Largura-Esquerda, Altura: Altura-Superior). Esta etapa permite reduzir o tamanho da imagem e, portanto, o tamanho final do vídeo.
    4. Feche as Propriedades da câmera.
  4. Crie uma pasta geral para a sessão de experimento para salvar as configurações e os vídeos da câmera.
  5. Para salvar as configurações da câmera, defina Arquivo > Salvar parâmetros > Arquivo para arquivo e selecione a pasta de experimento criada recentemente.
    NOTA: O arquivo de configurações da câmera pode, portanto, ser recarregado no aplicativo para continuar trabalhando com os mesmos parâmetros de imagem a qualquer momento (por exemplo, quando a câmera é repentinamente desligada ou para reutilizar as mesmas configurações, reduzindo o tempo de configuração e homogeneizando as condições experimentais). Se, em um momento, a câmera congelar entre os vídeos, pare de gravar, saia e desligue a câmera. Ligue-o novamente, recarregue os parâmetros da câmera indo para Arquivo > Carregar parâmetros > para arquivo e reinicie a gravação. Verifique se o vídeo atual foi completamente adquirido para descartar ou repetir o peixe (antes de repetir, dê aos animais algum tempo para se reaclimatarem).
  6. Repita este procedimento de configuração da câmera (etapas 3.1-3.5) em todas as câmeras.
  7. Quando todas as câmeras estiverem configuradas corretamente, abra Gravar sequência de vídeo.
  8. Selecione Criar para salvar como um novo arquivo de vídeo, selecione a pasta de experimento criada recentemente e relate no nome do arquivo de vídeo as informações do assunto, o tipo de experimento e a data.
  9. Selecione Quadros máximos. Digite 10800 na caixa de quadro. O vídeo padrão é a gravação de 6 min (Vídeo 1) a 30 fps no formato AVI; portanto, 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 quadros no total.
  10. Selecione Taxa de quadros ou indique a taxa de quadros manualmente (velocidade de gravação: 30 fps).
  11. Repita o procedimento de criação do arquivo de vídeo em todos os computadores.
  12. Introduzir os sujeitos, um a um, no fundo de cada tanque experimental. Todos os ensaios serão executados de uma só vez.
  13. Inicie os registros rapidamente clicando em Gravar e aguarde para obter o número máximo de quadros solicitados (passo 3.10).
  14. Depois que os vídeos são gravados, uma caixa de bate-papo aparece com a mensagem Número máximo de quadros alcançado!. Selecione Aceitar.
  15. Selecione Fechar para concluir a gravação e fechar o arquivo de vídeo.
  16. Retire os peixes que acabaram de ser observados. Tenha cuidado para separá-los dos peixes ingênuos.
  17. Selecione diretamente Criar e repita o processo para continuar a gravar vídeos.
  18. Quando todas as gravações estiverem concluídas, selecione Sair.
  19. Para desligar as câmeras, selecione Fechar câmera e Sair do programa.

4. Análise de vídeos gravados

  1. Inicie o software de análise (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Para elaborar um novo modelo, clique em Novo do modelo > Aplicado um modelo predefinido > do arquivo de vídeo e selecione um vídeo para começar a configurar o modelo. Tente escolher um vídeo representativo do experimento com um sujeito que apresente boa mobilidade e boas condições de gravação.
  3. Em Parâmetros, configure os parâmetros nas seguintes janelas (1 a 4/7). Selecione o modelo Fish > Adult Zebrafish, a arena Open Field Square > One Arena, o número de Subject per Arena (para o ST, um pacote de rastreamento múltiplo [rastrear vários assuntos em uma arena] é necessário), o tipo de Detecção por Ponto Central e, finalmente, ajustar a taxa de quadros para 30 fps. Nas seguintes janelas (5 a 7/7), não altere parâmetros; a configuração padrão é OK.
  4. Nomeie o experimento como um modelo e coloque-o na mesma pasta que o restante do vídeo armazenado. O modelo será criado como uma pasta de experimento com várias subdivisões contendo todas as informações de configuração.
  5. Em Configurações de experimento, verifique a configuração definida (do arquivo de vídeo, arena, número de assuntos, quadro por segundo). Aqui, as unidades do sistema podem ser modificadas.
  6. Em Configurações da arena, clique com o botão direito do mouse no centro da tela e selecione Agarrar. De Arquivo na exibição. Escolha uma imagem de vídeo de boa qualidade e Aceitar para capturar esta imagem para as configurações de fundo. Primeiro, Calibre a imagem, gerando uma régua calibrada. Use a largura do tanque como uma balança (19 cm). Em seguida, sorteie a arena. Tenha o cuidado de tornar o quadrado apenas o suficiente para evitar os reflexos do animal quando este se aproximar da superfície ou qualquer eventual confusão do software do peixe com as áreas pretas do tanque. Finalmente, desenhe as zonas de forma com a função Frame .
    1. Para NTT e ST, divida a frente do tanque em duas zonas virtuais iguais, superior e inferior (consulte a Figura 1). Desenhe duas caixas horizontais iguais. As caixas cobrem metade de uma arena para cada uma. Nomeie a parte superior e inferior para as zonas superior e inferior, respectivamente. Tenha cuidado para que as caixas tenham a mesma largura (9-10 cm) e comprimento (8-9 cm), não excedam os limites da arena (quadrado laranja) e não se sobreponham, verificando se cada zona de seta indica exatamente suas zonas.
    2. Para o TCP, divida conceitualmente a arena experimental em três zonas de tamanho igual: vazia, central e conespecífica (ver Figura 1). Desenhe três caixas verticais iguais. Nomeie a caixa orientada para o tanque de cardume como Conespecífica, a caixa orientada para o tanque vazio como Vazia e a do meio como Centro. Tenha cuidado para que as caixas tenham a mesma largura (6 cm) e comprimento (18-19 cm), não excedam os limites da arena e não se sobreponham.
  7. Em Configurações de Detecção, verifique qual vídeo será tratado no Arquivo de Vídeo. Em seguida, verifique a qualidade da detecção (peixes em amarelo, ponto central vermelho). Clique em Auto Detect para ajustar a detecção, refocando o animal (escolha uma imagem que o animal está nadando de perfil no fundo branco, desenhe a foto tirando todo o seu corpo e valide a detecção com Sim). Abra o Advanced para melhorar a detecção selecionando Subtração dinâmica, Assunto mais escuro, Configurações de fundo, Aprendizado em segundo plano, Tamanho do assunto, Redução de ruído, etc.
  8. Em Configurações de Avaliações, coloque uma avaliação e exclua as outras (clique com o botão direito do mouse e exclua)
  9. Em Configurações de Dados, crie janelas de diálogo Resultados . Parametrizar resultados por hora e por zona. Por exemplo, crie uma janela Resultados para saída de dados por minutos e outra para saída de dados por tempo total (6 min). Solicite a saída de dados para cada zona (solicite-a se a distância em cada zona for necessária). Vincule as diferentes janelas Resultados à janela Iniciar com setas.
  10. Em Analisar configurações, selecione os parâmetros a serem analisados e o tipo de estatísticas para cada parâmetro. Esses parâmetros serão calculados automaticamente com base nos dados adquiridos a partir do rastreamento.
    1. Para NTT e SPT, selecione as opções definidas abaixo:
      1. Selecione Distância Movimentada (selecione Total) para obter a distância percorrida na arena (cm) e a distância percorrida nas respectivas zonas (cm).
      2. Selecione Em Zonas (selecione Zonas, Frequência, Cumulativo e Latência para Primeiro) para ter o tempo gasto na(s) zona(s) e a latência para a primeira entrada na(s) zona(s).
      3. Selecione Transição de Zona (selecione Limite: 0 cm, Adicionar Zona 1 > Zona 2; Zona 2 > Zona 1, em quaisquer zonas, Frequência) para obter o número de entradas nas zonas.
      4. Selecione Mobility Sate (preencha High mobile acima de 70%, Immobile abaixo de 3%, mínimo de 150 frames e selecione frequency, cumulative, and latency to first) para ter a duração da(s) hipermobilidade(s), a duração do(s) congelamento(s).
        Observação : consulte a seção Discussão para obter mais detalhes sobre a aproximação do comportamento de congelamento usando a análise automatizada e o número e duração (s) de episódios de congelamento.
      5. Selecione Aceleração e Ângulo de Giro (selecione frequência e cumulativo) para avaliar a ocorrência de comportamentos complexos, como darting e errático (movimentos de aceleração rápida).
    2. Para o TS, além dos parâmetros exploratórios acima, selecione a opção Distância entre os sujeitos (selecione todos os sujeitos, média, máxima, mínima) para obter a distância média entre os peixes (cm), a distância média entre o vizinho mais próximo (cm) e a distância média entre o vizinho mais distante.
  11. O modelo está pronto para seu uso. Salve as últimas modificações e feche o modelo sem adquirir nenhum dado do vídeo (mantenha o arquivo do modelo; é leve e fácil de gerenciar e copiar). Se houver várias licenças de software, analise os vídeos do mesmo modelo copiado para cada computador.
  12. Para copiar e usar o modelo, há duas opções:
    1. Abra o arquivo de modelo com o software de análise de comportamento, vá para Arquivo > Salvar como para criar um novo arquivo idêntico.
    2. Na interface de boas-vindas, selecione Novo em Modelo > Aplicado um modelo personalizado > Do arquivo de vídeo (escolha modelo. Arquivo EthXV). Nomeie o novo experimento e selecione seu local. O software pode levar alguns minutos para copiar as informações do arquivo de modelo.
  13. Vá para Configurações da arena para reajustar o modelo se o vídeo foi gravado com uma câmera diferente (siga as etapas 4.6 e 4.7).
  14. Vá para Configurações de detecção ou Aquisição para verificar qual vídeo está selecionado e altere o arquivo de vídeo, se necessário.
  15. Em Aquisição, selecione DDS > Pronto para Iniciar. Pode levar alguns minutos para que o software processe o vídeo.
  16. Quando a aquisição estiver concluída, vá para o Editor de Faixas. Selecione aceleração x16 para ler o vídeo processado mais rápido e verificar se o rastreamento está correto.
    NOTA: Às vezes, pode haver "perdas" no rastreamento (devido a reflexos ou confusão do próprio software). Eles podem ser editados manualmente a partir desta parte, se forem poucos; caso contrário, é preferível reprocessar todo o experimento, melhorando a definição da tela e a detecção.
  17. Em Estatísticas, clique em Calcular > exportar dados. A exportação de dados está localizada diretamente na pasta do experimento.
  18. Em Visualização de Trilha ou Mapas de Calor, gere e exporte (clique com o botão direito do mouse, exporte imagem, selecione a pasta Exportar Arquivos do experimento para salvar esses dados com o relatório da planilha) imagens de rastreamento do animal.
  19. Vá para Arquivo para fechar o experimento ativo e repita esse procedimento para o próximo vídeo.

5. Análise estatística

  1. Analisar a normalidade (teste de Shapiro-Wilk) dos dados em cada grupo.
  2. Avaliar a homocedasticidade com o teste de Levene.
  3. Use ANOVA one-way seguida dos testes de comparações múltiplas de Dunnett e Tukey para testar diferenças entre os grupos quando os critérios de normalidade e homocedasticidade não puderem ser rejeitados.
  4. Utilizar o teste de Kruskal-Wallis seguido de comparação pareada com correção de Bonferroni para testar diferenças entre os grupos quando os critérios de normalidade e homocedasticidade são rejeitados.
  5. Plote os dados com software gráfico.

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Representative Results

Nesta seção, veremos algumas possíveis aplicações dessas ferramentas comportamentais na neurotoxicologia de peixes. Os resultados a seguir correspondem à caracterização dos efeitos agudos ou compulsivos da metanfetamina (METH), uma droga recreativa, e dos efeitos subcrônicos do glifosato, um dos principais herbicidas encontrados em ecossistemas aquáticos.

Caracterização de um modelo de neurotoxicidade da compulsão por metanfetamina em zebrafish adulto
Ao avaliar o efeito de 40 mg/L de METH sobre o NTT (Figura 3), o teste de Kruskal-Wallis confirmou que os animais expostos apresentaram geotaxia positiva, caracterizada por diminuição do tempo de exploração na zona superior do tanque experimental (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), bem como na distância percorrida nessa parte (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) e no número de visitas (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Observou-se também aumento significativo no tempo de latência que antecedeu a primeira visita à zona superior (H(2) = 17,264, P = 0,00018). É importante ressaltar que as diferenças observadas nos parâmetros medidos no NTT após a exposição ao METH são consistentes ao longo do tempo, como confirmado pela correção de Bonferroni (P > 0,8). Um efeito significativo do tempo de exposição foi encontrado para o comportamento de congelamento (H(2) = 13,120, P = 0,0014).

Figure 3
Figura 3: Comportamento semelhante à ansiedade avaliado no teste de tanque novo padrão de 6 minutos (NTT) de peixes-zebra adultos expostos a 40 mg/L de metanfetamina (METH) por 3 h e 48 h. Os dados de cada experimento foram normalizados para os valores de controle correspondentes. Os dados combinados são apresentados como um gráfico de dispersão com a mediana (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Teste de Kruskal Wallis com correção de Bonferroni para desfechos NTT. Dados de 2 experimentos independentes. Esse valor foi reproduzido com permissão de Bedrossiantz et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os movimentos de congelamento podem ser quantificados avaliando-se a frequência, latência, duração ou localização do congelamento. A melhor maneira de pontuá-los é, sem dúvida, o olhar de um observador experiente, o que é bastante trabalhoso e complexo, por isso tentamos uma alternativa automatizada usando o software EthoVision para detectar o comportamento de congelamento19. Verificou-se que o número, a latência e a duração das crises de congelamento calculados pelo software (Tabela 1A) correlacionam-se com boa acurácia com os episódios pontuados manualmente pelo observador (Tabela 1B). Considerando que os dois métodos são equivalentes em termos de resultados (P = 0,958, teste de Student), utilizamos a abordagem automatizada para avaliar o congelamento aqui. Após 3 h de exposição à metanfeta, o tempo de congelamento aumentou significativamente (P = 0,0012), enquanto nenhuma diferença foi encontrada com o controle após 48 h de exposição (P = 0,16). O METH não produziu nenhum efeito sobre movimentos erráticos em nenhum dos momentos.

Utilizamos dois paradigmas experimentais para avaliar os efeitos sobre o comportamento social após exposição aguda à metanfeta. O TS (Figura 4) revelou que a distância média e a distância mais distante entre os indivíduos foram significativamente maiores para os peixes tratados com METM (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12; H(2)=52,504, P = 3,97 x 10-12 para distâncias médias e mais distantes entre peixes, respectivamente), apontando para um fenótipo comportamental de isolamento social. Novamente, observamos que nenhum efeito de tempo foi encontrado usando o teste post hoc de Bonferroni (P > 0,5).

Figure 4
Figura 4: Comportamento social de peixes-zebra adultos expostos a 40 mg/L de metanfetamina (METH) por 3 h e 48 h. Resultados do Shoaling Test (TS), incluindo a média e as distâncias mais distantes entre peixes. Os dados combinados são apresentados como um gráfico de dispersão com a mediana (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Teste de Kruskal Wallis com correção de Bonferroni. Dados de 2 experimentos independentes. Esse valor foi reproduzido com permissão de Bedrossiantz et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No TCP (Figura 5), os peixes tratados apresentam diminuição significativa do tempo gasto e da distância percorrida na zona conespecífica (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 para tempo gasto e distância percorrida na zona conespecífica, respectivamente). Esses resultados reafirmam o fenótipo de isolamento social sugerido pelos resultados da ST. O teste post hoc Honest Significant Difference (HSD) de Tukey não descartou possíveis diferenças entre os dois tempos de análise (P > 0,5).

Figure 5
Figura 5: Comportamento social de peixes-zebra adultos expostos a 40 mg/L de metanfetamina (METH) por 3 h e 48 h. Os resultados do teste de preferência social (TCP) incluem o tempo e a distância dos peixes em cada uma das três zonas virtuais do tanque experimental: vazio, central e conespecífico. Os dados de cada experimento foram normalizados para os valores de controle correspondentes. Os dados combinados são apresentados como um gráfico de dispersão com a mediana (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Dunnett. Dados de 2 experimentos independentes. Esse valor foi reproduzido com permissão de Bedrossiantz et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Efeito comportamental da exposição subcrônica a níveis ambientais de glyphosate
A análise comportamental dos efeitos da exposição subcrônica a 3 μg/L de glifosato sobre o NTT (Figura 6) revela uma diminuição significativa no tempo gasto explorando o topo (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), na distância percorrida nessa parte (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) e no número de visitas (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Esses efeitos são característicos do comportamento positivo da geotaxis, assim como o efeito aumentado observado no tempo de latência que antecede a primeira visita ao topo do tanque (H(2) = 9,628, P = 0,008). A expressão dos comportamentos errático e de congelamento dos animais expostos também foi analisada no NTT. A duração (H(2) = 17,261, P = 0,025) e o número de episódios erráticos (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) foram significativamente aumentados pelo glifosato. Em contraste, não foram encontradas diferenças de congelamento com o controle (Qui-quadrado de Pearson(2) = 2,964, P = 0,253). Aplicadas a um contexto ecológico, as observações feitas no NTT sugerem que o glifosato pode diminuir significativamente o comportamento exploratório dos peixes, comprometendo sua capacidade de sobreviver na natureza.

Figure 6
Figura 6: Comportamento semelhante à ansiedade avaliado no teste de tanque novo padrão de 6 minutos (NTT) de peixes-zebra adultos expostos a 0,3 μg/L e 3 μg/L de glifosato por 2 semanas. Foram analisados parâmetros comportamentais, bem como uma charge do tanque experimental dividido em duas zonas virtuais iguais, superior e inferior. Dados reportados como gráfico de dispersão com mediana (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett (Distância total, Distância no topo, Tempo no topo, Transições para o topo, Crises erráticas, Frequência de alta mobilidade) ou Teste de Kruskal Wallis com correção de Bonferroni (Latência para o topo, Duração errática). Não foram encontradas diferenças (P > 0,05) na duração do congelamento e nas sessões de congelamento. Dados de 2-4 experimentos independentes. Esse valor foi reproduzido com permissão de Faria et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A escolarização, grupos não polarizados de conespecíficos que são mantidos unidos pela pressão social para se protegerem de predadores, é uma tendência natural de Danio rerio. A escola pode "apertar" ou "expandir" dependendo do nível de ansiedade ou medo dos animais, um efeito visual particular que é muito fácil de identificar experimentalmente (Figura 7). No experimento com glifosato, o teste do cardume revelou um aumento da ansiedade nos peixes expostos a 3 μg/L, refletido por um agrupamento do cardume e, portanto, uma diminuição significativa na distância média e na distância mais distante entre os indivíduos (F2,56 = 5,664, P = 0,006 e F2,56 = 7,413, P = 0,001, para as distâncias médias e mais distantes entre peixes, respectivamente) em relação ao controle.

Figure 7
Figura 7: Comportamento social de peixes-zebra adultos expostos a 0,3 μg/L e 3 μg/L de glifosato por 2 semanas. Dados apresentados como gráfico de dispersão com mediana (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Dunnett (Distância média entre peixes e distância mais distante) Dados de 2 a 4 experimentos independentes. Esse valor foi reproduzido com permissão de Faria et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Aproximação do comportamento de congelamento utilizando uma análise automatizada. Os dados relatados nesta tabela são provenientes da mesma gravação (Vídeo 1) analisada por dois métodos diferentes. (A) Aproximação do comportamento de congelamento por cálculo automatizado com o software EthoVision V13. A variável mobilidade é calculada a partir da mudança da área temática entre duas amostras, portanto depende da frequência de aquisição dessa área. Estabelecemos um limiar muito baixo de imobilidade (menos de 3% de mobilidade), bem como a taxa de amostragem para um tempo contínuo mínimo de 5 s (mais de 150 quadros). (B) Análise do comportamento de congelamento com o Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, software livre e de código aberto). BORIS é um software de registro de eventos para codificação de vídeo e observações ao vivo. Com o BORIS, o observador pode codificar o episódio de congelamento como um evento de estado, definindo os pontos de início e fim. Clique aqui para baixar esta tabela.

Vídeo 1: Controle de peixes no novo teste do tanque. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

Comportamentos característicos de ansiedade observados nas NTT têm sido positivamente correlacionados com os níveis de serotonina analisados em cérebros21. Por exemplo, após a exposição à paraclorofenilalanina (PCPA), um inibidor da biossíntese de 5-HT, os peixes exibiram geotáxis positivos, bem como diminuição dos níveis cerebrais de 5-HT22, resultados muito semelhantes aos obtidos com a metanfetamina. Portanto, a diminuição nos níveis de serotonina cerebral e a exibição de geotáxis positivos em peixes-zebra expostos à METH sugerem que o comportamento de ansiedade produzido pela droga é mediado pela via serotoninérgica. Curiosamente, um fenótipo comportamental semelhante, ou seja, um efeito ansiogênico sobre geotaxis, pode ser visto em zebrafish adultos expostos por 2 semanas a 0,3 3 μg/L e 3 μg/L, duas concentrações ambientalmente relevantes de glifosato. Um aumento nos geotáxis também foi relatado anteriormente para peixes-zebra adultos com o neurotóxico acrilamida 6,23. Em todos esses casos, esse fenótipo comportamental (aumento de geotáxis no NTT, característico de substância ansiogênica) foi associado à diminuição dos níveis de neurotransmissores monoaminérgicos. Portanto, o paradigma NTT combinado com a análise neuroquímica do cérebro fornece informações ecologicamente relevantes, comportamento exploratório e eficiência de forrageamento e conecta neurofenótipos comportamentais com modulações de neurotransmissores.

Por outro lado, um comprometimento dos comportamentos sociais em ambos os ensaios, ST e SPT, também foi observado em peixes tratados com METH. O resultado obtido neste estudo é consistente com vários estudos com ratos e macacos, onde a exposição aguda e crônica dos animais do estudo ao METH resulta em retraimentosocial24. Alterações de comportamento social associadas ao abuso de METH têm sido explicadas em humanos por prejuízos na função sócio-cognitiva24. Um efeito ansiogênico sobre o tamanho do cardume foi encontrado em zebrafish exposto por 2 semanas a 3 μg/L de glyphosate. Observamos uma fenocópia desse efeito em zebrafish expostos a 53 mg/L (0,75 mM) de acrilamida por 3 dias 6,23.

Os ensaios NTT, ST e SPT permitem determinar efetivamente os potenciais efeitos neurotóxicos25 de uma ampla gama de produtos químicos, como ilustrado pelo estudo de modelos de toxicidade aguda de metanfetamina e glifosato subcrônico em peixes-zebra adultos. O comportamento é, em toxicologia, um desfecho apical relevante, caracterizando os efeitos em nível de organismo de um produto químico para neurotoxicidade e pesquisa ambiental. Além de ser um desfecho subletal em condições de laboratório, mudanças de comportamentos, como o exploratório ou o social, podem ser deletérias por natureza. Além disso, a bateria de análise comportamental proposta é um método semi-automatizado de fácilimplementação11 e, portanto, muito eficiente se os ensaios forem conscientemente planejados (princípio da redução)26. A realização desses ensaios como uma bateria de teste usando um único tanque reduz o número de animais e o tempo experimental e a geração de resíduos.

A ordem dos ensaios na bateria é uma consideração importante se quisermos estudar o perfil de resposta de um indivíduo em cada ensaio. Para tanto, a realização dos ensaios individuais seguidos (ver Figura 2) permite manter o animal identificado e relacionar seu comportamento exploratório à sua preferência social. Além disso, as respostas comportamentais do animal podem estar relacionadas a outros dados biológicos, como seu perfil de neurotransmissores ou expressão gênica, caso os peixes sejam mantidos identificados até o ponto final da amostragem (Figura 2A).

Usualmente, a análise comportamental permite observar diferenças entre os grupos. Primeiro, as respostas individuais são calculadas com base no rastreamento de animais27 antes de agrupar os dados por grupo. Em seguida, as médias e a diferença de variância em relação ao grupo controle são comparadas para cada parâmetro comportamental calculado. Com a análise de cardumes12, é fundamental deixar muito claro que a unidade de variância é o grupo de peixes teste, e não os peixes individuais, pois o comportamento de cada peixe individual é influenciado pelos outros peixes do cardume. Essa é a forma utilizada na maioria dos artigos para o processamento de dadoscomportamentais28. No entanto, pode ser útil repensar a análise de parâmetros comportamentais não parâmetro por parâmetro, mas como uma resposta global por ensaio. Por exemplo, pode-se calcular a covariância de cada medida feita em um ensaio e relatá-la como uma maneira diferente de medir a mesma coisa: comportamento ansioso, exploratório ou gregário. Existem muitas maneiras de calcular e interpretar dados comportamentais28,29. Dependendo do número de condições, do tipo de exames e da aquisição das imagens (2D ou 3D)30,31, a análise pode ser completamente repensada para obter o melhor dos dados.

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Disclosures

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela "Agencia Estatal de Investigación" do Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (projeto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro de Excelência Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz foi apoiada por uma bolsa de doutoramento (PRE2018-083513) co-financiada pelo Governo espanhol e pelo Fundo Social Europeu (FSE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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