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Neuroscience

Evaluación de la Neurotoxicidad en Danio rerio Adulto mediante una Batería de Pruebas de Comportamiento en un Tanque Único

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Aquí, presentamos una batería integral de pruebas de comportamiento, que incluye el nuevo tanque, Shoaling y pruebas de preferencia social, para determinar de manera efectiva los posibles efectos neurotóxicos de los productos químicos (por ejemplo, metanfetamina y glifosato) en el pez cebra adulto utilizando un solo tanque. Este método es relevante para la neurotoxicidad y la investigación ambiental.

Abstract

La presencia de efectos neuropatológicos resultó ser, durante muchos años, el principal criterio de valoración para evaluar la neurotoxicidad de una sustancia química. Sin embargo, en los últimos 50 años, se han investigado activamente los efectos de los productos químicos en el comportamiento de las especies modelo. Progresivamente, los criterios de valoración conductuales se incorporaron a los protocolos de cribado neurotoxicológico, y estos resultados funcionales se utilizan ahora de forma rutinaria para identificar y determinar la posible neurotoxicidad de las sustancias químicas. Los ensayos conductuales en peces cebra adultos proporcionan un medio estandarizado y confiable para estudiar una amplia gama de comportamientos, incluida la ansiedad, la interacción social, el aprendizaje, la memoria y la adicción. Los ensayos de comportamiento en el pez cebra adulto suelen consistir en colocar a los peces en un campo experimental y registrar y analizar su comportamiento mediante un software de seguimiento de vídeo. Los peces pueden estar expuestos a diversos estímulos y su comportamiento se puede cuantificar utilizando una variedad de métricas. La nueva prueba de tanque es una de las pruebas más aceptadas y ampliamente utilizadas para estudiar el comportamiento similar a la ansiedad en los peces. Las pruebas de cardúmenes y preferencias sociales son útiles para estudiar el comportamiento social del pez cebra. Este ensayo es particularmente interesante ya que se estudia el comportamiento de todo el cardúmen. Estos ensayos han demostrado ser altamente reproducibles y sensibles a las manipulaciones farmacológicas y genéticas, lo que los convierte en herramientas valiosas para estudiar los circuitos neuronales y los mecanismos moleculares que subyacen al comportamiento. Además, estos ensayos se pueden utilizar en el cribado de fármacos para identificar compuestos que pueden ser posibles moduladores del comportamiento.

En este trabajo mostraremos cómo aplicar herramientas conductuales en neurotoxicología de peces, analizando el efecto de la metanfetamina, una droga recreativa, y el glifosato, un contaminante ambiental. Los resultados demuestran la contribución significativa de los ensayos conductuales en pez cebra adulto a la comprensión de los efectos neurotoxicológicos de los contaminantes ambientales y los fármacos, además de proporcionar información sobre los mecanismos moleculares que pueden alterar la función neuronal.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es una especie de vertebrado modelo popular para estudios de ecotoxicología, descubrimiento de fármacos y farmacología de seguridad. Su bajo costo, sus herramientas genéticas moleculares bien establecidas y la conservación de los procesos fisiológicos clave involucrados en la morfogénesis y el mantenimiento del sistema nervioso hacen del pez cebra un modelo animal ideal para la investigación en neurociencia, incluida la toxicología neuroconductual 1,2. El principal criterio de valoración para evaluar la neurotoxicidad de una sustancia química era, hasta hace poco, la presencia de efectos neuropatológicos. Últimamente, sin embargo, los criterios de valoración conductuales se han incorporado a los protocolos de cribado neurotoxicológico, y estos resultados funcionales se utilizan ahora comúnmente para identificar y determinar la neurotoxicidad potencial de las sustancias químicas 3,4. Además, los criterios de valoración conductuales son muy relevantes desde el punto de vista ecológico, ya que incluso un cambio de comportamiento muy leve en los peces podría poner en peligro la supervivencia del animal en condiciones naturales5.

Uno de los ensayos conductuales más utilizados en la investigación del pez cebra adulto es la nueva prueba de tanque (NTT), que mide el comportamiento similar a la ansiedad 6,7. En este ensayo, los peces se exponen a la novedad (los peces se colocan en un tanque desconocido), a un estímulo aversivo leve y se observan sus respuestas conductuales. La NTT se utiliza para evaluar la actividad locomotora basal, la geotaxis, la congelación y los movimientos erráticos de los peces, principalmente. El 8 erráticose caracteriza por cambios bruscos de dirección (zigzagueo) y episodios repetidos de aceleraciones (dardos). Es una reacción de alarma y suele observarse antes o después de los episodios de congelación. El comportamiento de congelación corresponde a un cese completo de los movimientos del pez (excepto los movimientos operculares y oculares) mientras se encuentra en el fondo del tanque, a diferencia de la inmovilidad causada por la sedación, que causa hipolocomoción, acinesia y hundimiento8. La congelación suele estar relacionada con un alto estado de estrés y ansiedad y también forma parte de la conducta sumisa. Los comportamientos complejos son excelentes indicadores del estado de ansiedad de los animales. Se ha demostrado que la NTT es sensible a la manipulación farmacológica y genética9, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudiar las bases neurales de la ansiedad y los trastornos relacionados.

El pez cebra es una especie altamente social, por lo que podemos medir una amplia gama de comportamientos sociales. El test de cardúmenes (ST) y el test de preferencia social (SPT) son los ensayos más utilizados para evaluar el comportamiento social10. El ST mide la tendencia de los peces a agruparse11 cuantificando su comportamiento espacial y patrones de movimiento. La TS es útil para estudiar la dinámica de grupo, el liderazgo, el aprendizaje social y la comprensión del comportamiento social de muchas especies de peces12. El SPT en pez cebra adulto se adaptó de la preferencia de Crawley por la prueba de novedad social para ratones13 y rápidamente se convirtió en un ensayo de comportamiento popular para el estudio de la interacción social en esta especie modelo14. Estas dos pruebas también han sido adaptadas para su uso en ensayos de detección de drogas y se han mostrado prometedoras para la identificación de nuevos compuestos que modulan el comportamiento social15,16.

En general, los ensayos conductuales en pez cebra adulto son herramientas poderosas que pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de comportamiento o los neurofenotipos de los compuestos activos y los fármacos de los que se abusa17. Este protocolo detalla cómo implementar estas herramientas conductuales7 con recursos materiales básicos y cómo aplicarlas en ensayos de toxicidad para caracterizar los efectos de una amplia gama de compuestos neuroactivos. Además, veremos que las mismas pruebas se pueden aplicar para evaluar los efectos neuroconductuales de la exposición aguda a un compuesto neuroactivo (metanfetamina) pero también para caracterizar estos efectos después de la exposición crónica a concentraciones ambientales de un plaguicida (glifosato).

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Protocol

El estricto cumplimiento de las normas éticas garantiza el bienestar y el trato adecuado del pez cebra utilizado para la experimentación. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo las directrices establecidas por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (CID-CSIC). Los protocolos y resultados que se presentan a continuación se realizaron bajo la licencia otorgada por el gobierno local (acuerdo número 11336).

1. Alojamiento de animales para pruebas de comportamiento

  1. Realice todas las pruebas (presentadas en la Figura 1) en una sala de comportamiento aislada a 27-28 °C entre las 10:00 y las 17:00.
  2. Lave los peces de control y expuestos varias veces en agua limpia para peces [agua purificada por ósmosis inversa que contiene 90 mg/L de sal de los sistemas de acuario, 0,58 mM de CaSO4·2H2O y 0,59 mM de NaHCO3] antes de comenzar los experimentos para evitar cualquier posible contaminación del tanque experimental.
  3. Aclimatar a los animales a la sala de comportamiento 1 h antes de comenzar los experimentos.
  4. Asegúrese de que los animales (proporción ≈50:50 machos: hembras) sean ingenuos experimentalmente y realicen todas las pruebas de comportamiento de manera ciega sin que los observadores conozcan el grupo experimental.
  5. Para obtener resultados significativos en los ensayos conductuales, tenga un número total de 18 sujetos por condición (n = 18), idealmente obtenidos entre dos o más experimentos independientes. Por ejemplo, en pruebas individuales, analice el comportamiento de 9 animales por condición, por réplica. En pruebas grupales, analizar el comportamiento de un cardumen de 6 a 9 animales por condición, por réplica.
  6. Lleve a cabo todas las pruebas siguiendo un enfoque de prueba de batería (consulte las propuestas de planificación en la Figura 2). Éticamente más adecuado, este método permite reducir el número de animales necesarios para el estudio, cumpliendo con el principio de reducción de las 3R7.
  7. La mayoría de las veces, los ensayos conductuales están relacionados con ensayos biológicos, por lo que hay que sacrificar a los animales siguiendo las pautas de eutanasia18 antes de recolectar y analizar muestras (OMIC o productos químicos). Si el punto final no resulta ser el muestreo, vuelva a estabilizar el grupo de control al final del experimento. Reutilizar los animales de control con fines de cría o experimentación después de unos días.

Figure 1
Figura 1: Configuraciones experimentales. Tres configuraciones del tanque cuadrado para estudiar una amplia gama de comportamientos en el pez cebra adulto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cronología experimental. Dos propuestas de planificación para el registro de ensayos conductuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Configuraciones experimentales del tanque

  1. Comportamiento similar a la ansiedad: la prueba del tanque novedoso (NTT)
    1. Ajuste la configuración experimental (número de tanques, cámaras y computadoras) para registrar el número máximo de peces simultáneamente. Los ensayos de comportamiento individual consumen mucho tiempo, por lo que hay que optimizar el tiempo, el material y el espacio.
    2. Preparar los tanques experimentales para NTT: Tanque cuadrado (20 cm de largo, 20 cm de ancho, 25 cm de alto) cubierto con paneles acrílicos en las paredes laterales y en el fondo para evitar reflejos e interferencias entre sujetos.
    3. Llene los tanques experimentales con 7 L (altura de la columna de agua: 20 cm de altura) de agua de pescado bien oxigenada a 28 °C.
    4. Ajuste la posición del tanque frente a la cámara para evitar que la imagen se distorsione.
    5. Compruebe la configuración de la iluminación. La retroiluminación LED (10000 lux) proporciona una iluminación homogénea en toda la parte del tanque para la grabación de video en buenas condiciones.
    6. Encienda las cámaras y ajústelas siguiendo la sección 3.
    7. Introduce a los sujetos, uno por uno, en el fondo de los tanques experimentales antes de empezar a grabar lo más rápido posible.
      NOTA: Es importante comenzar a grabar con el animal en el fondo del tanque.
    8. Tenga cuidado de no molestar a los animales durante la grabación. Uso de una cortina o panel para limitar la interacción visual no solo entre los tanques sino también entre el soporte y el exterior.
    9. Al final de la grabación (el tiempo de grabación estándar es de 6 min), transfiera los animales que ya han pasado por la prueba a otro tanque para no mezclarlos con los animales ingenuos.
    10. Repita el procedimiento con todos los sujetos disponibles. Es aconsejable tener un número total de 18 sujetos por condición para obtener resultados significativos en ensayos individuales (a partir de dos o más réplicas independientes).
    11. Aleatoriza el grupo experimental asignado a cada tanque entre pruebas para evitar cualquier efecto potencial del tanque (si estás registrando varias condiciones al mismo tiempo).
  2. Comportamiento social agrupado: La prueba de Shoaling (ST)
    1. La configuración experimental de ST es la misma que la de NTT (los mismos tanques se pueden reutilizar directamente).
    2. Siga los pasos 2.1.1-2.1.6. para configurar el ST.
    3. Introduzca el cardumen (de 6 a 9 sujetos al mismo tiempo) en el fondo de los tanques experimentales antes de comenzar a grabar lo más rápido posible.
      NOTA: Es importante comenzar a grabar con el animal en el fondo del tanque.
    4. Siga los pasos 2.1.8-2.1.11. para realizar el ST.
    5. Repita el procedimiento con todos los sujetos disponibles. Para obtener resultados significativos en este ensayo, realice al menos dos réplicas independientes con el mismo tamaño de banco en cada réplica.
    6. Mantener el tamaño del banco de arena consistente para todos los grupos experimentales y réplicas dentro del mismo experimento.
  3. Comportamiento social individual: El Test de Preferencia Social (SPT)
    1. Ajuste la configuración experimental para optimizar el espacio experimental y el tiempo de grabación.
    2. Preparar los tanques experimentales para SPT: Tanque cuadrado (20 cm de largo, 20 cm de ancho, 25 cm de alto) transparente (vidrio o plástico) para ofrecer visibilidad lateral. El pez focal único es libre de interactuar con una zona virtual conespecífica: un banco de peces colocado en el tanque de alojamiento externo de un lado, o con la zona virtual no específica, un tanque de alojamiento vacío externo de un solo lado.
    3. Llene los tanques experimentales con 5 L (altura de la columna de agua: 15 cm, la misma altura que la columna de agua en los tanques externos de los alojamientos) de agua limpia para peces a 28 °C.
    4. Ajuste la posición del tanque frente a la cámara para evitar que la imagen se distorsione.
    5. Compruebe que el sistema recibe una iluminación homogénea.
    6. Introduce a los sujetos, uno por uno, en el fondo de los tanques experimentales antes de comenzar inmediatamente a grabar con el animal en el centro.
    7. Evite las interacciones visuales entre los observadores y los animales durante la grabación.
    8. Al final de la grabación de 6 minutos, transfiera los animales presentes a otro tanque para no mezclarlos con los animales ingenuos.
    9. Repita el procedimiento con todos los sujetos disponibles. Tener un número total de 18 sujetos por afección para obtener resultados significativos en ensayos individuales (a partir de dos o más réplicas independientes).

3. Grabación de video para pruebas de comportamiento

  1. Abra el administrador de cámaras para comprobar la disponibilidad de la cámara GigE en cada ordenador.
  2. Inicie el software de control de la cámara GigE (como uEye Cockpit, que se describe aquí). Abra la opción Cámara , seleccione el modo Monocromo y ajuste el tamaño de la imagen (1:2).
  3. Abrir propiedades de la cámara
    1. En Cámara, establezca el reloj de píxeles en Máximo, establezca la velocidad de fotogramas en 30 fotogramas por segundo (fps) y ajuste la exposición (ajuste automático o manual si la imagen es demasiado oscura).
    2. En Imagen, establece la Ganancia en 0 (Automático) y los Niveles de Negro (Automático o Manual se ajustan para obtener un buen contraste).
    3. En Tamaño, ajuste el tamaño de la ventana a la región que debe grabarse (Anchura: Anchura-Izquierda, Altura: Altura-Superior). Este paso permite reducir el tamaño de la imagen y, por tanto, el tamaño final del vídeo.
    4. Cierre Propiedades de la cámara.
  4. Cree una carpeta general para la sesión del experimento a fin de guardar la configuración de la cámara y los vídeos.
  5. Para guardar la configuración de la cámara, establezca Archivo > Guardar parámetros > A archivo y seleccione la carpeta de experimentos creada recientemente.
    NOTA: De este modo, el archivo de ajustes de la cámara se puede volver a cargar en la aplicación para seguir trabajando con los mismos parámetros de imagen en cualquier momento (por ejemplo, cuando la cámara se apaga repentinamente o para reutilizar los mismos ajustes, reduciendo el tiempo de configuración y homogeneizando las condiciones experimentales). Si, en un momento, la cámara se congela entre vídeos, detenga la grabación, salga y apague la cámara. Vuelva a encenderlo, vuelva a cargar los parámetros de la cámara yendo a Archivo > Cargar parámetros > A archivo y reinicie la grabación. Compruebe si el video actual se ha adquirido por completo para descartar o repetir el pescado (antes de repetir, dé a los animales algo de tiempo para que se vuelvan a aclimatar).
  6. Repita este procedimiento de configuración de la cámara (pasos 3.1-3.5) en todas las cámaras.
  7. Cuando todas las cámaras estén configuradas correctamente, abra Grabar secuencia de vídeo.
  8. Seleccione Crear para guardar como un nuevo archivo de vídeo, seleccione la carpeta de experimentos creada recientemente e informe en el nombre del archivo de vídeo la información del sujeto, el tipo de experimento y la fecha.
  9. Seleccione Máx. fotogramas. Escriba 10800 en el cuadro del marco. El video estándar está grabando 6 minutos (Video 1) a 30 fps en formato AVI; Por lo tanto, 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 fotogramas en total.
  10. Seleccione Velocidad de fotogramas de cálculo o indique la velocidad de fotogramas manualmente (velocidad de grabación: 30 fps).
  11. Repita el procedimiento de creación de archivos de video en todas las computadoras.
  12. Presenta a los sujetos, uno por uno, en el fondo de cada tanque experimental. Todos los ensayos se ejecutarán a la vez.
  13. Inicie los registros rápidamente haciendo clic en Grabar y espere a obtener el número máximo de fotogramas solicitados (paso 3.10).
  14. Una vez grabados los vídeos, aparece un cuadro de chat con el mensaje ¡Número máximo de fotogramas conseguidos!. Seleccione Aceptar.
  15. Seleccione Cerrar para finalizar la grabación y cerrar el archivo de video.
  16. Retira los peces que acabas de ser observados. Tenga cuidado de separarlos de los peces ingenuos.
  17. Seleccione directamente Crear y repita el proceso para continuar grabando videos.
  18. Una vez que se hayan realizado todas las grabaciones, seleccione Salir.
  19. Para apagar las cámaras, seleccione Cerrar cámara y salir del programa.

4. Análisis de videos grabados

  1. Inicie el software de análisis (consulte Tabla de materiales).
  2. Para elaborar una nueva plantilla, haga clic en Nuevo a partir de plantilla > aplicado a una plantilla predefinida > A partir de archivo de vídeo y seleccione un vídeo para empezar a configurar la plantilla. Trate de elegir un video representativo del experimento con un sujeto que exhiba buena movilidad y buenas condiciones de grabación.
  3. En Parámetros, configure los parámetros en las siguientes ventanas (1 a 4/7). Seleccione el modelo Pez > pez cebra adulto, el cuadrado de campo abierto de arena > una arena, el número de sujetos por arena (para el ST, se requiere un paquete de seguimiento múltiple [rastree varios sujetos en una arena]), el tipo de detección por punto central y, finalmente, ajuste la velocidad de fotogramas a 30 fps. En las siguientes ventanas (5 a 7/7), no cambie los parámetros; La configuración predeterminada es correcta.
  4. Asigne un nombre al experimento como plantilla y colóquelo en la misma carpeta que el resto del vídeo almacenado. La plantilla se creará como una carpeta de experimento con varias subdivisiones que contienen toda la información de configuración.
  5. En Configuración del experimento, compruebe la configuración definida (desde el archivo de vídeo, la arena, el número de sujetos, el fotograma por segundo). Aquí, las unidades del sistema se pueden modificar.
  6. En Configuración de la arena, haz clic con el botón derecho en el centro de la pantalla y selecciona Agarrar. Desde Archivo en la pantalla. Elija una imagen de video de buena calidad y acepte para capturar esta imagen para la configuración de fondo. Primero, Calibrar la imagen, generando una regla calibrada. Utilice el ancho del tanque como escala (19 cm). Luego, dibuja la arena. Tenga cuidado de hacer el cuadrado lo suficiente para evitar los reflejos del animal cuando este se acerque a la superficie o cualquier eventual confusión del software de peces con las áreas negras del tanque. Por último, dibuja las zonas de forma con la función Marco .
    1. Para NTT y ST, divida la parte delantera del tanque en dos zonas virtuales iguales, superior e inferior (consulte la Figura 1). Dibuja dos cuadros horizontales iguales. Los palcos cubren media arena para cada uno. Asigne un nombre a la parte superior e inferior para las zonas superior e inferior, respectivamente. Tenga cuidado de que las cajas tengan el mismo ancho (9-10 cm) y largo (8-9 cm), no excedan los límites de la arena (cuadrado naranja) y no se superpongan, verificando que cada zona de flecha indique exactamente sus zonas.
    2. Para SPT, divida el campo experimental conceptualmente en tres zonas de igual tamaño: vacía, central y conespecífica (ver Figura 1). Dibuja tres cuadros verticales iguales. Nombra la caja orientada al tanque de cardúmenes como Conespecífica, la caja orientada al tanque vacío como Vacía y la del medio como Centro. Tenga cuidado de que las cajas tengan el mismo ancho (6 cm) y largo (18-19 cm), no excedan los límites de la arena y no se superpongan.
  7. En Configuración de detección, verifique qué video se tratará en el archivo de video. Luego, verifique la calidad de la detección (peces en amarillo, punto central rojo). Haga clic en Detección automática para ajustar la detección, reenfocando al animal (elija una imagen en la que el animal esté nadando de perfil sobre el fondo blanco, dibuje la imagen tomando todo su cuerpo y valide la detección con Sí). Abra Avanzado para mejorar la detección seleccionando Sustracción dinámica, Sujeto más oscuro, Configuración de fondo, Aprendizaje de fondo, Tamaño del sujeto, Reducción de ruido, etc.
  8. En Configuración de pruebas, coloque una versión de prueba y elimine las demás (haga clic con el botón derecho y elimine)
  9. En Configuración de datos, cree ventanas de diálogo Resultados . Parametrizar Resultados por tiempo y por zona. Por ejemplo, cree una ventana de resultados para la salida de datos por minutos y otra para la salida de datos por tiempo total (6 min). Solicite la salida de datos para cada zona (solicítela si se necesita la distancia en cada zona). Vincule las diferentes ventanas de resultados a la ventana de inicio con flechas.
  10. En Configuración de análisis, seleccione los parámetros que desea analizar y el tipo de estadísticas para cada parámetro. Estos parámetros se calcularán automáticamente en función de los datos adquiridos en el seguimiento.
    1. Para NTT y SPT, seleccione las opciones que se definen a continuación:
      1. Seleccione Distancia recorrida (seleccione Total) para obtener la distancia recorrida en la arena (cm) y la distancia recorrida en las zonas respectivas (cm).
      2. Seleccione En zonas (seleccione Zonas, Frecuencia, Acumulativo y Latencia hasta la primera) para tener el tiempo empleado en las zonas (s) y la latencia hasta la primera entrada en las zonas (s).
      3. Seleccione Transición de zona (seleccione Umbral: 0 cm, Agregar Zona 1 > Zona 2; Zona 2 > Zona 1, en cualquier zona, Frecuencia) para obtener el número de entradas en las zonas.
      4. Seleccione Estado de movilidad (rellene Móvil alto por encima del 70 %, Inmóvil por debajo del 3 %, mínimo 150 fotogramas y seleccione frecuencia, acumulativa y latencia en primer lugar) para tener la duración de la hipermovilidad (s), la duración de la congelación (s).
        NOTA: Consulte la sección Discusión para obtener más detalles sobre la aproximación del comportamiento de congelación mediante el análisis automatizado y el número y la duración (s) de los episodios de congelación.
      5. Seleccione Aceleración y ángulo de giro (seleccione frecuencia y acumulativo) para evaluar la ocurrencia de comportamientos complejos como precipitaciones y movimientos erráticos (aceleración rápida).
    2. Para el ST, además de los parámetros exploratorios anteriores, seleccione la opción Distancia entre sujetos (seleccione todos los sujetos, media, máximo, mínimo) para obtener la distancia promedio entre peces (cm), la distancia promedio entre el vecino más cercano (cm) y la distancia promedio entre el vecino más lejano.
  11. La plantilla está lista para su uso. Guarde las últimas modificaciones y cierre la plantilla sin adquirir ningún dato del video (mantenga el archivo de plantilla; es liviano y fácil de administrar y copiar). Si hay varias licencias de software, analice los videos de la misma plantilla copiada en cada computadora.
  12. Para copiar y utilizar la plantilla, hay dos opciones:
    1. Abra el archivo de plantilla con el software de análisis de comportamiento, vaya a Archivo > Guardar como para crear un nuevo archivo idéntico.
    2. En la interfaz de bienvenida, seleccione Nuevo a partir de plantilla > se aplicó una plantilla personalizada > A partir de archivo de vídeo (elija plantilla. Archivo EthXV). Asigne un nombre al nuevo experimento y seleccione su ubicación. El software puede tardar unos minutos en copiar la información del archivo de plantilla.
  13. Ve a Configuración de Arena para volver a ajustar la plantilla si el video se grabó con una cámara diferente (sigue los pasos 4.6 y 4.7).
  14. Vaya a Configuración de detección o Adquisición para verificar qué video está seleccionado y cambie el archivo de video si es necesario.
  15. En Adquisición, seleccione DDS > listo para comenzar. El software puede tardar unos minutos en procesar el vídeo.
  16. Cuando finalice la adquisición, vaya al Editor de pistas. Seleccione aceleración x16 para leer el video procesado más rápido y verificar si el seguimiento es correcto.
    NOTA: A veces, puede haber "pérdidas" en el seguimiento (debido a reflejos o confusión del propio software). Se pueden editar manualmente desde esta parte si son pocos; De lo contrario, es preferible reprocesar todo el experimento, mejorando la definición del lienzo y la detección.
  17. En Estadísticas, haga clic en Calcular > exportar datos. La exportación de datos se encuentra directamente en la carpeta del experimento.
  18. En Visualización de pistas o Mapas de calor, genere y exporte (haga clic con el botón derecho, exporte la imagen, seleccione la carpeta Exportar archivos del experimento para guardar estos datos con el informe de la hoja de cálculo) imágenes de seguimiento del animal.
  19. Vaya a Archivo para cerrar el experimento activo y repita este procedimiento para el siguiente vídeo.

5. Análisis estadístico

  1. Analizar la normalidad (test de Shapiro-Wilk) de los datos en cada grupo.
  2. Evalúe la homocedasticidad con la prueba de Levene.
  3. Utilizar el ANOVA de un factor seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett y Tukey para probar las diferencias entre los grupos cuando no se pueden rechazar los criterios de normalidad y homocedasticidad.
  4. Utilizar la prueba de Kruskal-Wallis seguida de una comparación por pares utilizando la corrección de Bonferroni para probar las diferencias entre los grupos cuando se rechazan los criterios de normalidad y homocedasticidad.
  5. Grafique los datos con un software gráfico.

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Representative Results

En esta sección, veremos algunas posibles aplicaciones de estas herramientas conductuales en la neurotoxicología de peces. Los siguientes resultados corresponden a la caracterización de los efectos agudos o atracones de la metanfetamina (METH), una droga recreativa, y los efectos subcrónicos del glifosato, uno de los principales herbicidas encontrados en los ecosistemas acuáticos.

Caracterización de un modelo de neurotoxicidad por atracón de metanfetamina en pez cebra adulto
Al evaluar el efecto de 40 mg/L de METH sobre NTT (Figura 3), la prueba de Kruskal-Wallis confirmó que los animales expuestos presentaron una geotaxis positiva, caracterizada por una disminución en el tiempo de exploración en la zona superior del tanque experimental (H(2) = 35.964, P = 1.55 x 10-8), así como en la distancia recorrida en esta parte (H(2) = 32.272, P = 9,82 x 10-8), y en el número de visitas (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). También observamos un aumento significativo en el tiempo de latencia previo a la primera visita a la zona superior (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Es importante destacar que las diferencias observadas en los parámetros medidos en el NTT después de la exposición a METH son consistentes a lo largo del tiempo, como lo confirma la corrección de Bonferroni (P > 0.8). Se encontró un efecto significativo del tiempo de exposición para el comportamiento de congelación (H(2) = 13.120, P = 0.0014).

Figure 3
Figura 3: Comportamiento similar a la ansiedad evaluado en la prueba estándar de 6 minutos de un nuevo tanque (NTT) de pez cebra adulto expuesto a 40 mg/L de metanfetamina (METH) durante 3 h y 48 h. Los datos de cada experimento se normalizaron a los valores de control correspondientes. Los datos combinados se presentan como un diagrama de dispersión con la mediana (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Prueba de Kruskal Wallis con corrección de Bonferroni para los criterios de valoración NTT. Datos de 2 experimentos independientes. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Bedrossiantz et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los movimientos de congelación se pueden cuantificar evaluando la frecuencia, la latencia, la duración o la ubicación de la congelación. La mejor manera de puntuarlos es, sin duda, el ojo de un observador experimentado, lo cual es bastante laborioso y complejo, por lo que probamos una alternativa automatizada utilizando el software EthoVision para detectar el comportamiento de congelación19. Encontramos que el número, la latencia y la duración de los ataques de congelación calculados por el software (Tabla 1A) se correlacionan con buena precisión con los episodios puntuados manualmente por el observador (Tabla 1B). Si bien los dos métodos son equivalentes en términos de resultados (P = 0,958, prueba de Student), utilizamos el enfoque automatizado para evaluar la congelación aquí. Después de 3 h de exposición a METH, el tiempo de congelación aumentó significativamente (P = 0,0012), mientras que no se encontraron diferencias con el control después de 48 h de exposición (P = 0,16). METH no produjo ningún efecto sobre los movimientos erráticos en ninguno de los dos momentos.

Utilizamos dos paradigmas experimentales para evaluar los efectos sobre el comportamiento social después de una exposición aguda a METH. El ST (Figura 4) reveló que la distancia promedio y la distancia más lejana entre los individuos fueron significativamente mayores para los peces tratados con MET (H(2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 para distancias medias y más lejanas entre peces, respectivamente), lo que apunta a un fenotipo conductual de aislamiento social. Una vez más, observamos que no se encontró efecto del tiempo utilizando la prueba post hoc de Bonferroni (P > 0,5).

Figure 4
Figura 4: Comportamiento social de un pez cebra adulto en el agua expuesto a 40 mg/L de metanfetamina (METH) durante 3 h y 48 h. Resultados de la prueba de cardumen (ST), incluidas las distancias medias y más lejanas entre peces. Los datos combinados se presentan como un diagrama de dispersión con la mediana (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Test de Kruskal Wallis con corrección de Bonferroni. Datos de 2 experimentos independientes. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Bedrossiantz et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el SPT (Figura 5), los peces tratados muestran una disminución significativa en el tiempo de permanencia y la distancia recorrida en la zona conespecífica (F(2,74) = 14.497, P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 para el tiempo de permanencia y la distancia recorrida en la zona conespecífica, respectivamente). Estos resultados reafirman el fenotipo de aislamiento social sugerido por los resultados del ST. La prueba post hoc de Diferencias Significativas Honestas (HSD) de Tukey descartó que no hubiera diferencias posibles entre los dos tiempos de análisis (P > 0,5).

Figure 5
Figura 5: Comportamiento social de un pez cebra adulto expuesto a 40 mg/L de metanfetamina (METH) durante 3 h y 48 h. Los resultados de la prueba de preferencia social (SPT, por sus siglas en inglés), que incluyen el tiempo y la distancia de los peces en cada una de las tres zonas virtuales del tanque experimental: vacío, centro y conespecífico. Los datos de cada experimento se normalizaron a los valores de control correspondientes. Los datos combinados se presentan como un diagrama de dispersión con la mediana (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA de un factor con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Datos de 2 experimentos independientes. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Bedrossiantz et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efecto conductual de la exposición subcrónica a niveles ambientales de glifosato
El análisis conductual de los efectos de la exposición subcrónica a 3 μg/L de glifosato sobre el NTT (Figura 6) revela una disminución significativa en el tiempo dedicado a explorar la parte superior (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), la distancia recorrida en esta parte (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) y el número de visitas (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Estos efectos son característicos del comportamiento positivo de la geotaxis, al igual que el aumento del efecto observado en el tiempo de latencia que precede a la primera visita a la parte superior del tanque (H(2) = 9.628, P = 0.008). También se analizó la expresión de conductas erráticas y de congelación de los animales expuestos en el NTT. La duración (H(2) = 17,261, P = 0,025) y el número de episodios erráticos (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) aumentaron significativamente con el glifosato. Por el contrario, no se encontraron diferencias de congelación con el control (Chi-cuadrado de Pearson(2) = 2,964, P = 0,253). Aplicado a un contexto ecológico, las observaciones realizadas en NTT sugieren que el glifosato podría disminuir significativamente el comportamiento exploratorio de los peces, poniendo en peligro su capacidad para sobrevivir en la naturaleza.

Figure 6
Figura 6: Comportamiento similar a la ansiedad evaluado en la prueba estándar de 6 minutos del nuevo tanque (NTT) de peces cebra adultos expuestos a 0,3 μg/L y 3 μg/L de glifosato durante 2 semanas. Se analizaron los parámetros de comportamiento, así como una caricatura del tanque experimental dividido en dos zonas virtuales iguales, superior e inferior. Los datos se reportaron como un diagrama de dispersión con la mediana (n = 23-29), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ANOVA unidireccional con test de comparación múltiple de Dunnett (Distancia total, Distancia en la cima, Tiempo en la cima, Transiciones a la cima, Combates erráticos, Alta frecuencia de movilidad) o test de Kruskal Wallis con corrección de Bonferroni (Latencia a la cima, Duración errática). No se encontraron diferencias (P > 0,05) en la duración de la congelación y en los episodios de congelación. Datos de 2-4 experimentos independientes. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Faria et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La escolarización, grupos no polarizados de congéneres que se mantienen unidos por la presión social para protegerse de los depredadores, es una tendencia natural de Danio Rerio. La escuela puede "tensarse" o "expandirse" dependiendo del nivel de ansiedad o miedo de los animales, un efecto visual particular que es muy fácil de identificar experimentalmente (Figura 7). En el experimento con glifosato, la prueba de cardúmenes reveló un aumento de la ansiedad en los peces expuestos a 3 μg/L, reflejado por un agrupamiento del cardumen y, por lo tanto, una disminución significativa en la distancia media y la distancia más lejana entre los individuos (F2,56 = 5,664, P = 0,006 y F2,56 = 7,413, P = 0,001, para las distancias medias y más lejanas entre peces, respectivamente) en comparación con el control.

Figure 7
Figura 7: Comportamiento social de un pez cebra adulto en el agua expuesto a 0,3 μg/L y 3 μg/L de glifosato durante 2 semanas. Los datos se reportaron como diagrama de dispersión con la mediana (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA de un factor con la prueba de comparación múltiple de Dunnett (distancia media entre peces y distancia más lejana) Datos de 2 a 4 experimentos independientes. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Faria et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Una aproximación del comportamiento de congelación mediante un análisis automatizado. Los datos reportados en esta tabla provienen de la misma grabación (Video 1) analizada con dos métodos diferentes. (A) Aproximación del comportamiento de congelación mediante cálculo automatizado con el software EthoVision V13. La movilidad variable se calcula a partir del cambio del área temática entre dos muestras, por lo que depende de la frecuencia de adquisición de esta área. Establecemos un umbral de inmovilidad muy bajo (menos del 3% de movilidad), así como la frecuencia de muestreo a un tiempo continuo mínimo de 5 s (más de 150 fotogramas). (B) Análisis de la conducta de congelación con el Software Interactivo de Investigación de Observación del Comportamiento (BORIS, software libre y de código abierto). BORIS es un software de registro de eventos para codificación de video y observaciones en vivo. Con BORIS, el observador puede codificar el episodio de congelación como un evento de estado, definiendo los puntos de inicio y finalización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Vídeo 1: Peces de control en la prueba del nuevo tanque. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Las conductas de ansiedad características observadas en la NTT se han correlacionado positivamente con los niveles de serotonina analizados en el cerebro21. Por ejemplo, después de la exposición a la paraclorofenilalanina (PCPA), un inhibidor de la biosíntesis de 5-HT, los peces exhibieron geotaxis positiva, así como una disminución de los niveles cerebrales de 5-HT22, resultados muy similares a los obtenidos con METH. Por lo tanto, la disminución de los niveles de serotonina en el cerebro y la exhibición de geotaxis positivos en el pez cebra expuesto a la metanfetamina sugiere que el comportamiento de ansiedad producido por la droga está mediado por la vía serotoninérgica. Curiosamente, se puede observar un fenotipo de comportamiento similar, es decir, un efecto ansiogénico sobre la geotaxis, en peces cebra adultos expuestos durante 2 semanas a 0,3 3 μg/L y 3 μg/L, dos concentraciones de glifosato relevantes para el medio ambiente. También se informó previamente de un aumento de la geotaxis en el pez cebra adulto con el neurotóxico acrilamida 6,23. En todos estos casos, este fenotipo conductual (un aumento de la geotaxis en el NTT, característico de la sustancia ansiogénica) se asoció con la disminución de los niveles de neurotransmisores monoaminérgicos. Por lo tanto, el paradigma NTT combinado con el análisis neuroquímico del cerebro proporciona información ecológicamente relevante, comportamiento exploratorio y eficiencia de búsqueda de alimento, y conecta los neurofenotipos del comportamiento con modulaciones de neurotransmisores.

Por otro lado, también se observó un deterioro de los comportamientos sociales en ambos ensayos, el ST y el SPT, en los peces tratados con METH. El resultado obtenido en este estudio es consistente con varios estudios con ratas y monos, donde la exposición aguda y crónica de los animales de estudio a METH resulta en retraimiento social24. Los cambios en el comportamiento social asociados con el abuso de METH han sido explicados en humanos por deficiencias en la función sociocognitiva24. Se encontró un efecto ansiogénico sobre el tamaño del cardumen en el pez cebra expuesto durante 2 semanas a 3 μg/L de glifosato. Observamos una fenocopia de este efecto en el pez cebra expuesto a 53 mg/L (0,75 mM) de acrilamida durante 3 días 6,23.

Los ensayos NTT, ST y SPT permiten determinar de manera efectiva los posibles efectos neurotóxicos25 de una amplia gama de sustancias químicas, como lo ilustra el estudio de modelos de toxicidad aguda por metanfetamina y glifosato subcrónico en peces cebra adultos. El comportamiento es, en toxicología, un criterio de valoración apical relevante, caracterizando los efectos a nivel de organismo de una sustancia química para la neurotoxicidad y la investigación ambiental. Además de ser un criterio de valoración subletal en condiciones de laboratorio, los cambios en los comportamientos, como el comportamiento exploratorio o social, pueden ser de naturaleza deletérea. Además, la batería de análisis conductual propuesta es un método semiautomatizado fácil deimplementar11 y, por lo tanto, muy eficiente si los ensayos se planifican conscientemente (principio de reducción)26. La realización de estos ensayos como una batería de pruebas utilizando un solo tanque reduce el número de animales y el tiempo experimental y la generación de residuos.

El orden de los ensayos en la batería es una consideración importante si queremos estudiar el perfil de respuesta de un individuo en cada ensayo. Para ello, la realización de los ensayos individuales seguidos (ver Figura 2) permite mantener al animal identificado y relacionar su comportamiento exploratorio con su preferencia social. Además, las respuestas conductuales del animal pueden relacionarse con otros datos biológicos, como su perfil de neurotransmisores o su expresión génica, si los peces se mantienen identificados hasta el punto final del muestreo (Figura 2A).

Por lo general, el análisis conductual permite observar las diferencias entre los grupos. En primer lugar, las respuestas individuales se calculan sobre la base del seguimiento de los animales27 antes de agrupar los datos por grupo. A continuación, se comparan las medias y la diferencia de varianza con respecto al grupo control para cada parámetro conductual calculado. Con el análisis de cardúmenes12, es fundamental tener muy claro que la unidad de varianza es el grupo de peces de prueba, no los peces individuales, ya que el comportamiento de cada pez individual está influenciado por los otros peces en el cardumen. Esta es la forma utilizada en la mayoría de los trabajos para procesar los datos de comportamiento28. Sin embargo, podría ser útil repensar el análisis de los parámetros conductuales no parámetro por parámetro, sino como una respuesta global por ensayo. Por ejemplo, se podría calcular la covarianza de cada medición realizada en un ensayo y reportarla como una forma diferente de medir lo mismo: comportamiento ansioso, exploratorio o gregario. Hay muchas formas de calcular e interpretar los datos de comportamiento 28,29. Dependiendo del número de condiciones, el tipo de pruebas y la adquisición de imágenes (2D o 3D)30,31, el análisis puede replantearse por completo para obtener el mejor rendimiento de los datos.

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Disclosures

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo ha contado con el apoyo de la Agencia Estatal de Investigación del Ministerio de Ciencia e Innovación (proyecto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz ha contado con el apoyo de una beca de doctorado (PRE2018-083513) cofinanciada por el Gobierno de España y el Fondo Social Europeo (FSE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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