Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оценка нейротоксичности у взрослых Danio rerio с использованием батареи поведенческих тестов в одном аквариуме

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Здесь мы представляем комплексную батарею поведенческих тестов, включая новый аквариум, шолинг и тесты социальных предпочтений, для эффективного определения потенциального нейротоксического воздействия химических веществ (например, метамфетамина и глифосата) на взрослых рыбок данио, использующих один аквариум. Этот метод имеет отношение к нейротоксичности и экологическим исследованиям.

Abstract

Наличие невропатологических эффектов в течение многих лет являлось основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества. Однако в последние 50 лет активно исследуется влияние химических веществ на поведение модельных видов. Постепенно поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные результаты в настоящее время регулярно используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио предоставляют стандартизированные и надежные средства для изучения широкого спектра поведения, включая тревогу, социальное взаимодействие, обучение, память и зависимость. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио обычно включают в себя помещение рыб на экспериментальную арену, запись и анализ их поведения с помощью программного обеспечения для видеослежения. Рыбы могут подвергаться воздействию различных стимулов, а их поведение может быть количественно оценено с помощью различных показателей. Новый аквариумный тест является одним из наиболее принятых и широко используемых тестов для изучения тревожного поведения у рыб. Тесты на косяки и социальные предпочтения полезны при изучении социального поведения рыбок данио. Этот анализ особенно интересен, так как изучается поведение всего косяка. Эти анализы оказались высоковоспроизводимыми и чувствительными к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает их ценными инструментами для изучения нейронных цепей и молекулярных механизмов, лежащих в основе поведения. Кроме того, эти анализы могут быть использованы при скрининге лекарств для выявления соединений, которые могут быть потенциальными модуляторами поведения.

В этой работе мы покажем, как применять поведенческие инструменты в нейротоксикологии рыб, анализируя действие метамфетамина, рекреационного наркотика, и глифосата, загрязнителя окружающей среды. Результаты демонстрируют значительный вклад поведенческих анализов на взрослых рыбках данио-рерио в понимание нейротоксикологических эффектов загрязнителей окружающей среды и лекарств, а также дают представление о молекулярных механизмах, которые могут изменять функцию нейронов.

Introduction

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является популярным модельным видом позвоночных для экотоксикологии, разработки лекарств и фармакологических исследований безопасности. Его низкая стоимость, хорошо зарекомендовавший себя молекулярно-генетический инструментарий и сохранение ключевых физиологических процессов, участвующих в морфогенезе и поддержании нервной системы, делают рыбку данио-рерио идеальной животной моделью для исследований в области нейробиологии, включая нейроповеденческую токсикологию 1,2. Основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества до недавнего времени было наличие невропатологических эффектов. Однако в последнее время поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные исходы в настоящее время широко используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ 3,4. Более того, поведенческие конечные точки очень важны с экологической точки зрения, поскольку даже очень незначительные изменения в поведении рыб могут поставить под угрозу выживание животного в естественныхусловиях.

Одним из наиболее часто используемых поведенческих тестов в исследованиях взрослых рыбок данио является новый резервуарный тест (NTT), который измеряет тревожное поведение 6,7. В этом анализе рыбы подвергаются воздействию новизны (рыбы помещаются в незнакомый аквариум), мягкого аверсивного раздражителя и наблюдаются их поведенческие реакции. НТТ используется в основном для оценки базальной локомоторной активности, геотаксиса, замерзания и беспорядочных движений рыб. Неустойчивая8 характеризуется резкими изменениями направления (зигзагами) и повторяющимися эпизодами ускорений (рывок). Это тревожная реакция, которая обычно наблюдается до или после эпизодов замерзания. Поведение замерзания соответствует полному прекращению движений рыбы (за исключением оперкулярных и глазных движений) во время нахождения на дне аквариума, в отличие от неподвижности, вызванной седацией, которая вызывает гиполокомоцию, акинезию и погружение8. Замерзание обычно связано с высоким уровнем стресса и тревоги, а также является частью покорного поведения. Сложное поведение является отличным индикатором состояния беспокойства животных. Былопоказано, что НТТ чувствительна к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает ее ценным инструментом для изучения нейронной основы тревоги и связанных с ней расстройств.

Рыбки данио-рерио являются очень социальным видом, поэтому мы можем измерить широкий спектр социального поведения. Тест на мелководье (ST) и тест социальных предпочтений (SPT) являются наиболее часто используемыми тестами для оценки социального поведения10. ST измеряет склонность рыб группироватьсявместе 11 путем количественной оценки их пространственного поведения и моделей движения. ST полезен для изучения групповой динамики, лидерства, социального обучения и понимания социального поведения многих видов рыб12. SPT у взрослых рыбок данио-рерио был адаптирован из теста Кроули на социальную новизну для мышей13 и быстро стал популярным поведенческим тестом для изучения социального взаимодействия у этого модельноговида. Эти два теста также были адаптированы для использования в скрининговых тестах на наркотики и показали перспективность для выявления новых соединений, которые модулируют социальное поведение15,16.

В целом, поведенческие анализы у взрослых рыбок данио-рерио являются мощными инструментами, которые могут предоставить ценную информацию о механизмах поведения или нейрофенотипах активных соединенийи злоупотребляемых наркотиков. В этом протоколе подробно описывается, как реализовать эти поведенческие инструменты7 с базовыми материальными ресурсами и как применять их в анализах токсичности для характеристики эффектов широкого спектра нейроактивных соединений. Кроме того, мы увидим, что те же самые тесты могут быть применены для оценки нейроповеденческих эффектов острого воздействия нейроактивного соединения (метамфетамина), а также для характеристики этих эффектов после хронического воздействия концентраций пестицида (глифосата) в окружающей среде.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Строгое соблюдение этических норм гарантирует благополучие и надлежащее обращение с рыбками данио, используемыми для экспериментов. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (CID-CSIC). Протоколы и результаты, представленные ниже, выполнены в соответствии с лицензией, выданной местным самоуправлением (номер договора 11336).

1. Содержание животных для поведенческого тестирования

  1. Все тесты (представленные на рисунке 1) проводят в изолированной поведенческой комнате при температуре 27-28 °C с 10:00 до 17:00.
  2. Перед началом экспериментов промойте контрольную и подвергшуюся воздействию рыбе несколько раз в чистой рыбьей воде [очищенная обратным осмосом вода, содержащая 90 мг/л соли аквариумных систем, 0,58 мМ CaSO4·2H2O и 0,59 мМ NaHCO3] перед началом экспериментов, чтобы избежать возможного загрязнения экспериментального аквариума.
  3. Акклиматизируйте животных в комнате поведения за 1 ч до начала экспериментов.
  4. Удостоверьтесь, что животные (соотношение самцов и самок ≈50:50) экспериментально наивны и проводят все поведенческие тесты вслепую, когда наблюдатели не знают об экспериментальной группе.
  5. Чтобы получить значимые результаты в поведенческих анализах, необходимо иметь общее количество 18 испытуемых для каждого условия (n = 18), в идеале полученных между двумя или более независимыми экспериментами. Например, в отдельных тестах проанализируйте поведение 9 животных в каждом состоянии, в каждой реплике. В групповых тестах проанализируйте поведение косяка из 6-9 животных в каждом состоянии, в каждом повторении.
  6. Выполняйте все испытания в соответствии с подходом тестирования батареи (см. предложения по планированию на рисунке 2). Этически более подходящий, этот метод позволяет уменьшить количество животных, необходимых для исследования, соблюдая принцип сокращения 3R7.
  7. В большинстве случаев поведенческие анализы связаны с биологическими анализами, поэтому приносите животных в жертву в соответствии с рекомендациями по эвтаназии18 , прежде чем собирать и анализировать образцы (OMICs или химические вещества). Если конечная точка не является выборкой, восстановите контрольную группу в конце эксперимента. Повторно использовать контрольных животных в племенных или экспериментальных целях через несколько дней.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальные установки. Три конфигурации квадратного аквариума для изучения широкого спектра поведения взрослых рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Хронология эксперимента. Два предложения по планированию записи поведенческих анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Экспериментальные конфигурации танка

  1. Тревожное поведение: новый танковый тест (NTT)
    1. Отрегулируйте экспериментальную установку (количество резервуаров, камер и компьютеров) для одновременной регистрации максимального количества рыб. Индивидуальные поведенческие анализы отнимают много времени, поэтому оптимизируйте время, материал и пространство.
    2. Подготовьте экспериментальные резервуары для NTT: Квадратный резервуар (20 см в длину, 20 см в ширину, 25 см в высоту), покрытый акриловыми панелями на боковых стенках и дне, чтобы избежать отражения и интерференции между объектами.
    3. Наполните экспериментальные резервуары 7 л (высота водяного столба: высота 20 см) хорошо насыщенной кислородом воды для рыб при температуре 28 °C.
    4. Отрегулируйте положение резервуара перед камерой, чтобы избежать искажения изображения.
    5. Проверьте настройку освещения. Светодиодная подсветка (10000 люкс) обеспечивает равномерное освещение всей части резервуара для видеозаписи в хороших условиях.
    6. Включите камеры и отрегулируйте их в соответствии с разделом 3.
    7. Вводите испытуемых, одного за другим, на дно экспериментальных резервуаров, прежде чем начать запись как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать запись с животного, находящегося на дне аквариума.
    8. Следите за тем, чтобы не беспокоить животных во время записи. Использование шторы или панели для ограничения визуального взаимодействия не только между резервуарами, но и между опорой и внешней стороной.
    9. По окончании записи (стандартное время записи 6 минут) пересадите животных, которые уже прошли тест, в другой аквариум, чтобы не перепутать их с наивными животными.
    10. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Для получения значимых результатов в отдельных испытаниях (из двух или более независимых повторений) рекомендуется иметь в общей сложности 18 субъектов для каждого состояния.
    11. Рандомизируйте экспериментальную группу, назначенную каждому резервуару между испытаниями, чтобы избежать любых потенциальных эффектов для резервуара (если вы регистрируете несколько состояний одновременно).
  2. Социально-групповое поведение: Тест на мелководье (ST)
    1. Экспериментальная конфигурация ST такая же, как и у NTT (одни и те же баки могут быть использованы повторно напрямую).
    2. Выполните шаги 2.1.1-2.1.6. для настройки ST.
    3. Поместите косяк (от 6 до 9 испытуемых одновременно) на дно экспериментальных аквариумов, прежде чем начать запись как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать запись с животного, находящегося на дне аквариума.
    4. Выполните шаги 2.1.8-2.1.11. для выполнения ST.
    5. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Чтобы получить значимые результаты в этом анализе, сделайте по крайней мере две независимые репликации с одинаковым размером банка в каждой репликации.
    6. Поддерживайте размер косяка одинаковым для всех экспериментальных групп и репликаций внутри одного эксперимента.
  3. Социальное индивидуальное поведение: тест социальных предпочтений (SPT)
    1. Отрегулируйте экспериментальную установку, чтобы оптимизировать экспериментальное пространство и время записи.
    2. Подготовьте экспериментальные резервуары для SPT: Квадратный резервуар (20 см в длину, 20 см в ширину, 25 см в высоту), прозрачный (стеклянный или пластиковый) для обеспечения бокового обзора. Одиночная фокальная рыба может свободно взаимодействовать с конспецифической виртуальной зоной - косяком рыбы, помещенным в односторонний внешний аквариум, или с неспецифической виртуальной зоной - односторонним внешним пустым аквариумом.
    3. Наполните экспериментальные резервуары 5 л (высота водяного столба: 15 см, такая же высота, как и столб воды во внешних резервуарах) чистой воды для рыб при температуре 28 °C.
    4. Отрегулируйте положение резервуара перед камерой, чтобы избежать искажения изображения.
    5. Убедитесь, что система получает равномерное освещение.
    6. Введите испытуемых, одного за другим, на дно экспериментальных аквариумов, прежде чем сразу же начать запись с животным внизу в центре.
    7. Избегайте визуального взаимодействия между наблюдателями и животными во время записи.
    8. По окончании 6-минутной записи пересадите присутствующих животных в другой аквариум, чтобы не смешать их с наивными животными.
    9. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Иметь в общей сложности 18 субъектов для каждого состояния, чтобы получить значимые результаты в отдельных испытаниях (из двух или более независимых повторений).

3. Видеозапись для поведенческих тестов

  1. Откройте диспетчер камер, чтобы проверить доступность камеры GigE на каждом компьютере.
  2. Запустите программное обеспечение для управления камерой GigE (например, uEye Cockpit, описанное здесь). Откройте опцию «Камера », выберите «Монохромный режим» и отрегулируйте размер изображения (1:2).
  3. Откройте окно «Свойства камеры»
    1. В разделе «Камера» установите для параметра «Частота пикселей » значение «Максимум», установите частоту кадров на 30 кадров в секунду (fps) и отрегулируйте экспозицию («Авто » или «Ручная настройка», если изображение слишком темное).
    2. В разделе «Изображение» установите для параметра «Усиление » значение 0 (Авто) и для получения хорошего контраста значение « Уровни черного » («Авто» или «Ручная настройка»).
    3. В разделе «Размер» отрегулируйте размер окна в соответствии с областью, которую необходимо выгравировать («Ширина: Ширина-Влево», Высота: Высота-Сверху). Этот шаг позволяет уменьшить размер изображения и, следовательно, окончательный размер видео.
    4. Закройте окно Свойства камеры.
  4. Создайте общую папку для сеанса эксперимента, чтобы сохранить настройки камеры и видео.
  5. Чтобы сохранить настройки камеры, установите Файл > Сохранить параметры > В файл и выберите недавно созданную папку эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, файл настроек камеры может быть перезагружен в приложение, чтобы продолжить работу с теми же параметрами изображения в любое время (например, при внезапном выключении камеры или для повторного использования тех же настроек, сокращая время настройки и унифицируя условия эксперимента). Если в какой-то момент камера зависает между видео, остановите запись, выйдите и выключите камеру. Включите его снова, перезагрузите параметры камеры, перейдя в «Файл» > «Загрузить параметры» > «В файл», и перезапустите запись. Проверьте, полностью ли получено текущее видео, чтобы отбросить или повторить рыбу (перед повторением дайте животным некоторое время на реакклиматизацию).
  6. Повторите эту процедуру настройки камеры (шаги 3.1-3.5) на всех камерах.
  7. Когда все камеры будут правильно настроены, откройте функцию «Запись видеоряда».
  8. Нажмите кнопку Создать, чтобы сохранить его как новый видеофайл, выберите недавно созданную папку эксперимента и укажите в имени видеофайла сведения об объекте, типе эксперимента и дате.
  9. Выберите Максимальное количество кадров. Введите 10800 в рамной коробке. Стандартное видео - запись 6 минут (Видео 1) с частотой 30 кадров в секунду в формате AVI; Таким образом, 6 мин x 60 с x 30 кадров в секунду = всего 10800 кадров.
  10. Выберите Calc. Frame Rate (Расчет частоты кадров) или укажите частоту кадров вручную (скорость записи: 30 кадров в секунду).
  11. Повторите процедуру создания видеофайла на всех компьютерах.
  12. Представьте испытуемых, одного за другим, на дне каждого экспериментального аквариума. Все анализы будут проведены одновременно.
  13. Быстро запустите записи, нажав на кнопку «Запись », и подождите, пока не будет получено максимальное количество запрошенных кадров (шаг 3.10).
  14. После того, как видео будет записано, появится окно чата с сообщением Достигнуто максимальное количество кадров!. Выберите Принять.
  15. Нажмите кнопку Закрыть, чтобы завершить запись и закрыть видеофайл.
  16. Удалите рыбок, которые только что были замечены. Будьте осторожны, чтобы отделить их от наивных рыбок.
  17. Выберите Создать и повторите процесс, чтобы продолжить запись видео.
  18. Когда все записи будут завершены, выберите Выйти.
  19. Чтобы выключить камеры, выберите «Закрыть камеру » и «Выйти из программы».

4. Анализ записанных видео

  1. Запустите программное обеспечение для анализа (см. Таблицу материалов).
  2. Чтобы подробнее рассказать о новом шаблоне, нажмите « Создать из шаблона» > «Применить предопределенный шаблон» > «Из видеофайла» и выберите видео, чтобы начать настройку шаблона. Постарайтесь выбрать репрезентативное видео эксперимента с испытуемым, демонстрирующим хорошую подвижность и хорошие условия записи.
  3. В разделе Параметры настройте параметры в следующих окнах (от 1 до 4/7). Выберите модель Fish > Adult Zebrafish, арену Open Field Square > One Arena, количество объектов на арене (для ST требуется пакет мультитрекинга [отслеживание различных объектов на одной арене]) тип Detection by Center-Point и, наконец, отрегулируйте частоту кадров до 30 кадров в секунду. В следующих окнах (от 5 до 7/7) не изменяйте параметры; Конфигурация по умолчанию — ОК.
  4. Назовите эксперимент шаблоном и поместите его в ту же папку, что и остальное сохраненное видео. Шаблон будет создан в виде папки эксперимента с несколькими подразделениями, содержащими всю информацию о настройке.
  5. В разделе «Настройки эксперимента» проверьте заданные настройки (видеофайл, арена, количество испытуемых, кадр в секунду). Здесь можно модифицировать системные блоки.
  6. В разделе «Настройки арены» щелкните правой кнопкой мыши по центру экрана и выберите «Захват». Из файла на дисплее. Выберите видеоизображение хорошего качества и нажмите кнопку Принять , чтобы захватить это изображение для настроек фона. Сначала откалибруйте изображение, создав откалиброванное правило. В качестве шкалы используйте ширину емкости (19 см). Затем нарисуйте арену. Будьте осторожны, чтобы сделать квадрат ровно настолько, чтобы избежать отражений животного, когда оно приближается к поверхности, или любой возможной путаницы между программным обеспечением рыб и черными областями аквариума. Наконец, нарисуйте зоны фигуры с помощью функции Рамка .
    1. Для NTT и ST разделите переднюю часть резервуара на две равные виртуальные зоны: верхнюю и нижнюю (см. рис. 1). Нарисуйте две равные горизонтальные рамки. Боксы покрывают половину арены для каждого из них. Назовите Верхнюю и Нижнюю зоны для верхней и нижней зон соответственно. Следите за тем, чтобы коробки имели одинаковую ширину (9-10 см) и длину (8-9 см), не выходили за границы арены (оранжевый квадрат) и не перекрывали друг друга, проверяя, чтобы каждая стрелка зоны точно указывала на свои зоны.
    2. Для SPT концептуально разделите экспериментальную арену на три равные по размеру зоны: пустую, центральную и конспецифическую (см. рис. 1). Нарисуйте три одинаковых вертикальных прямоугольника. Коробку, ориентированную на мелководный аквариум, назовите Conspecific, коробку, ориентированную на пустой аквариум, как Empty, а среднюю — Center. Следите за тем, чтобы боксы имели одинаковую ширину (6 см) и длину (18-19 см), не выходили за пределы манежа и не перекрывали друг друга.
  7. В разделе «Настройки обнаружения» укажите, с каким видео будет работать в видеофайле. Затем проверьте качество обнаружения (рыба желтого цвета, красная центральная точка). Нажмите « Автоопределение », чтобы настроить обнаружение, перефокусировав животное (выберите изображение, на котором животное плавает в профиль на белом фоне, нарисуйте картинку, взяв все его тело, и подтвердите обнаружение нажатием «Да»). Откройте «Дополнительно», чтобы улучшить обнаружение, выбрав «Динамическое вычитание», «Темный объект», «Настройки фона», «Фоновое обучение», «Размер объекта», «Шумоподавление» и т. д.
  8. В разделе «Настройки пробных версий» поместите одну пробную версию и удалите другие (щелкните правой кнопкой мыши и удалите).
  9. В разделе "Параметры данных" создайте диалоговые окна "Результаты ". Параметризация результатов по времени и по зонам. Например, создайте одно окно Результаты для вывода данных по минутам, а другое — для вывода данных по общему времени (6 минут). Запросите вывод данных для каждой зоны (запросите его, если требуется расстояние в каждой зоне). Свяжите различные окна результатов с начальным окном с помощью стрелок.
  10. В разделе "Параметры анализа" выберите параметры для анализа и тип статистики для каждого параметра. Эти параметры будут автоматически рассчитаны на основе данных, полученных в результате отслеживания.
    1. Для NTT и SPT выберите параметры, как определено ниже:
      1. Выберите «Перемещенное расстояние» (выберите «Общее»), чтобы получить расстояние, пройденное на арене (см) и расстояние, пройденное в соответствующих зонах (см).
      2. Выберите «В зонах» (выберите «Зоны», «Частота», «Кумулятивный» и «Задержка до первой»), чтобы получить время, проведенное в зонах (зонах), и задержку до первого входа в зону (зоны).
      3. Выберите "Переход зоны" (выберите "Пороговое значение: 0 см", "Добавить зону 1" > "Зону 2"; Зона 2 > Зона 1, в любых зонах, Частота) для получения количества входов в зонах.
      4. Выберите Mobility Sate (Состояние мобильности) (заполните поля High mobile выше 70%, Immobile ниже 3%, минимум 150 кадров и выберите частоту, кумулятивность и задержку до первого), чтобы получить продолжительность гипермобильности (s), продолжительность замораживания (s).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите раздел «Обсуждение» для получения более подробной информации об аппроксимации поведения замораживания с помощью автоматизированного анализа, а также о количестве и продолжительности эпизодов замораживания.
      5. Выберите «Ускорение и угол поворота» (выберите частоту и кумулятивный), чтобы оценить возникновение сложных поведений, таких как рывки и беспорядочные (движения с быстрым ускорением).
    2. Для ST, в дополнение к вышеуказанным исследовательским параметрам, выберите опцию Distance Between Subjects (выделите все объекты, среднее, максимальное, минимальное), чтобы получить среднее расстояние между рыбами (см), среднее расстояние между ближайшим соседом (см) и среднее расстояние между самым дальним соседом.
  11. Шаблон готов к использованию. Сохраните последние изменения и закройте шаблон, не получая никаких данных из видео (поддерживайте файл шаблона; он легкий и простой в управлении и копировании). Если лицензий на программное обеспечение несколько, проанализируйте видео из одного шаблона, скопированные на каждый компьютер.
  12. Скопировать и использовать шаблон можно двумя способами:
    1. Откройте файл шаблона с помощью программного обеспечения для анализа поведения, перейдите в Файл > Сохранить как , чтобы создать новый идентичный файл.
    2. В интерфейсе приветствия выберите «Создать из шаблона» > «Применить пользовательский шаблон» > «Из видеофайла» (выберите «Шаблон. EthXV). Присвойте новому эксперименту имя и выберите его расположение. Программному обеспечению может потребоваться несколько минут, чтобы скопировать информацию из файла шаблона.
  13. Перейдите в «Настройки арены », чтобы повторно настроить шаблон, если видео было записано другой камерой (выполните шаги 4.6 и 4.7).
  14. Перейдите в раздел «Настройки обнаружения» или «Сбор», чтобы проверить, какое видео выбрано, и при необходимости измените видеофайл.
  15. В разделе Acquisition (Приобретение) выберите DDS > Ready to Start (Готово к запуску). Программное обеспечение может обработать видео в течение нескольких минут.
  16. Когда сбор данных будет завершен, перейдите в редактор треков. Выберите ускорение x16, чтобы быстрее прочитать обработанное видео и проверить правильность отслеживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда могут быть «потери» в отслеживании (из-за отражений или путаницы в самом программном обеспечении). Их можно отредактировать вручную из этой части, если их немного; В противном случае предпочтительнее повторно обработать весь эксперимент, улучшив определение холста и обнаружение.
  17. В разделе «Статистика» нажмите «Вычислить > экспортировать данные». Экспорт данных находится непосредственно в папке эксперимента.
  18. В разделе «Визуализация отслеживания » или «Тепловые карты» создайте и экспортируйте (щелкните правой кнопкой мыши, экспортируйте изображение, выберите папку «Файлы экспорта » эксперимента, чтобы сохранить эти данные с отчетом по электронной таблице) изображения отслеживания животного.
  19. Перейдите в раздел Файл, чтобы закрыть активный эксперимент, и повторите эту процедуру для следующего видео.

5. Статистический анализ

  1. Проанализируйте нормальность (критерий Шапиро-Уилка) данных в каждой группе.
  2. Оценивают гомоскедастичность с помощью критерия Левена.
  3. Используйте одностороннюю дисперсию, а затем множественные сравнительные тесты Даннета и Тьюки для проверки различий между группами, когда критерии нормальности и гомоскедастичности не могут быть отвергнуты.
  4. Используйте критерий Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с использованием поправки Бонферрони для проверки различий между группами, когда критерии нормальности и гомоскедастичности отвергаются.
  5. Построение графиков данных с помощью графического программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе мы рассмотрим некоторые возможные применения этих поведенческих инструментов в нейротоксикологии рыб. Следующие результаты соответствуют характеристике острых или запойных эффектов метамфетамина (МЕТАМ), рекреационного наркотика, и субхронических эффектов глифосата, одного из основных гербицидов, обнаруженных в водных экосистемах.

Характеристика модели нейротоксичности метамфетамина у взрослых рыбок данио-рерио
При оценке влияния 40 мг/л метамфетамина на НТТ (рис. 3) тест Краскела-Уоллиса подтвердил, что облученные животные представляли положительный геотаксис, характеризующийся уменьшением времени разведки в верхней зоне экспериментального резервуара (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), а также в пройденном в этой части расстоянии (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) и по количеству посещений (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Также отмечено достоверное увеличение латентного времени, предшествующего первому посещению верхней зоны (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Важно отметить, что различия, наблюдаемые в параметрах, измеренных в НТТ после воздействия метамфетамина, остаются неизменными во времени, что подтверждается поправкой Бонферрони (P > 0,8). Обнаружено значимое влияние времени экспозиции на поведение замораживания (H(2) = 13,120, P = 0,0014).

Figure 3
Рисунок 3: Тревожное поведение, оцененное в стандартном 6-минутном тесте (NTT) взрослых рыбок данио, подвергшихся воздействию метамфетамина (МЕТАМФЕТАМИНА) в дозе 40 мг/л в течение 3 ч и 48 ч. Данные каждого эксперимента были нормализованы к соответствующим контрольным значениям. Объединенные данные представлены в виде точечной диаграммы с медианой (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Критерий Краскела-Уоллиса с поправкой Бонферрони для конечных точек NTT. Данные 2-х независимых экспериментов. Эта цифра воспроизведена с разрешения Bedrossiantz et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Движения замораживания могут быть количественно оценены путем оценки частоты, задержки, продолжительности или места замораживания. Лучший способ оценить их, несомненно, является глазом опытного наблюдателя, что довольно трудоемко и сложно, поэтому мы попробовали автоматизированную альтернативу с использованием программного обеспечения EthoVision для обнаружения поведения замирания19. Мы обнаружили, что количество, задержка и продолжительность атак замораживания, рассчитанные программным обеспечением (табл. 1А), с хорошей точностью коррелируют с эпизодами, оцененными наблюдателем вручную (табл. 1Б). В то время как эти два метода эквивалентны по результатам (P = 0,958, тест Стьюдента), мы использовали автоматизированный подход для оценки замораживания. После 3 ч воздействия метамфетамина время замораживания значительно увеличилось (P = 0,0012), в то время как в контроле после 48 ч воздействия не было обнаружено различий (P = 0,16). Метамфетамин не оказывал никакого влияния на беспорядочные движения ни в том, ни в другое время.

Мы использовали две экспериментальные парадигмы для оценки влияния на социальное поведение после острого воздействия метамфетамина. ST (рис. 4) показал, что среднее расстояние и максимальное расстояние между особями были значительно больше для рыб, обработанных метамфетамином (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12; H(2)=52,504, P = 3,97 x 10-12 для средних и самых дальних межрыбных расстояний соответственно), что указывает на поведенческий фенотип социальной изоляции. Опять же, мы отмечаем, что с помощью критерия Бонферрони post hoc не было обнаружено никакого временного эффекта (P > 0,5).

Figure 4
Рисунок 4: Социальное поведение взрослых рыбок данио, находящихся в воде, подвергающихся воздействию метамфетамина (МЕТАМФЕТАМИНА) в дозе 40 мг/л в течение 3 ч и 48 ч. Результаты испытаний на мелководье (ST), включая средние и самые дальние расстояния между рыбами. Объединенные данные представлены в виде точечной диаграммы с медианой (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Критерий Краскела-Уоллиса с коррекцией Бонферрони. Данные 2-х независимых экспериментов. Эта цифра воспроизведена с разрешения Bedrossiantz et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

В СПТ (рис. 5) у обработанных рыб отмечается достоверное снижение времени и пройденного расстояния в конспецифической зоне (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 для затраченного времени и пройденного расстояния в конспецифической зоне соответственно). Эти результаты подтверждают фенотип социальной изоляции, предложенный результатами ТС. Тест Тьюки «Честная значимая разница» (HSD) post hoc исключил отсутствие возможных различий между двумя временами анализа (P > 0,5).

Figure 5
Рисунок 5: Социальное поведение взрослых рыбок данио, находящихся в воде, подвергающихся воздействию 40 мг/л метамфетамина (МЕТАМФЕТАМИНА) в течение 3 ч и 48 ч. Результаты теста социальных предпочтений (SPT), включающие время и расстояние между рыбами в каждой из трех виртуальных зон экспериментального аквариума: пустой, центральной и конспецифичной. Данные каждого эксперимента были нормализованы к соответствующим контрольным значениям. Объединенные данные представлены в виде точечной диаграммы с медианой (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; односторонний ANOVA с тестом множественного сравнения Даннета. Данные 2-х независимых экспериментов. Эта цифра воспроизведена с разрешения Bedrossiantz et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Поведенческий эффект субхронического воздействия глифосата в окружающей среде
Поведенческий анализ влияния субхронического воздействия глифосата 3 мкг/л на НТТ (рис. 6) показывает значительное снижение времени, затрачиваемого на изучение вершины (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), расстояния, пройденного в этой части (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) и количества посещений (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Эти эффекты характерны для позитивного поведения геотаксиса, так же как и повышенное влияние, наблюдаемое на латентное время, предшествующее первому посещению верхней части резервуара (H(2) = 9,628, P = 0,008). Выражение неустойчивого и замирающего поведения подвергшихся воздействию животных также было проанализировано в НТТ. Длительность (H(2) = 17,261, P = 0,025) и количество неустойчивых эпизодов (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) были значительно увеличены глифосатом. Напротив, в контрольной группе не было обнаружено различий в замораживании (хи-квадрат Пирсона (2) = 2,964, P = 0,253). Применительно к экологическому контексту, наблюдения, сделанные в NTT, показывают, что глифосат может значительно снизить исследовательское поведение рыб, ставя под угрозу их способность выживать в дикой природе.

Figure 6
Рисунок 6: Тревожное поведение, оцененное в стандартном 6-минутном тесте (NTT) взрослых рыбок данио, подвергавшихся воздействию глифосата в дозах 0,3 мкг/л и 3 мкг/л глифосата в течение 2 недель. Анализируются поведенческие параметры, а также мультфильм экспериментального танка, разделенного на две равные виртуальные зоны, верхнюю и нижнюю. Данные представлены в виде точечной диаграммы с медианой (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; односторонний ANOVA с тестом множественного сравнения Даннета (Общее расстояние, Расстояние в топе, Время в топе, Переходы наверх, Беспорядочные схватки, Высокая частота подвижности) или Тест Краскела-Уоллиса с поправкой Бонферрони (Задержка до вершины, Неустойчивая длительность). Различий (P > 0,05) в продолжительности замораживания и замораживании не выявлено. Данные 2-4 независимых экспериментов. Эта цифра воспроизведена с разрешения Faria et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Стайные, неполяризованные группы сородичей, которые удерживаются вместе социальным давлением, чтобы защитить себя от хищников, являются естественной тенденцией Danio rerio. Косяк может «подтягиваться» или «расширяться» в зависимости от уровня беспокойства или страха животных, что является специфическим визуальным эффектом, который очень легко определить экспериментально (рис. 7). В эксперименте с глифосатом тест на косяк выявил увеличение беспокойства у рыб, подвергшихся воздействию 3 мкг/л, что отражалось в группировке косяка и, таким образом, в значительном уменьшении среднего расстояния и наибольшего расстояния между особями (F2,56 = 5,664, P = 0,006 и F2,56 = 7,413, P = 0,001, для среднего и самого дальнего расстояния между рыбами, соответственно) по сравнению с контролем.

Figure 7
Рисунок 7: Социальное поведение взрослых рыбок данио-рерио, находящихся в воде, подвергающихся воздействию 0,3 мкг/л и 3 мкг/л глифосата в течение 2 недель. Данные представлены в виде точечной диаграммы с медианой (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; односторонний ANOVA с тестом множественного сравнения Даннетта (Среднее расстояние между рыбами и Дальнее расстояние) Данные от 2 до 4 независимых экспериментов. Эта цифра воспроизведена с разрешения Faria et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Аппроксимация поведения при замораживании с помощью автоматизированного анализа. Данные, приведенные в этой таблице, получены из одной и той же записи (видео 1), проанализированной двумя разными методами. (A) Аппроксимация поведения при замораживании путем автоматического расчета с помощью программного обеспечения EthoVision V13. Переменная подвижность рассчитывается из изменения предметной области между двумя образцами, поэтому она зависит от частоты захвата этой области. Мы установили очень низкий порог неподвижности (менее 3% подвижности), а также частоту дискретизации на минимальное время непрерывной работы 5 с (более 150 кадров). (B) Анализ поведения при замораживании с помощью интерактивного программного обеспечения Behavioral Observation Research (BORIS, бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом). BORIS - это программное обеспечение для регистрации событий для кодирования видео и наблюдений в реальном времени. С помощью BORIS наблюдатель может закодировать эпизод замораживания как событие состояния, определив начальную и конечную точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Видео 1: Контрольная рыба в новом аквариумном тесте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Характерное тревожное поведение, наблюдаемое при НТТ, положительно коррелировало с уровнями серотонина, проанализированными в мозге21. Например, после воздействия парахлорфенилаланина (PCPA), ингибитора биосинтеза 5-НТ, у рыб наблюдался положительный геотаксис, а также снижение уровня 5-НТ в мозге22, результаты, очень похожие на те, которые были получены при приеме метамфетамина. Таким образом, снижение уровня серотонина в головном мозге и проявление положительного геотаксиса у рыбок данио, подвергшихся воздействию метамфетамина, говорит о том, что тревожное поведение, вызванное препаратом, опосредовано серотонинергическим путем. Интересно, что аналогичный поведенческий фенотип, т.е. анксиогенный эффект на геотаксис, можно наблюдать у взрослых рыбок данио, подвергающихся в течение 2 недель воздействию 0,3-3 мкг/л и 3 мкг/л, двух экологически значимых концентраций глифосата. Ранее также сообщалось об увеличении геотаксиса для взрослых рыбок данио-рерио с нейротоксикантом акриламидом 6,23. Во всех этих случаях этот поведенческий фенотип (увеличение геотаксиса в НТТ, характерный для анксиогенного вещества) ассоциировался со снижением уровня моноаминергических нейромедиаторов. Таким образом, парадигма НТТ в сочетании с нейрохимическим анализом мозга обеспечивает экологически релевантную информацию, исследовательское поведение и эффективность поиска пищи, а также связывает поведенческие нейрофенотипы с модуляциями нейротрансмиттеров.

С другой стороны, нарушение социального поведения в обоих тестах, ST и SPT, также наблюдалось у рыб, получавших метамфетамин. Результат, полученный в этом исследовании, согласуется с несколькими исследованиями на крысах и обезьянах, где острое и хроническое воздействие метамфетамина на исследуемых животных приводит ксоциальной изоляции. Изменения в социальном поведении, связанные со злоупотреблением метамфетамином, объясняются у людей нарушениями социально-когнитивных функций24. Анксиогенный эффект на размер косяка был обнаружен у рыбок данио, подвергавшихся в течение 2 недель воздействию глифосата в дозе 3 мкг/л. Мы наблюдали фенокопию этого эффекта у рыбок данио, подвергавшихся воздействию акриламида в дозе 53 мг/л (0,75 мМ) в течение 3 дней 6,23.

Анализы NTT, ST и SPT позволяют эффективно определять потенциальные нейротоксические эффектыширокого спектра химических веществ, что проиллюстрировано исследованием моделей острой токсичности метамфетамина и субхронического глифосата у взрослых рыбок данио. В токсикологии поведение является релевантной апикальной конечной точкой, характеризующей воздействие химического вещества на организменном уровне на нейротоксичность и экологические исследования. Помимо того, что это сублетальная конечная точка в лабораторных условиях, изменения в поведении, такие как исследовательское или социальное поведение, могут быть вредными по своей природе. Кроме того, предлагаемая батарея поведенческого анализа представляет собой простой в реализации, полуавтоматическийметод11 и, следовательно, очень эффективный, если анализы сознательно спланированы (принцип редукции)26. Выполнение этих тестов в качестве тестовой батареи с использованием одного резервуара сокращает количество животных, а также время эксперимента и образование отходов.

Порядок анализов в батарее является важным фактором, если мы хотим изучить профиль ответа индивидуума в каждом испытании. С этой целью проведение индивидуальных анализов (см. рис. 2) позволяет идентифицировать животное и связать его исследовательское поведение с его социальными предпочтениями. Кроме того, поведенческие реакции животного могут быть связаны с другими биологическими данными, такими как профиль нейротрансмиттеров или экспрессия генов, если рыба была идентифицирована до конечной точки отбора проб (рис. 2А).

Обычно поведенческий анализ позволяет наблюдать различия между группами. Во-первых, индивидуальные ответы рассчитываются на основе отслеживанияживотных27, а затем объединяются данные по группам. Затем сравниваются средние значения и разница в дисперсии по отношению к контрольной группе для каждого рассчитанного поведенческого параметра. При анализе косяков12 очень важно четко понимать, что единицей дисперсии является группа подопытных рыб, а не отдельные рыбы, поскольку на поведение каждой отдельной рыбы влияют другие рыбы в косяке. Именно такой способ используется в большинстве работ для обработки поведенческих данных28. Тем не менее, было бы полезно переосмыслить анализ поведенческих параметров не по параметрам, а как общий ответ на каждое испытание. Например, можно вычислить ковариацию каждого измерения, проведенного в исследовании, и сообщить об этом как о другом способе измерения одного и того же: тревожного, исследовательского или стадного поведения. Существует множество способов вычисления и интерпретации поведенческих данных28,29. В зависимости от количества условий, типа испытаний и получения изображения (2D или 3D)30,31 анализ может быть полностью переосмыслен, чтобы получить максимальную отдачу от данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана "Agencia Estatal de Investigación" Министерства науки и инноваций Испании (проект PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Центром передового опыта Северо Очоа (CEX2018-000794-S). Джульетт Бедроссианц получила грант (PRE2018-083513), софинансируемый правительством Испании и Европейским социальным фондом (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 201 рыбки данио тестирование на нейротоксичность видеозапись исследовательский агрессивный социальное поведение приложения
Оценка нейротоксичности у взрослых <em>Danio rerio</em> с использованием батареи поведенческих тестов в одном аквариуме
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter