Summary
Hier presenteren we een uitgebreide gedragstestbatterij, inclusief de nieuwe tank-, Shoaling- en sociale voorkeurstests, om de potentiële neurotoxische effecten van chemicaliën (bijv. methamfetamine en glyfosaat) op volwassen zebravissen effectief te bepalen met behulp van een enkele tank. Deze methode is relevant voor neurotoxiciteit en milieuonderzoek.
Abstract
De aanwezigheid van neuropathologische effecten bleek jarenlang het belangrijkste eindpunt te zijn voor de beoordeling van de neurotoxiciteit van een chemische stof. In de afgelopen 50 jaar zijn de effecten van chemicaliën op het gedrag van modelsoorten echter actief onderzocht. Geleidelijk aan werden gedragseindpunten opgenomen in neurotoxicologische screeningsprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu routinematig gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Gedragstesten bij volwassen zebravissen bieden een gestandaardiseerde en betrouwbare manier om een breed scala aan gedragingen te bestuderen, waaronder angst, sociale interactie, leren, geheugen en verslaving. Gedragstesten bij volwassen zebravissen omvatten meestal het plaatsen van de vissen in een experimentele arena en het registreren en analyseren van hun gedrag met behulp van videotrackingsoftware. Vissen kunnen worden blootgesteld aan verschillende stimuli en hun gedrag kan worden gekwantificeerd met behulp van verschillende statistieken. De nieuwe tanktest is een van de meest geaccepteerde en meest gebruikte tests om angstachtig gedrag bij vissen te bestuderen. De scholen- en sociale voorkeurstests zijn nuttig bij het bestuderen van het sociale gedrag van zebravissen. Deze test is vooral interessant omdat het gedrag van de hele school wordt bestudeerd. Deze tests hebben bewezen zeer reproduceerbaar en gevoelig te zijn voor farmacologische en genetische manipulaties, waardoor ze waardevolle hulpmiddelen zijn voor het bestuderen van de neurale circuits en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag. Bovendien kunnen deze tests worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen om verbindingen te identificeren die potentiële gedragsmodulatoren kunnen zijn.
We zullen in dit werk laten zien hoe gedragsinstrumenten kunnen worden toegepast in de neurotoxicologie van vissen, waarbij we het effect van methamfetamine, een recreatieve drug, en glyfosaat, een milieuverontreinigende stof, analyseren. De resultaten tonen de significante bijdrage aan van gedragstesten in volwassen zebravissen aan het begrip van de neurotoxicologische effecten van milieuverontreinigende stoffen en medicijnen, naast het verschaffen van inzicht in de moleculaire mechanismen die de neuronale functie kunnen veranderen.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een populaire modelsoort van gewervelde dieren voor ecotoxicologie, ontdekking van geneesmiddelen en veiligheidsfarmacologische studies. De goedkope, gevestigde moleculair genetische hulpmiddelen en het behoud van belangrijke fysiologische processen die betrokken zijn bij de morfogenese en het onderhoud van het zenuwstelsel maken zebravissen tot een ideaal diermodel voor neurowetenschappelijk onderzoek, inclusief neurogedragstoxicologie 1,2. Het belangrijkste eindpunt voor het evalueren van de neurotoxiciteit van een chemische stof was tot voor kort de aanwezigheid van neuropathologische effecten. De laatste tijd zijn gedragseindpunten echter opgenomen in neurotoxicologische screeningprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu vaak gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Bovendien zijn gedragseindpunten zeer relevant vanuit ecologisch oogpunt, aangezien zelfs een zeer milde gedragsverandering bij vissen het voortbestaan van het dier in natuurlijke omstandigheden in gevaar kan brengen.
Een van de meest gebruikte gedragstesten in het onderzoek naar volwassen zebravissen is de nieuwe tanktest (NTT), die angstachtig gedrag meet 6,7. In deze test worden vissen blootgesteld aan nieuwigheid (vissen worden in een onbekend aquarium geplaatst), een milde aversieve stimulus en hun gedragsreacties worden geobserveerd. NTT wordt voornamelijk gebruikt om basale locomotorische activiteit, geotaxis, bevriezing en grillige bewegingen van vissen te beoordelen. Grillig8 wordt gekenmerkt door abrupte richtingsveranderingen (zigzaggen) en herhaalde episodes van versnellingen (darten). Het is een alarmreactie en wordt meestal waargenomen voor of na bevriezingsepisodes. Bevriezingsgedrag komt overeen met een volledige stopzetting van de bewegingen van de vis (behalve operculaire en oculaire bewegingen) op de bodem van de tank, in tegenstelling tot immobiliteit veroorzaakt door sedatie, die hypolocobeweging, akinesie en zinken veroorzaakt8. Bevriezing is meestal gerelateerd aan een hoge staat van stress en angst en maakt ook deel uit van onderdanig gedrag. Complex gedrag is een uitstekende indicator van de staat van angst van dieren. Van NTT is aangetoond dat het gevoelig is voor farmacologische en genetische manipulatie9, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bestuderen van de neurale basis van angst en aanverwante aandoeningen.
Zebravissen zijn een zeer sociale soort, dus we kunnen een breed scala aan sociaal gedrag meten. De ondieptetest (ST) en de sociale voorkeurstest (SPT) zijn de meest gebruikte tests om sociaal gedrag te beoordelen10. De ST meet de neiging van vissen om11 te groeperen door hun ruimtelijk gedrag en bewegingspatronen te kwantificeren. ST is nuttig voor het bestuderen van groepsdynamiek, leiderschap, sociaal leren en het begrijpen van het sociale gedrag van veel vissoorten12. De SPT in volwassen zebravissen werd aangepast van Crawley's voorkeur voor sociale nieuwheidstest voor muizen13 en werd al snel een populaire gedragstest voor de studie van sociale interactie in deze modelsoort14. Deze twee tests zijn ook aangepast voor gebruik in drugsscreeningstests en zijn veelbelovend gebleken voor het identificeren van nieuwe verbindingen die sociaal gedrag moduleren15,16.
Over het algemeen zijn gedragstesten bij volwassen zebravissen krachtige hulpmiddelen die waardevolle informatie kunnen opleveren over de gedragsmechanismen of de neurofenotypes van actieve stoffen en misbruikte medicijnen. Dit protocol beschrijft hoe deze gedragshulpmiddelen7 kunnen worden geïmplementeerd met elementaire materiële middelen en hoe ze kunnen worden toegepast in toxiciteitstests om de effecten van een breed scala aan neuroactieve stoffen te karakteriseren. Daarnaast zullen we zien dat dezelfde tests kunnen worden toegepast om de neurologische gedragseffecten van acute blootstelling aan een neuroactieve stof (methamfetamine) te beoordelen, maar ook om deze effecten te karakteriseren na chronische blootstelling aan omgevingsconcentraties van een pesticide (glyfosaat).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Strikte naleving van ethische normen garandeert het welzijn en de juiste behandeling van de zebravissen die voor experimenten worden gebruikt. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn opgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC). De hieronder gepresenteerde protocollen en resultaten zijn uitgevoerd onder de vergunning die is verleend door de lokale overheid (overeenkomstnummer 11336).
1. Huisvesting van dieren voor gedragstesten
- Voer alle tests (weergegeven in figuur 1) uit in een geïsoleerde gedragsruimte bij 27-28 °C tussen 10:00 en 17:00 uur.
- Was zowel de controle- als de blootgestelde vissen meerdere keren in schoon viswater [gezuiverd water met omgekeerde osmose met 90 mg/L aquariumsysteemzout, 0,58 mM CaSO4·2H2O en 0,59 mM NaHCO3] voordat u met de experimenten begint om mogelijke verontreiniging van de experimentele tank te voorkomen.
- Laat de dieren 1 uur voor aanvang van de experimenten wennen aan de gedragsruimte.
- Zorg ervoor dat de dieren (≈50:50 man:vrouw-verhouding) experimenteel naïef zijn en voer alle gedragstesten op een blinde manier uit met waarnemers die niet op de hoogte zijn van de experimentele groep.
- Om zinvolle resultaten in gedragstesten te verkrijgen, moet u een totaal aantal van 18 proefpersonen per aandoening (n = 18) hebben, idealiter verkregen tussen twee of meer onafhankelijke experimenten. Analyseer bijvoorbeeld in individuele tests het gedrag van 9 dieren per aandoening, per replica. Analyseer in groepstests het gedrag van een school van 6 tot 9 dieren per conditie, per replica.
- Voer alle tests uit volgens een batterijtestbenadering (zie planningsvoorstellen in figuur 2). Deze methode is ethisch geschikter en maakt het mogelijk om het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek te verminderen, in overeenstemming met het 3V-reductieprincipe7.
- Meestal zijn gedragstesten verbonden met biologische tests, dus offer de dieren volgens euthanasierichtlijnen18 voordat u monsters verzamelt en analyseert (OMIC's of chemicaliën). Als het eindpunt geen steekproef blijkt te zijn, moet de controlegroep aan het einde van het experiment opnieuw worden gestabiliseerd. Hergebruik de controledieren na enkele dagen voor fok- of experimentele doeleinden.
Figuur 1: Experimentele opstellingen. Drie configuraties van de vierkante tank om een breed scala aan gedragingen bij volwassen zebravissen te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele tijdlijn. Twee planningsvoorstellen voor de registratie van gedragstesten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Experimentele configuraties van de tank
- Angstachtig gedrag: de nieuwe tanktest (NTT)
- Pas de experimentele opstelling aan (aantal tanks, camera's en computers) om het maximale aantal vissen tegelijk vast te leggen. Individuele gedragstesten zijn tijdrovend, dus optimaliseer tijd, materiaal en ruimte.
- Bereid de experimentele tanks voor op NTT: Vierkante tank (20 cm lang, 20 cm breed, 25 cm hoog) bedekt met acrylpanelen op zijwanden en bodem om reflectie en interferentie tussen proefpersonen te voorkomen.
- Vul de experimentele tanks met 7 L (hoogte waterkolom: 20 cm hoogte) goed zuurstofrijk viswater bij 28 °C.
- Pas de positie van de tank voor de camera aan om vervormd beeld te voorkomen.
- Controleer de verlichtingsinstelling. LED-achtergrondverlichting (10000 lux) zorgt voor een homogene verlichting op het hele deel van de tank voor video-opnamen in goede omstandigheden.
- Schakel de camera's in en pas ze aan volgens hoofdstuk 3.
- Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van de experimentele tanks voordat u zo snel mogelijk begint met opnemen.
NOTITIE: Het is belangrijk om te beginnen met opnemen met het dier op de bodem van de tank. - Zorg ervoor dat u de dieren niet stoort tijdens het opnemen. Gebruik van een gordijn of paneel om de visuele interactie te beperken, niet alleen tussen tanks, maar ook tussen de steun en de buitenkant.
- Breng aan het einde van de registratie (de standaardopnametijd is 6 minuten) de dieren die de test al hebben doorstaan over naar een andere tank om ze niet te mengen met de naïeve dieren.
- Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Het is raadzaam om in totaal 18 proefpersonen per aandoening te hebben om zinvolle resultaten te verkrijgen in individuele onderzoeken (van twee of meer onafhankelijke replicaten).
- Randomiseer de experimentele groep die aan elke tank is toegewezen tussen proeven om mogelijke tankeffecten te voorkomen (als u meerdere aandoeningen tegelijkertijd registreert).
- Sociaal groepsgedrag: De Shoaling Test (ST)
- De experimentele configuratie van ST is dezelfde als die van NTT (dezelfde tanks kunnen direct worden hergebruikt).
- Volg de stappen 2.1.1-2.1.6. om de ST op te zetten.
- Introduceer de school (6 tot 9 proefpersonen tegelijkertijd) op de bodem van de experimentele tanks voordat u zo snel mogelijk begint met opnemen.
NOTITIE: Het is belangrijk om te beginnen met opnemen met het dier op de bodem van de tank. - Volg de stappen 2.1.8-2.1.11. om de ST uit te voeren.
- Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Om zinvolle resultaten in deze test te verkrijgen, maakt u ten minste twee onafhankelijke replicaten met dezelfde bankgrootte in elke replicaat.
- Houd de grootte van de ondiepte consistent voor alle experimentele groepen en repliceert binnen hetzelfde experiment.
- Sociaal individueel gedrag: De Sociale Voorkeurstest (SPT)
- Pas de experimentele opstelling aan om de experimentele ruimte en opnametijd te optimaliseren.
- Bereid de experimentele tanks voor op SPT: Vierkante tank (20 cm lang, 20 cm breed, 25 cm hoog) transparant (glas of plastic) om zijdelings zicht te bieden. De enkelvoudige focale vis is vrij om te interageren met een conspecifieke virtuele zone - een school vis die in de eenzijdige externe huisvestingstank is geplaatst, of met de niet-specifieke virtuele zone - een eenzijdige externe lege huisvestingstank.
- Vul de experimentele tanks met 5 L (hoogte waterkolom: 15 cm, dezelfde hoogte als de waterkolom in de tanks aan de buitenkant) schoon viswater bij 28 °C.
- Pas de positie van de tank voor de camera aan om vervormd beeld te voorkomen.
- Controleer of het systeem homogeen verlicht is.
- Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van de experimentele tanks voordat u onmiddellijk begint met opnemen met het dier in het midden.
- Vermijd visuele interacties tussen waarnemers en dieren tijdens het opnemen.
- Breng aan het einde van de opname van 6 minuten de aanwezige dieren over naar een andere tank om ze niet te mengen met de naïeve dieren.
- Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Zorg voor een totaal aantal van 18 proefpersonen per aandoening om zinvolle resultaten te verkrijgen in individuele onderzoeken (van twee of meer onafhankelijke replicaten).
3. Video-opname voor gedragstests
- Open de cameramanager om de beschikbaarheid van de GigE-camera op elke computer te controleren.
- Start de GigE-camerabesturingssoftware (zoals uEye Cockpit, hier beschreven). Open de optie Camera , selecteer de modus Monochroom en pas de afbeeldingsgrootte aan (1:2).
- Camera-eigenschappen openen
- Stel onder Camera de pixelklok in op Maximum, stel de framesnelheid in op 30 frames per seconde (fps) en pas de belichting aan (automatisch of handmatig aanpassen als het beeld te donker is).
- Stel onder Afbeelding de versterking in op 0 (automatisch) en de zwartniveaus (automatisch of handmatig aanpassen om een goed contrast te verkrijgen).
- Pas onder Grootte de grootte van het venster aan op het gebied dat moet worden gegraveerd (Breedte: Breedte-Links, Hoogte: Hoogte-Boven). Deze stap maakt het mogelijk om de grootte van de afbeelding en dus de uiteindelijke grootte van de video te verkleinen.
- Sluit Camera-eigenschappen.
- Maak een algemene map voor de experimentsessie om de camera-instellingen en video's op te slaan.
- Als u de camera-instellingen wilt opslaan, stelt u Bestand > Parameters opslaan > Naar bestand in en selecteert u de experimentmap die onlangs is gemaakt.
OPMERKING: Het bestand met camera-instellingen kan dus opnieuw in de applicatie worden geladen om op elk moment met dezelfde beeldparameters te blijven werken (bijv. wanneer de camera plotseling wordt uitgeschakeld of om dezelfde instellingen opnieuw te gebruiken, de insteltijd te verkorten en de experimentele omstandigheden te homogeniseren). Als de camera op een bepaald moment vastloopt tussen video's, stopt u met opnemen, sluit u de camera af en schakelt u deze uit. Schakel het weer in, laad de cameraparameters opnieuw door naar Bestand te gaan > Laadparameters > Naar bestand en start de opname opnieuw. Controleer of de huidige video volledig is verkregen om de vis weg te gooien of te herhalen (geef de dieren wat tijd om opnieuw te acclimatiseren voordat u ze herhaalt). - Herhaal deze procedure voor het instellen van de camera (stappen 3.1-3.5) op alle camera's.
- Wanneer alle camera's correct zijn geconfigureerd, opent u Videoreeks opnemen.
- Selecteer Maken om het als een nieuw videobestand op te slaan, selecteer de experimentmap die onlangs is gemaakt en vermeld in de naam van het videobestand de informatie van het onderwerp, het type experiment en de datum.
- Selecteer Max. Frames. Typ 10800 in de framedoos. Standaard video neemt 6 minuten op (Video 1) met 30 fps in AVI-formaat; Daarom 6 min x 60 s x 30 fps= 10800 frames in totaal.
- Selecteer Framesnelheid berekenen of geef de framesnelheid handmatig aan (opnamesnelheid: 30 fps).
- Herhaal de procedure voor het maken van videobestanden op alle computers.
- Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van elke experimentele tank. Alle tests worden in één keer uitgevoerd.
- Start de records snel door op Record te klikken en wacht tot het maximale aantal gevraagde frames is verkregen (stap 3.10).
- Zodra de video's zijn opgenomen, verschijnt er een chatbox met de boodschap Maximaal aantal frames bereikt!. Selecteer Accepteren.
- Selecteer Sluiten om de opname te beëindigen en het videobestand te sluiten.
- Verwijder de vissen die zojuist zijn waargenomen. Zorg ervoor dat je ze scheidt van de naïeve vissen.
- Selecteer direct Maken en herhaal het proces om door te gaan met het opnemen van video's.
- Zodra alle opnamen zijn voltooid, selecteert u Afsluiten.
- Om de camera's uit te schakelen, selecteert u Camera sluiten en het programma afsluiten .
4. Analyse van opgenomen video's
- Start de analysesoftware (zie Tabel met materialen).
- Om een nieuwe sjabloon uit te werken, klikt u op Nieuw van sjabloon > een vooraf gedefinieerde sjabloon toegepast > van videobestand en selecteert u een video om te beginnen met het instellen van de sjabloon. Probeer een representatieve video van het experiment te kiezen met een proefpersoon die een goede mobiliteit en goede opnameomstandigheden vertoont.
- Configureer in Parameters de parameters in de volgende vensters (1 tot 4/7). Selecteer het model Fish > Adult Zebrafish, de arena Open Field Square > One Arena, het aantal Subject per Arena (voor de ST is een multi tracking pakket [volg verschillende onderwerpen in één arena] vereist), het type Detectie door Center-Point en pas tot slot de framerate aan naar 30 fps. Wijzig in de volgende vensters (5 tot 7/7) geen parameters; standaardconfiguratie is OK.
- Geef het experiment een naam als sjabloon en plaats het in dezelfde map als de rest van de opgeslagen video. De sjabloon wordt gemaakt als een experimentmap met verschillende onderverdelingen die alle instellingsinformatie bevatten.
- Controleer onder Experimentinstellingen de gedefinieerde instellingen (van videobestand, arena, aantal onderwerpen, frame per seconde). Hier kunnen de systeemeenheden worden gewijzigd.
- Klik onder Arena-instellingen met de rechtermuisknop op het midden van het scherm en selecteer Grijpen. Van Bestand in het display. Kies een videobeeld van goede kwaliteit en accepteer om dit beeld vast te leggen voor de achtergrondinstellingen. Kalibreer eerst de afbeelding en genereer een gekalibreerde regel. Gebruik de breedte van de tank als schaal (19 cm). Teken vervolgens de arena. Zorg ervoor dat u het vierkant net genoeg maakt om de reflecties van het dier te voorkomen wanneer het het oppervlak nadert of eventuele verwarring van de vissoftware met de zwarte gebieden van het aquarium. Teken ten slotte de vormzones met de functie Kader .
- Verdeel voor NTT en ST de voorkant van de tank in twee gelijke virtuele zones, boven en onder (zie afbeelding 1). Teken twee gelijke horizontale vakken. Dozen bestrijken een halve arena voor elk. Geef de boven- en onderkant een naam voor respectievelijk de bovenste en onderste zones. Zorg ervoor dat de vakken dezelfde breedte (9-10 cm) en lengte (8-9 cm) hebben, de grenzen van de arena (oranje vierkant) niet overschrijden en elkaar niet overlappen, en controleer of elke pijlzone precies zijn zones aangeeft.
- Voor SPT verdeel je de experimentele arena conceptueel in drie zones van gelijke grootte: leeg, gecentreerd en conspecifiek (zie figuur 1). Teken drie gelijke verticale vakken. Noem de doos die op de ondieptetank is georiënteerd als Conspecifiek, de doos die op de lege tank is georiënteerd als Leeg en de middelste als Midden. Zorg ervoor dat de dozen dezelfde breedte (6 cm) en lengte (18-19 cm) hebben, de arenalimieten niet overschrijden en elkaar niet overlappen.
- Controleer onder Detectie-instellingen welke video moet worden behandeld in het videobestand. Controleer vervolgens de detectiekwaliteit (vis in geel, rood middelpunt). Klik op Auto Detect om de detectie aan te passen en het dier opnieuw scherp te stellen (kies een afbeelding waarin het dier zwemt profiel op de witte achtergrond, teken de foto door zijn hele lichaam te nemen en valideer de detectie met Ja). Open Geavanceerd om de detectie te verbeteren door Dynamisch aftrekken, Donkerder onderwerp, Achtergrondinstellingen, Achtergrondonderwijs, Onderwerpgrootte, Ruisonderdrukking, enz. te selecteren.
- Plaats onder Proefversie-instellingen één proefversie en verwijder de andere (klik met de rechtermuisknop en verwijder)
- Maak onder Gegevensinstellingen dialoogvensters voor resultaten. Parametriseren van resultaten per tijd en per zone. Maak bijvoorbeeld een resultatenvenster voor gegevensuitvoer in minuten en een ander venster voor gegevensuitvoer op basis van totale tijd (6 minuten). Vraag de gegevensuitvoer voor elke zone op (vraag deze aan als de afstand in elke zone nodig is). Koppel de verschillende resultatenvensters met pijlen aan het startvenster.
- Selecteer onder Analyse-instellingen de parameters die u wilt analyseren en het type statistieken voor elke parameter. Deze parameters worden automatisch berekend op basis van de gegevens die uit de tracking zijn verkregen.
- Selecteer voor NTT en SPT de opties zoals hieronder gedefinieerd:
- Selecteer Verplaatste afstand (selecteer Totaal) om de afgelegde afstand in de arena (cm) en de afgelegde afstand in de respectievelijke zones (cm) te verkrijgen.
- Selecteer In Zones (selecteer Zones, Frequentie, Cumulatief en Latentie tot eerst) om de tijd die in de zone(s) wordt doorgebracht en de latentie tot de eerste toegang in de zone(s) weer te geven.
- Selecteer Zoneovergang (selecteer Drempel: 0 cm, Zone 1 toevoegen > Zone 2; Zone 2 > Zone 1, in alle zones, Frequentie) om het aantal ingangen in de zones te verkrijgen.
- Selecteer Mobility Sate (vul in Hoog mobiel boven 70%, Immobiel onder 3%, minimaal 150 frames en selecteer frequentie, cumulatief en latentie eerst) om de duur van hypermobiliteit (s), de duur van bevriezing (s) te hebben.
OPMERKING: Zie de sectie Discussie voor meer informatie over de benadering van bevriezingsgedrag met behulp van de geautomatiseerde analyse en het aantal en de duur(len) van bevriezingsepisodes. - Selecteer Versnelling en draaihoek (selecteer frequentie en cumulatief) om het optreden van complex gedrag te evalueren, zoals darten en grillige (snelle acceleratiebewegingen).
- Selecteer voor de ST, naast de bovenstaande verkennende parameters, de optie Afstand tussen onderwerpen (selecteer alle onderwerpen, gemiddelde, maximum, minimum) om de gemiddelde afstand tussen vissen (cm), de gemiddelde afstand tussen de dichtstbijzijnde buur (cm) en de gemiddelde afstand tussen de verste buur te krijgen.
- Selecteer voor NTT en SPT de opties zoals hieronder gedefinieerd:
- De sjabloon is klaar voor gebruik. Sla de laatste wijzigingen op en sluit de sjabloon zonder gegevens uit de video te halen (onderhoud het sjabloonbestand; het is licht en gemakkelijk te beheren en te kopiëren). Als er meerdere softwarelicenties zijn, analyseert u de video's van dezelfde sjabloon die naar elke computer is gekopieerd.
- Om de sjabloon te kopiëren en te gebruiken, zijn er twee opties:
- Open het sjabloonbestand met de gedragsanalysesoftware, ga naar Bestand > Opslaan als om een nieuw identiek bestand te maken.
- Selecteer in de welkomstinterface Nieuw van sjabloon > Een aangepaste sjabloon toegepast > van videobestand (kies sjabloon. EthXV-bestand). Geef het nieuwe experiment een naam en selecteer de locatie. Het kan enkele minuten duren voordat de software de informatie uit het sjabloonbestand heeft gekopieerd.
- Ga naar Arena-instellingen om de sjabloon opnieuw aan te passen als de video met een andere camera is opgenomen (volg stap 4.6 en 4.7).
- Ga naar Detectie-instellingen of Acquisitie om te controleren welke video is geselecteerd en wijzig indien nodig het videobestand.
- Selecteer onder Acquisitie de optie DDS > Klaar om te beginnen. Het kan enkele minuten duren voordat de software de video heeft verwerkt.
- Wanneer de acquisitie is voltooid, gaat u naar Track Editor. Selecteer versnelling x16 om de verwerkte video sneller te lezen en controleer of de tracking correct is.
OPMERKING: Soms kunnen er "verliezen" zijn in de tracking (als gevolg van reflecties of verwarring van de software zelf). Ze kunnen handmatig vanuit dit deel worden bewerkt als er maar weinig zijn; Anders verdient het de voorkeur om het hele experiment opnieuw te verwerken, waardoor de definitie van het canvas en de detectie worden verbeterd. - Klik onder Statistieken op Gegevens berekenen > exporteren. Het exporteren van gegevens bevindt zich rechtstreeks in de experimentmap.
- Genereer en exporteer onder Trackvisualisatie of Heatmaps (klik met de rechtermuisknop, exporteer afbeelding, selecteer de map Bestanden exporteren van het experiment om deze gegevens op te slaan met het spreadsheetrapport) trackingafbeeldingen van het dier.
- Ga naar Bestand om het actieve experiment te sluiten en herhaal deze procedure voor de volgende video.
5. Statistische analyse
- Analyseer de normaliteit (Shapiro-Wilk-test) van gegevens in elke groep.
- Beoordeel homoscedasticiteit met de test van Levene.
- Gebruik eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstests van Dunnett en Tukey om verschillen tussen groepen te testen wanneer criteria van normaliteit en homoscedasticiteit niet kunnen worden afgewezen.
- Gebruik de Kruskal-Wallis-test gevolgd door een paarsgewijze vergelijking met behulp van de Bonferroni-correctie om verschillen tussen groepen te testen wanneer criteria van normaliteit en homoscedasticiteit worden afgewezen.
- Plot de gegevens met grafische software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze sectie zullen we kijken naar enkele mogelijke toepassingen van deze gedragshulpmiddelen in de neurotoxicologie van vissen. De volgende resultaten komen overeen met de karakterisering van de acute of binge-effecten van methamfetamine (METH), een recreatieve drug, en de subchronische effecten van glyfosaat, een van de belangrijkste herbiciden die in aquatische ecosystemen worden aangetroffen.
Karakterisering van een methamfetamine binge neurotoxiciteitsmodel in volwassen zebravissen
Bij de evaluatie van het effect van 40 mg/l METH op NTT (figuur 3) bevestigde de Kruskal-Wallis-test dat de blootgestelde dieren een positieve geotaxis vertoonden, gekenmerkt door een afname van de exploratietijd in de bovenste zone van de experimentele tank (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), evenals in de afgelegde afstand in dit deel (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8), en in het aantal bezoeken (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). We zagen ook een significante toename van de latentietijd voorafgaand aan het eerste bezoek aan de bovenste zone (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Het is belangrijk op te merken dat de waargenomen verschillen in de parameters gemeten in de NTT na blootstelling aan METH consistent zijn in de tijd, zoals bevestigd door de Bonferroni-correctie (P > 0,8). Er werd een significant effect van de blootstellingstijd gevonden voor het bevriezingsgedrag (H(2) = 13,120, P = 0,0014).
Figuur 3: Angstachtig gedrag beoordeeld in standaard 6-min nieuwe tanktest (NTT) van volwassen zebravissen blootgesteld aan 40 mg/L methamfetamine (METH) gedurende 3 uur en 48 uur. Gegevens van elk experiment werden genormaliseerd naar de overeenkomstige controlewaarden. De gecombineerde gegevens worden gerapporteerd als een spreidingsdiagram met de mediaan (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis-test met Bonferroni-correctie voor NTT-eindpunten. Gegevens van 2 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Bedrossiantz et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bevriezingsbewegingen kunnen worden gekwantificeerd door de frequentie, latentie, duur of locatie van bevriezing te beoordelen. De beste manier om ze te scoren is ongetwijfeld het oog van een ervaren waarnemer, wat behoorlijk omslachtig en complex is, dus hebben we een geautomatiseerd alternatief geprobeerd met behulp van EthoVision-software om bevriezingsgedrag te detecteren19. We ontdekten dat het aantal, de latentie en de duur van bevriezingsaanvallen berekend door de software (Tabel 1A) met goede nauwkeurigheid correleren met de afleveringen die handmatig door de waarnemer worden gescoord (Tabel 1B). Waar de twee methoden qua resultaten gelijkwaardig zijn (P = 0,958, Student's test), hebben we hier de geautomatiseerde aanpak gebruikt om de bevriezing te beoordelen. Na 3 uur blootstelling aan meth nam de vriestijd significant toe (P = 0,0012), terwijl er na 48 uur blootstelling geen verschil werd gevonden met de controlegroep (P = 0,16). METH had op geen van beide momenten effect op onregelmatige bewegingen.
We gebruikten twee experimentele paradigma's om de effecten op sociaal gedrag na acute blootstelling aan METH te evalueren. De ST (Figuur 4) liet zien dat de gemiddelde afstand en de verste afstand tussen individuen significant groter waren voor met METH behandelde vissen (H(2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 voor respectievelijk gemiddelde en verste intervisafstanden), wat wijst op een gedragsfenotype van sociaal isolement. Ook hier merken we op dat er geen tijdseffect werd gevonden met behulp van de Bonferroni post hoc test (P > 0,5).
Figuur 4: Sociaal gedrag van volwassen zebravissen die in het water zijn blootgesteld aan 40 mg/L methamfetamine (METH) gedurende 3 uur en 48 uur. Resultaten van de ondieptetest (ST), inclusief de gemiddelde en de verste afstanden tussen de vissen. De gecombineerde gegevens worden gerapporteerd als een spreidingsdiagram met de mediaan (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis-test met Bonferroni-correctie. Gegevens van 2 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Bedrossiantz et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de SPT (figuur 5) vertonen behandelde vissen een significante afname van de tijd die ze in de conspecifieke zone doorbrengen en de afgelegde afstand (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 voor respectievelijk de tijd die in de conspecifieke zone wordt doorgebracht en de afgelegde afstand). Deze resultaten bevestigen opnieuw het fenotype van sociaal isolement dat door de TS-resultaten wordt gesuggereerd. Tukey's Honest Significant Difference (HSD) post hoc test sloot geen mogelijke verschillen tussen de twee analysetijden uit (P > 0,5).
Figuur 5: Sociaal gedrag van volwassen zebravissen die in het water zijn blootgesteld aan 40 mg/L methamfetamine (METH) gedurende 3 uur en 48 uur. De resultaten van de sociale voorkeurstest (SPT), inclusief tijd en afstand van de vissen in elk van de drie virtuele zones van de experimentele tank: leeg, midden en conspecifiek. Gegevens van elk experiment werden genormaliseerd naar de overeenkomstige controlewaarden. De gecombineerde gegevens worden gerapporteerd als een spreidingsdiagram met de mediaan (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Gegevens van 2 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Bedrossiantz et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gedragseffect van subchronische blootstelling aan omgevingsniveaus van glyfosaat
Gedragsanalyse van de effecten van subchronische blootstelling aan 3 μg/L glyfosaat op de NTT (figuur 6) laat een significante afname zien van de tijd die wordt besteed aan het verkennen van de top (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), de afgelegde afstand in dit deel (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) en het aantal bezoeken (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Deze effecten zijn kenmerkend voor positief geotaxisgedrag, net als het verhoogde effect dat wordt waargenomen op de latentietijd voorafgaand aan het eerste bezoek aan de top van de tank (H(2) = 9,628, P = 0,008). De expressie van grillig en bevriezingsgedrag van de blootgestelde dieren werd ook geanalyseerd in de NTT. De duur (H(2) = 17,261, P = 0,025) en het aantal grillige episodes (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) werden significant verlengd door glyfosaat. Daarentegen werden er geen bevriezingsverschillen gevonden met de controle (Pearson Chi-kwadraat(2) = 2,964, P = 0,253). Toegepast op een ecologische context, suggereren de waarnemingen van NTT dat glyfosaat het verkennende gedrag van vissen aanzienlijk zou kunnen verminderen, waardoor hun vermogen om in het wild te overleven in gevaar komt.
Figuur 6: Angstachtig gedrag beoordeeld in standaard 6-min nieuwe tanktest (NTT) van volwassen zebravissen blootgesteld aan 0,3 μg/L en 3 μg/L glyfosaat gedurende 2 weken. Gedragsparameters geanalyseerd, evenals een cartoon van de experimentele tank verdeeld in twee gelijke virtuele zones, boven en onder. Gegevens gerapporteerd als een spreidingsdiagram met de mediaan (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (Totale afstand, Afstand in de top, Tijd in de top, Overgangen naar de top, Grillige periodes, Hoge mobiliteitsfrequentie) of Kruskal Wallis-test met Bonferroni-correctie (Latentie naar de top, Grillige duur). Er werden geen verschillen (P > 0,05) gevonden in de bevriezingsduur en de bevriezingsperiodes. Gegevens van 2-4 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Faria et al.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Scholing, niet-gepolariseerde groepen soortgenoten die bij elkaar worden gehouden door sociale druk om zichzelf te beschermen tegen roofdieren, is een natuurlijke neiging van Danio rerio. De school kan "strakker" of "uitbreiden" afhankelijk van het niveau van angst of angst van de dieren, een bepaald visueel effect dat zeer gemakkelijk experimenteel te identificeren is (Figuur 7). In het glyfosaatexperiment onthulde de ondieptetest een toename van angst bij vissen die werden blootgesteld aan 3 μg/l, wat tot uiting kwam in een groepering van de school en dus een significante afname van de gemiddelde afstand en de verste afstand tussen individuen (F2,56 = 5,664, P = 0,006 en F2,56 = 7,413, P = 0,001, voor de gemiddelde en verste afstanden tussen vissen, respectievelijk) in vergelijking met de controlegroep.
Figuur 7: Sociaal gedrag van volwassen zebravissen die gedurende 2 weken zijn blootgesteld aan 0,3 μg/L en 3 μg/L glyfosaat. Gegevens gerapporteerd als spreidingsdiagram met de mediaan (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; eenrichtings-ANOVA met Dunnett's meervoudige vergelijkingstest (gemiddelde afstand tussen vissen en verste afstand) Gegevens van 2 tot 4 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Faria et al.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Een benadering van het bevriezingsgedrag met behulp van een geautomatiseerde analyse. De gegevens in deze tabel zijn afkomstig van dezelfde opname (video 1) die met twee verschillende methoden is geanalyseerd. (A) Benadering van het bevriezingsgedrag door geautomatiseerde berekening met EthoVision V13-software. De variabele mobiliteit wordt berekend op basis van de verandering van het vakgebied tussen twee steekproeven, dus afhankelijk van de acquisitiefrequentie van dit gebied. We hebben een zeer lage drempel van immobiliteit (minder dan 3% mobiliteit) en de samplefrequentie ingesteld op een minimale continue tijd van 5 s (meer dan 150 frames). (B) Analyse van bevriezingsgedrag met Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, gratis en open-source software). BORIS is software voor het loggen van gebeurtenissen voor videocodering en live observaties. Met BORIS kan de waarnemer de bevriezingsepisode coderen als een statusgebeurtenis, waarbij het begin- en eindpunt worden gedefinieerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Video 1: Controlevissen in de nieuwe tanktest. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kenmerkend angstgedrag dat bij NTT is waargenomen, is positief gecorreleerd met serotoninespiegels die in de hersenen zijn geanalyseerd21. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan para-chloorfenylalanine (PCPA), een remmer van 5-HT biosynthese, vertoonden vissen positieve geotaxis en verlaagde 5-HT-niveaus in de hersenen22, resultaten die sterk lijken op die verkregen met METH. Daarom suggereert de afname van de serotoninespiegels in de hersenen en de weergave van positieve geotaxis in aan METH blootgestelde zebravissen dat het angstgedrag dat door het medicijn wordt geproduceerd, wordt gemedieerd door de serotonerge route. Interessant is dat een vergelijkbaar gedragsfenotype, d.w.z. een anxiogeen effect op geotaxis, kan worden waargenomen bij volwassen zebravissen die gedurende 2 weken worden blootgesteld aan 0,3 3 μg/L en 3 μg/L, twee milieurelevante concentraties van glyfosaat. Eerder werd ook een toename van geotaxis gemeld voor volwassen zebravissen met de neurotoxische stof acrylamide 6,23. In al deze gevallen werd dit gedragsfenotype (een toename van geotaxis in de NTT, kenmerkend voor anxiogene stof) geassocieerd met de afname van monoaminerge neurotransmitterniveaus. Daarom biedt het NTT-paradigma in combinatie met neurochemische analyse van de hersenen ecologisch relevante informatie, verkennend gedrag en foerageerefficiëntie en verbindt het gedragsneurofenotypes met neurotransmittermodulaties.
Aan de andere kant werd ook een verslechtering van sociaal gedrag waargenomen in beide assays, de ST en SPT, bij met METH behandelde vissen. Het resultaat dat in deze studie is verkregen, komt overeen met verschillende onderzoeken met ratten en apen, waarbij de acute en chronische blootstelling van de onderzoeksdieren aan METH resulteert in sociale terugtrekking24. Sociale gedragsveranderingen die verband houden met METH-misbruik zijn bij mensen verklaard door stoornissen in de sociaal-cognitieve functie24. Een anxiogene effect op de ondiepte werd gevonden bij zebravissen die gedurende 2 weken werden blootgesteld aan 3 μg/L glyfosaat. We hebben een fenokopie van dit effect waargenomen bij zebravissen die gedurende 3 dagen werden blootgesteld aan 53 mg/L (0,75 mM) acrylamide 6,23.
De NTT-, ST- en SPT-assays maken het mogelijk om de potentiële neurotoxische effecten25 van een breed scala aan chemicaliën effectief te bepalen, zoals geïllustreerd door de studie van acute methamfetamine- en subchronische glyfosaattoxiciteitsmodellen in volwassen zebravissen. Gedrag is in de toxicologie een relevant apicaal eindpunt, dat de effecten op organismale niveaus van een chemische stof voor neurotoxiciteit en milieuonderzoek karakteriseert. Behalve dat het een subletaal eindpunt is in laboratoriumomstandigheden, kunnen gedragsveranderingen, zoals verkennend of sociaal gedrag, schadelijk van aard zijn. Bovendien is de voorgestelde gedragsanalysebatterij een eenvoudig te implementeren, semi-geautomatiseerde methode11 en daarom zeer efficiënt als de assays bewust worden gepland (reductieprincipe)26. Het uitvoeren van deze tests als een testbatterij met behulp van een enkele tank vermindert het aantal dieren en de experimentele tijd en afvalproductie.
De volgorde van de assays in de batterij is een belangrijke overweging als we het responsprofiel van een individu in elke studie willen bestuderen. Voor dit doel maakt het uitvoeren van de gevolgde individuele tests (zie figuur 2) het mogelijk om het dier geïdentificeerd te houden en zijn verkennend gedrag te relateren aan zijn sociale voorkeur. Bovendien kunnen de gedragsreacties van het dier in verband worden gebracht met andere biologische gegevens, zoals het neurotransmitterprofiel of de genexpressie, als de vissen worden geïdentificeerd tot het eindpunt van de bemonstering (figuur 2A).
Gewoonlijk maakt gedragsanalyse het mogelijk om verschillen tussen groepen waar te nemen. Eerst worden individuele antwoorden berekend op basis van het volgen van dieren27 voordat de gegevens per groep worden gepoold. Vervolgens worden de gemiddelden en het verschil in variantie ten opzichte van de controlegroep vergeleken voor elke berekende gedragsparameter. Bij ondiepteanalyse12 is het van cruciaal belang om heel duidelijk te zijn dat de variantie-eenheid de groep testvissen is, niet individuele vissen, omdat het gedrag van elke individuele vis wordt beïnvloed door de andere vissen in de school. Dit is de manier die in de meeste papers wordt gebruikt om gedragsgegevens te verwerken28. Het kan echter nuttig zijn om de analyse van gedragsparameters niet per parameter te heroverwegen, maar als een algemene respons per onderzoek. Men zou bijvoorbeeld de covariantie van elke meting in een proef kunnen berekenen en deze kunnen rapporteren als een andere manier om hetzelfde te meten: angstig, verkennend of kuddegedrag. Er zijn veel manieren om gedragsgegevens te berekenen en te interpreteren28,29. Afhankelijk van het aantal omstandigheden, het type tests en de beeldacquisitie (2D of 3D)30,31 kan de analyse volledig worden heroverwogen om het beste uit de gegevens te halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door "Agencia Estatal de Investigación" van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en Innovatie (project PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz werd ondersteund door een doctoraatsbeurs (PRE2018-083513) medegefinancierd door de Spaanse regering en het Europees Sociaal Fonds (ESF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
- Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
- Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
