Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

वयस्क डैनियो रेरियो में न्यूरोटॉक्सिसिटी आकलन एक टैंक में व्यवहार परीक्षणों की बैटरी का उपयोग करना

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

यहां, हम एक टैंक का उपयोग करके वयस्क जेब्राफिश पर रसायनों (जैसे, मेथामफेटामाइन और ग्लाइफोसेट) के संभावित न्यूरोटॉक्सिक प्रभावों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए उपन्यास टैंक, शोलिंग और सामाजिक वरीयता परीक्षणों सहित एक व्यापक व्यवहार परीक्षण बैटरी प्रस्तुत करते हैं। यह विधि न्यूरोटॉक्सिसिटी और पर्यावरण अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है।

Abstract

न्यूरोपैथोलॉजिकल प्रभावों की उपस्थिति, कई वर्षों तक, एक रासायनिक पदार्थ की न्यूरोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए मुख्य समापन बिंदु साबित हुई। हालांकि, पिछले 50 वर्षों में, मॉडल प्रजातियों के व्यवहार पर रसायनों के प्रभावों की सक्रिय रूप से जांच की गई है। उत्तरोत्तर व्यवहार समापन बिंदुओं को न्यूरोटॉक्सिकोलॉजिकल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था, और इन कार्यात्मक परिणामों को अब नियमित रूप से रसायनों की संभावित न्यूरोटॉक्सिसिटी की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। वयस्क ज़ेब्राफिश में व्यवहार परख चिंता, सामाजिक संपर्क, सीखने, स्मृति और लत सहित व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत और विश्वसनीय साधन प्रदान करते हैं। वयस्क जेब्राफिश में व्यवहार परख में आमतौर पर मछली को एक प्रयोगात्मक क्षेत्र में रखना और वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनके व्यवहार की रिकॉर्डिंग और विश्लेषण करना शामिल होता है। मछली को विभिन्न उत्तेजनाओं से अवगत कराया जा सकता है, और विभिन्न प्रकार के मैट्रिक्स का उपयोग करके उनके व्यवहार को निर्धारित किया जा सकता है। उपन्यास टैंक परीक्षण मछली में चिंता जैसे व्यवहार का अध्ययन करने के लिए सबसे स्वीकृत और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले परीक्षणों में से एक है। शोलिंग और सामाजिक वरीयता परीक्षण ज़ेब्राफिश के सामाजिक व्यवहार का अध्ययन करने में उपयोगी हैं। यह परख विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि पूरे शोल के व्यवहार का अध्ययन किया जाता है। ये परखें औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील साबित हुई हैं, जिससे उन्हें तंत्रिका सर्किट और आणविक तंत्र अंतर्निहित व्यवहार का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण बना दिया गया है। इसके अतिरिक्त, इन परखों का उपयोग दवा स्क्रीनिंग में यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो व्यवहार के संभावित मॉड्यूलेटर हो सकते हैं।

हम इस काम में दिखाएंगे कि मछली न्यूरोटॉक्सिकोलॉजी में व्यवहार उपकरण कैसे लागू करें, मेथेम्फेटामाइन, एक मनोरंजक दवा, और ग्लाइफोसेट, एक पर्यावरण प्रदूषक के प्रभाव का विश्लेषण करें। परिणाम पर्यावरण प्रदूषकों और दवाओं के न्यूरोटॉक्सिकोलॉजिकल प्रभावों की समझ के लिए वयस्क ज़ेब्राफिश में व्यवहार परख के महत्वपूर्ण योगदान को प्रदर्शित करते हैं, इसके अलावा आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो न्यूरोनल फ़ंक्शन को बदल सकते हैं।

Introduction

ज़ेब्राफिश (डैनियो रेरियो) इकोटॉक्सिकोलॉजी, ड्रग डिस्कवरी और सुरक्षा फार्माकोलॉजी अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल कशेरुक प्रजाति है। इसकी कम लागत, अच्छी तरह से स्थापित आणविक आनुवंशिक उपकरण, और तंत्रिका तंत्र के मोर्फोजेनेसिस और रखरखाव में शामिल प्रमुख शारीरिक प्रक्रियाओं का संरक्षण ज़ेब्राफिश को न्यूरोसाइंस अनुसंधान के लिए एक आदर्श पशु मॉडल बनाता है, जिसमें न्यूरोबिहेवियरल टॉक्सिकोलॉजी 1,2 शामिल है। एक रसायन की न्यूरोटॉक्सिसिटी के मूल्यांकन के लिए मुख्य समापन बिंदु, हाल ही में, न्यूरोपैथोलॉजिकल प्रभावों की उपस्थिति थी। हाल ही में, हालांकि, व्यवहार समापन बिंदुओं को न्यूरोटॉक्सिकोलॉजिकल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है, और इन कार्यात्मक परिणामों को अब आमतौर पर रसायनों 3,4 की संभावित न्यूरोटॉक्सिसिटी की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, व्यवहार समापन बिंदु पारिस्थितिक दृष्टिकोण से अत्यधिक प्रासंगिक हैं, क्योंकि मछली में एक बहुत ही हल्का व्यवहार परिवर्तनप्राकृतिक परिस्थितियों में जानवर के अस्तित्व को खतरे में डाल सकता है।

वयस्क जेब्राफिश अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले व्यवहार परखों में से एक उपन्यास टैंक परीक्षण (एनटीटी) है, जो चिंता जैसे व्यवहार 6,7 को मापता है। इस परख में, मछली को नवीनता से अवगत कराया जाता है (मछली को एक अपरिचित टैंक में रखा जाता है), एक हल्का प्रतिकूल उत्तेजना और उनकी व्यवहार प्रतिक्रियाएं देखी जाती हैं। एनटीटी का उपयोग मुख्य रूप से बेसल लोकोमोटर गतिविधि, जियोटैक्सिस, ठंड और मछली के अनियमित आंदोलनों का आकलन करने के लिए किया जाता है। अनियमित8 को दिशा के अचानक परिवर्तन (ज़िगज़ैगिंग) और त्वरण (डार्टिंग) के बार-बार एपिसोड की विशेषता है। यह एक अलार्म प्रतिक्रिया है और आमतौर पर ठंड एपिसोड से पहले या बाद में मनाया जाता है। बर्फ़ीली व्यवहार टैंक के तल पर मछली के आंदोलनों (ऑपरेकुलर और ओकुलर आंदोलनों को छोड़कर) की पूरी समाप्ति से मेल खाती है, जैसा कि बेहोश करने की क्रिया के कारण गतिहीनता से अलग है, जो हाइपोलोकोमोशन, अकिनेसिया और डूबने का कारण बनता है8. फ्रीजिंग आमतौर पर तनाव और चिंता की उच्च स्थिति से संबंधित है और विनम्र व्यवहार का भी हिस्सा है। जटिल व्यवहार जानवरों की चिंता की स्थिति के उत्कृष्ट संकेतक हैं। एनटीटी को औषधीय और आनुवंशिक हेरफेर9 के प्रति संवेदनशील दिखाया गया है, जिससे यह चिंता और संबंधित विकारों के तंत्रिका आधार का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गया है।

ज़ेब्राफिश एक अत्यधिक सामाजिक प्रजाति है, इसलिए हम सामाजिक व्यवहारों की एक विस्तृत श्रृंखला को माप सकते हैं। शोलिंग टेस्ट (एसटी) और सामाजिक वरीयता परीक्षण (एसपीटी) सामाजिक व्यवहार10 का आकलन करने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले परख हैं। एसटी मछली की स्थानिक व्यवहार और आंदोलन पैटर्न को निर्धारित करके एक साथ समूहबनाने की प्रवृत्ति को मापता है। अनुसूचित जनजाति समूह की गतिशीलता, नेतृत्व, सामाजिक शिक्षा, और कई मछली प्रजातियों12 के सामाजिक व्यवहार को समझने के अध्ययन के लिए उपयोगी है. वयस्क ज़ेब्राफिश में एसपीटी चूहों13 के लिए सामाजिक नवीनता परीक्षण के लिए क्रॉली की प्राथमिकता से अनुकूलित किया गया था और जल्दी से इस मॉडल प्रजातियों14 में सामाजिक संपर्क के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय व्यवहार परख बन गया। इन दो परीक्षणों को दवा स्क्रीनिंग परख में उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया गया है और सामाजिक व्यवहार15,16 को संशोधित करने वाले उपन्यास यौगिकों की पहचान करने के लिए वादा दिखाया है।

सामान्य में, वयस्क zebrafish में व्यवहार assays शक्तिशाली उपकरण है कि व्यवहार तंत्र या सक्रिय यौगिकों और दुरुपयोग दवाओं17 के neurophenotypes पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं. यह प्रोटोकॉल विवरण देता है कि बुनियादी भौतिक संसाधनों के साथ इन व्यवहार उपकरणों7 को कैसे लागू किया जाए और न्यूरोएक्टिव यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रभावों को चिह्नित करने के लिए विषाक्तता परख में उन्हें कैसे लागू किया जाए। इसके अलावा, हम देखेंगे कि एक न्यूरोएक्टिव यौगिक (मेथैम्फेटामाइन) के तीव्र जोखिम के न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का आकलन करने के लिए एक ही परीक्षण लागू किया जा सकता है, लेकिन एक कीटनाशक (ग्लाइफोसेट) के पर्यावरणीय सांद्रता के पुराने जोखिम के बाद इन प्रभावों को चिह्नित करने के लिए भी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नैतिक मानकों के साथ सख्त अनुपालन प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले ज़ेब्राफिश के कल्याण और उचित उपचार की गारंटी देता है। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के तहत किया गया (सीआईडी-सीएसआईसी). नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल और परिणाम स्थानीय सरकार (समझौता संख्या 11336) द्वारा दिए गए लाइसेंस के तहत किए गए थे।

1. व्यवहार परीक्षण के लिए पशु आवास

  1. 10:00 और 17:00 के बीच 27-28 डिग्री सेल्सियस पर एक अलग व्यवहार कक्ष में सभी परीक्षण ( चित्रा 1 में प्रस्तुत) करें।
  2. प्रयोगात्मक टैंक के किसी भी संभावित संदूषण से बचने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले स्वच्छ मछली के पानी [रिवर्स-ऑस्मोसिस शुद्ध पानी जिसमें 90 मिलीग्राम/एल एक्वैरियम सिस्टम नमक, 0.58 एमएम सीएएसओ4·2एच2हे, और 0.59 एमएम नाएचसीओ3] में कई बार नियंत्रण और उजागर मछली दोनों को धोएं।
  3. प्रयोगों शुरू करने से पहले व्यवहार कक्ष 1 घंटे के लिए जानवरों acclimate.
  4. सुनिश्चित करें कि जानवर (≈50:50 पुरुष: महिला अनुपात) प्रयोगात्मक रूप से भोले हैं और प्रयोगात्मक समूह से अनजान पर्यवेक्षकों के साथ अंधे तरीके से सभी व्यवहार परीक्षण करते हैं।
  5. व्यवहार परख में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, आदर्श रूप से दो या दो से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों के बीच प्राप्त की गई स्थिति (एन = 18) प्रति 18 विषयों की कुल संख्या है। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत परीक्षणों में, प्रति स्थिति 9 जानवरों के व्यवहार का विश्लेषण करें, प्रति प्रतिकृति। समूह परीक्षणों में, प्रति स्थिति 6 से 9 जानवरों के एक शोल के व्यवहार का विश्लेषण करें, प्रति प्रतिकृति।
  6. बैटरी परीक्षण दृष्टिकोण के बाद सभी परीक्षण करें ( चित्र 2 में नियोजन प्रस्ताव देखें)। नैतिक रूप से अधिक उपयुक्त, यह विधि अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने की अनुमति देती है, 3R कमी सिद्धांत7 का अनुपालन करती है।
  7. अधिकांश समय, व्यवहार परख जैविक परख से जुड़े होते हैं, इसलिए नमूने (ओएमआईसी या रसायन) एकत्र करने और विश्लेषण करने से पहले इच्छामृत्यु दिशानिर्देशों18 का पालन करने वाले जानवरों की बलि दें। यदि समापन बिंदु नमूना साबित नहीं होता है, तो प्रयोग के अंत में नियंत्रण समूह को फिर से स्थिर करें। कुछ दिनों के बाद प्रजनन या प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए नियंत्रण जानवरों का पुन: उपयोग करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप। वयस्क ज़ेब्राफिश में व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए वर्ग टैंक के तीन विन्यास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रायोगिक समयरेखा। व्यवहार परख की रिकॉर्डिंग के लिए दो नियोजन प्रस्ताव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. टैंक के प्रायोगिक विन्यास

  1. चिंता जैसा व्यवहार: उपन्यास टैंक टेस्ट (एनटीटी)
    1. एक साथ मछली की अधिकतम संख्या रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप (टैंक, कैमरा और कंप्यूटर की संख्या) को समायोजित करें। व्यक्तिगत व्यवहार परख समय लेने वाली हैं, इसलिए समय, सामग्री और स्थान का अनुकूलन करें।
    2. एनटीटी के लिए प्रयोगात्मक टैंक तैयार करें: विषयों के बीच प्रतिबिंब और हस्तक्षेप से बचने के लिए पार्श्व दीवारों और नीचे पर ऐक्रेलिक पैनलों के साथ कवर स्क्वायर टैंक (20 सेमी लंबाई, 20 सेमी चौड़ाई, 25 सेमी ऊंचाई)।
    3. 28 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से ऑक्सीजन युक्त मछली के पानी के 7 एल (पानी स्तंभ ऊंचाई: 20 सेमी ऊंचाई) के साथ प्रयोगात्मक टैंक भरें।
    4. विकृत छवि से बचने के लिए कैमरे के सामने टैंक की स्थिति को समायोजित करें।
    5. रोशनी सेटअप की जाँच करें। एलईडी बैकलाइट (10000 लक्स) अच्छी परिस्थितियों में वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए टैंक के सभी हिस्सों पर एक समरूप रोशनी प्रदान करते हैं।
    6. कैमरों को चालू करें और उन्हें अनुभाग 3 का पालन करते हुए समायोजित करें।
    7. जितनी जल्दी हो सके रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने से पहले प्रयोगात्मक टैंकों के तल में, विषयों को एक-एक करके पेश करें।
      नोट: टैंक के तल पर जानवर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करना महत्वपूर्ण है।
    8. ध्यान रखें कि रिकॉर्डिंग के दौरान जानवरों को परेशान न करें। न केवल टैंकों के बीच बल्कि समर्थन और बाहर के बीच दृश्य बातचीत को सीमित करने के लिए पर्दे या पैनल का उपयोग।
    9. रिकॉर्डिंग के अंत में (मानक रिकॉर्डिंग समय 6 मिनट है), जानवरों है कि पहले से ही एक और टैंक के लिए परीक्षण के माध्यम से पारित कर दिया है इतनी के रूप में उन्हें भोले जानवरों के साथ मिश्रण नहीं हस्तांतरण करें.
    10. सभी उपलब्ध विषयों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। व्यक्तिगत परीक्षणों (दो या अधिक स्वतंत्र प्रतिकृतियों से) में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रति शर्त 18 विषयों की कुल संख्या होना उचित है।
    11. किसी भी संभावित टैंक प्रभाव से बचने के लिए परीक्षणों के बीच प्रत्येक टैंक को सौंपे गए प्रयोगात्मक समूह को यादृच्छिक बनाएं (यदि आप एक ही समय में कई स्थितियों को रिकॉर्ड कर रहे हैं)।
  2. सामाजिक समूहीकृत व्यवहार: शोलिंग टेस्ट (एसटी)
    1. एसटी का प्रायोगिक विन्यास एनटीटी के समान है (समान टैंकों का सीधे पुन: उपयोग किया जा सकता है)।
    2. 2.1.1-2.1.6 चरणों का पालन करें। एसटी स्थापित करने के लिए।
    3. जितनी जल्दी हो सके रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने से पहले प्रयोगात्मक टैंकों के तल पर शोल (एक ही समय में 6 से 9 विषयों) का परिचय दें।
      नोट: टैंक के तल पर जानवर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करना महत्वपूर्ण है।
    4. 2.1.8-2.1.11 चरणों का पालन करें। एसटी प्रदर्शन करने के लिए।
    5. सभी उपलब्ध विषयों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। इस परख में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रतिकृति में एक ही बैंक आकार के साथ कम से कम दो स्वतंत्र प्रतिकृतियां बनाएं।
    6. सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए शोल के आकार को सुसंगत बनाए रखें और एक ही प्रयोग के अंदर दोहराएं।
  3. सामाजिक व्यक्तिगत व्यवहार: सामाजिक वरीयता परीक्षण (एसपीटी)
    1. प्रयोगात्मक स्थान और रिकॉर्डिंग के समय का अनुकूलन करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप समायोजित करें.
    2. एसपीटी के लिए प्रयोगात्मक टैंक तैयार करें: पार्श्व दृश्यता प्रदान करने के लिए स्क्वायर टैंक (20 सेमी लंबाई, 20 सेमी चौड़ाई, 25 सेमी ऊंचाई) पारदर्शी (ग्लास या प्लास्टिक)। एकल फोकल मछली एक विशिष्ट आभासी क्षेत्र के साथ बातचीत करने के लिए स्वतंत्र है - एक मछली का शोल एक तरफा बाहरी आवास टैंक में रखा जाता है, या अनिर्दिष्ट आभासी क्षेत्र के साथ - एक तरफा बाहरी खाली आवास टैंक।
    3. 28 डिग्री सेल्सियस पर स्वच्छ मछली के पानी के 5 एल (पानी स्तंभ ऊंचाई: 15 सेमी, बाहरी आवास टैंक में पानी के स्तंभ के समान ऊंचाई) के साथ प्रयोगात्मक टैंक भरें।
    4. विकृत छवि से बचने के लिए कैमरे के सामने टैंक की स्थिति को समायोजित करें।
    5. जांचें कि सिस्टम सजातीय प्रकाश प्राप्त करता है।
    6. विषयों का परिचय, एक के बाद एक, तुरंत केंद्र में नीचे जानवर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले प्रयोगात्मक टैंक के तल में.
    7. रिकॉर्डिंग के दौरान पर्यवेक्षकों और जानवरों के बीच दृश्य बातचीत से बचें.
    8. 6 मिनट रिकॉर्डिंग के अंत में, भोले जानवरों के साथ उन्हें मिश्रण करने के लिए नहीं इतनी के रूप में एक और टैंक के लिए वर्तमान जानवरों हस्तांतरण.
    9. सभी उपलब्ध विषयों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। व्यक्तिगत परीक्षणों में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रति शर्त 18 विषयों की कुल संख्या है (दो या अधिक स्वतंत्र प्रतिकृतियों से)।

3. व्यवहार परीक्षणों के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग

  1. प्रत्येक कंप्यूटर पर GigE कैमरे की उपलब्धता की जांच करने के लिए कैमरा मैनेजर खोलें।
  2. GigE कैमरा कंट्रोलिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें (जैसे uEye कॉकपिट, यहाँ वर्णित)। कैमरा विकल्प खोलें, मोनोक्रोम मोड चुनें, और छवि का आकार समायोजित करें (1:2)।
  3. कैमरा गुण खोलें
    1. कैमरा के अंतर्गत, पिक्सेल घड़ी को अधिकतम पर सेट करें, फ़्रेम दर को 30 फ़्रेम प्रति सेकंड (fps) पर सेट करें और एक्सपोज़र समायोजित करें (यदि छवि बहुत अधिक गहरी है तो स्वचालित या मैन्युअल रूप से समायोजित करें)।
    2. छवि के अंतर्गत, लाभ को 0 (ऑटो) और काले स्तरों पर सेट करें (ऑटो या मैनुअल एक अच्छा कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए समायोजित करें)।
    3. आकार के तहत, विंडो के आकार को उस क्षेत्र में समायोजित करें जिसे उत्कीर्ण करने की आवश्यकता है (चौड़ाई: चौड़ाई-बाएं, ऊंचाई: ऊंचाई-शीर्ष)। यह चरण छवि के आकार को कम करने की अनुमति देता है और इसलिए, वीडियो का अंतिम आकार।
    4. कैमरा गुण बंद करें।
  4. कैमरा सेटिंग्स और वीडियो को सहेजने के लिए प्रयोग सत्र के लिए एक सामान्य फ़ोल्डर बनाएं।
  5. कैमरा सेटिंग सेव करने के लिए, फ़ाइल > पैरामीटर सहेजें > To File सेट करें और हाल ही में बनाए गए प्रयोग फ़ोल्डर का चयन करें।
    नोट: कैमरा सेटिंग्स फ़ाइल इस प्रकार किसी भी समय एक ही छवि मापदंडों के साथ काम करना जारी रखने के लिए एप्लिकेशन में पुनः लोड किया जा सकता है (उदाहरण के लिए जब कैमरा अचानक बंद हो जाता है या समान सेटिंग्स का पुन: उपयोग करने के लिए, सेटअप समय को कम करता है और प्रयोगात्मक स्थितियों को समरूप करता है)। यदि, एक पल में, कैमरा वीडियो के बीच जम जाता है, तो रिकॉर्डिंग बंद कर दें, बाहर निकलें और कैमरा बंद कर दें। इसे वापस चालू करें, फ़ाइल > लोड पैरामीटर > टू फाइल, और रिकॉर्डिंग पुनः आरंभ करके कैमरा पैरामीटर पुनः लोड करें। जाँच करें कि क्या वर्तमान वीडियो मछली को त्यागने या दोहराने के लिए पूरी तरह से अधिग्रहित किया गया है (दोहराने से पहले, जानवरों को फिर से समायोजित करने के लिए कुछ समय दें)।
  6. सभी कैमरों पर इस कैमरा सेटअप प्रक्रिया (चरण 3.1-3.5) को दोहराएं।
  7. जब सभी कैमरे सही ढंग से कॉन्फ़िगर हो जाएं, तो वीडियो अनुक्रम रिकॉर्ड करें खोलें।
  8. एक नई वीडियो फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए बनाएँ का चयन करें, हाल ही में बनाए गए प्रयोग फ़ोल्डर का चयन करें, और वीडियो फ़ाइल के नाम पर विषय की जानकारी, प्रयोग के प्रकार और दिनांक की रिपोर्ट करें।
  9. अधिकतम फ़्रेम का चयन करें. फ़्रेम बॉक्स में 10800 टाइप करें। मानक वीडियो AVI प्रारूप में 30 fps पर 6 मिनट (वीडियो 1) रिकॉर्डिंग है; इसलिए, कुल 6 मिनट x 60 सेकंड x 30 एफपीएस = 10800 फ्रेम।
  10. फ्रेम दर का चयन करें या फ्रेम दर को मैन्युअल रूप से इंगित करें (रिकॉर्डिंग का वेग: 30 एफपीएस)।
  11. सभी कंप्यूटर्स पर वीडियो फ़ाइल निर्माण प्रक्रिया को दोहराएँ।
  12. प्रत्येक प्रयोगात्मक टैंक के तल पर, एक-एक करके विषयों का परिचय दें। सभी परख एक बार में चलाए जाएंगे।
  13. रिकॉर्ड पर क्लिक करके जल्दी से रिकॉर्ड शुरू करें और अनुरोधित फ्रेम (चरण 3.10) की अधिकतम संख्या प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  14. एक बार वीडियो रिकॉर्ड हो जाने के बाद, संदेश के साथ एक चैट बॉक्स दिखाई देता है फ्रेम की अधिकतम संख्या हासिल की!. स्वीकार करें चुनें.
  15. रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए बंद करें चुनें और वीडियो फ़ाइल बंद करें।
  16. उन मछलियों को हटा दें जिन्हें अभी देखा गया है। उन्हें भोली मछली से अलग करने के लिए सावधान रहें।
  17. सीधे बनाएं चुनें और वीडियो रिकॉर्ड करना जारी रखने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  18. एक बार सभी रिकॉर्डिंग हो जाने के बाद, बाहर निकलें चुनें।
  19. कैमरे बंद करने के लिए, कैमरा बंद करें चुनें और प्रोग्राम से बाहर निकलें ।

4. रिकॉर्ड किए गए वीडियो का विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. एक नए टेम्पलेट पर विस्तृत करने के लिए, टेम्पलेट से नया > वीडियो फ़ाइल से एक पूर्वनिर्धारित टेम्पलेट > लागू करें पर क्लिक करें, और टेम्पलेट सेट करना शुरू करने के लिए एक वीडियो का चयन करें। अच्छी गतिशीलता और रिकॉर्डिंग की अच्छी स्थितियों को प्रदर्शित करने वाले विषय के साथ प्रयोग का एक प्रतिनिधि वीडियो चुनने का प्रयास करें।
  3. पैरामीटर्स में, निम्न विंडो (1 से 4/7) में पैरामीटर कॉन्फ़िगर करें। मॉडल मछली > वयस्क ज़ेब्राफिश का चयन करें, अखाड़ा ओपन फील्ड स्क्वायर > वन एरिना, प्रति एरिना विषय की संख्या (एसटी के लिए, एक बहु ट्रैकिंग पैकेज [एक क्षेत्र में विभिन्न विषयों को ट्रैक करें] की आवश्यकता है), केंद्र-बिंदु द्वारा डिटेक्शन का प्रकार और अंत में फ्रेम दर को 30 एफपीएस तक समायोजित करें। निम्नलिखित विंडो (5 से 7/7) में, पैरामीटर न बदलें; डिफ़ॉल्ट कॉन्फ़िगरेशन ठीक है।
  4. प्रयोग को टेम्पलेट के रूप में नाम दें और इसे उसी फ़ोल्डर में रखें जिसमें शेष संग्रहीत वीडियो है। टेम्पलेट को एक प्रयोग फ़ोल्डर के रूप में बनाया जाएगा जिसमें कई उपखंड होंगे जिनमें सभी सेटअप जानकारी होगी।
  5. प्रयोग सेटिंग के अंतर्गत, निर्धारित सेटअप (वीडियो फ़ाइल, अखाड़ा, विषयों की संख्या, फ़्रेम प्रति सेकंड से) की जाँच करें. यहां, सिस्टम इकाइयों को संशोधित किया जा सकता है।
  6. एरिना सेटिंग्स के तहत, स्क्रीन के केंद्र पर राइट-क्लिक करें और ग्रैब चुनें। से file प्रदर्शन में। एक अच्छी गुणवत्ता वाली वीडियो छवि चुनें और पृष्ठभूमि सेटिंग्स के लिए इस छवि को कैप्चर करने के लिए स्वीकार करें। सबसे पहले, छवि को कैलिब्रेट करें, एक कैलिब्रेटेड नियम उत्पन्न करें। टैंक की चौड़ाई को पैमाने (19 सेमी) के रूप में उपयोग करें। फिर, अखाड़ा बनाएं। जानवर के प्रतिबिंबों से बचने के लिए वर्ग को पर्याप्त बनाने के लिए सावधान रहें जब उत्तरार्द्ध टैंक के काले क्षेत्रों के साथ सतह या मछली सॉफ्टवेयर के किसी भी अंतिम भ्रम के पास पहुंचता है। अंत में, फ़्रेम फ़ंक्शन के साथ आकृति क्षेत्र बनाएं।
    1. एनटीटी और एसटी के लिए, टैंक के सामने को दो बराबर आभासी क्षेत्रों, ऊपर और नीचे में विभाजित करें ( चित्र 1 देखें)। दो बराबर क्षैतिज बक्से ड्रा करें। बक्से प्रत्येक के लिए आधे क्षेत्र को कवर करते हैं। क्रमशः ऊपरी और निचले क्षेत्रों के लिए ऊपर और नीचे नाम दें। सावधान रहें कि बक्से में समान चौड़ाई (9-10 सेमी) और लंबाई (8-9 सेमी) है, अखाड़ा सीमाओं (नारंगी वर्ग) से अधिक नहीं है, और ओवरलैप न करें, यह जांचते हुए कि प्रत्येक तीर क्षेत्र बिल्कुल अपने क्षेत्रों को इंगित करता है।
    2. एसपीटी के लिए, प्रयोगात्मक क्षेत्र को अवधारणात्मक रूप से तीन समान आकार के क्षेत्रों में विभाजित करें: खाली, केंद्र और विशिष्ट ( चित्र 1 देखें)। तीन समान ऊर्ध्वाधर बक्से ड्राइए। शोल टैंक के लिए उन्मुख बॉक्स को विशिष्ट के रूप में नाम दें, खाली टैंक के लिए उन्मुख बॉक्स को खाली के रूप में, और मध्य वाले को केंद्र के रूप में नामित करें। सावधान रहें कि बक्से की चौड़ाई (6 सेमी) और लंबाई (18-19 सेमी) समान है, अखाड़ा सीमा से अधिक नहीं है, और ओवरलैप न करें।
  7. डिटेक्शन सेटिंग्स के अंतर्गत, सत्यापित करें कि वीडियो फ़ाइल में किस वीडियो को निपटाया जाना है। फिर, पता लगाने की गुणवत्ता (पीले, लाल केंद्र बिंदु में मछली) की जांच करें। पता लगाने को समायोजित करने के लिए ऑटो डिटेक्ट पर क्लिक करें, जानवर को फिर से फोकस करना (एक छवि चुनें कि जानवर सफेद पृष्ठभूमि पर प्रोफ़ाइल में तैर रहा है, अपने पूरे शरीर को लेकर चित्र खींचें, और हां के साथ पता लगाने को मान्य करें)। डायनेमिक घटाव, गहरा विषय, पृष्ठभूमि सेटिंग्स, पृष्ठभूमि सीखने, विषय आकार, शोर में कमी, आदि का चयन करके पता लगाने में सुधार करने के लिए उन्नत खोलें।
  8. परीक्षण सेटिंग्स के अंतर्गत, एक परीक्षण रखें और अन्य हटाएँ (राइट-क्लिक करें और हटाएँ)
  9. डेटा सेटिंग्स के अंतर्गत, परिणाम संवाद विंडो बनाएँ. पैरामीटर परिणाम प्रति समय और प्रति क्षेत्र। उदाहरण के लिए, मिनट द्वारा डेटा आउटपुट के लिए एक परिणाम विंडो बनाएं और कुल समय (6 मिनट) द्वारा डेटा आउटपुट के लिए दूसरा। प्रत्येक ज़ोन के लिए डेटा आउटपुट का अनुरोध करें (यदि प्रत्येक ज़ोन में दूरी की आवश्यकता हो तो इसका अनुरोध करें)। विभिन्न परिणाम विंडो को तीरों के साथ प्रारंभ विंडो से लिंक करें।
  10. सेटिंग्स का विश्लेषण करें के अंतर्गत, विश्लेषण करने के लिए पैरामीटर और प्रत्येक पैरामीटर के लिए सांख्यिकी के प्रकार का चयन करें. ट्रैकिंग से प्राप्त डेटा के आधार पर इन मापदंडों की स्वचालित रूप से गणना की जाएगी।
    1. NTT और SPT के लिए, नीचे परिभाषित विकल्पों का चयन करें:
      1. अखाड़े में तय की गई दूरी (सेमी) और संबंधित क्षेत्रों (सेमी) में तय की गई दूरी (सेमी) प्राप्त करने के लिए स्थानांतरित दूरी ( कुल का चयन करें) का चयन करें।
      2. ज़ोन में समय बिताने के लिए ज़ोन (ज़ोन , फ़्रीक्वेंसी, संचयी और विलंबता से पहले का चयन करें) का चयन करें और ज़ोन (ओं) में पहले प्रवेश के लिए विलंबता का चयन करें।
      3. ज़ोन ट्रांज़िशन का चयन करें (थ्रेसहोल्ड का चयन करें: 0 सेमी, ज़ोन 1 > ज़ोन 2 जोड़ें; जोन 2 > जोन 1, किसी भी क्षेत्र में, आवृत्ति) ज़ोन में प्रवेश द्वार की संख्या प्राप्त करने के लिए।
      4. हाइपरमोबिलिटी की अवधि (ओं), ठंड की अवधि (ओं) के लिए गतिशीलता सेट (70% से ऊपर उच्च मोबाइल भरें), 3% से नीचे स्थिर, न्यूनतम 150 फ्रेम, और पहले आवृत्ति, संचयी और विलंबता का चयन करें) का चयन करें।
        नोट: स्वचालित विश्लेषण और ठंड एपिसोड की संख्या और अवधि (ओं) का उपयोग करके ठंड व्यवहार के सन्निकटन के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
      5. डार्टिंग और अनियमित (तेज त्वरण आंदोलनों) जैसे जटिल व्यवहारों की घटना का मूल्यांकन करने के लिए त्वरण और टर्न कोण (आवृत्ति और संचयी का चयन करें) का चयन करें।
    2. एसटी के लिए, उपरोक्त खोजपूर्ण मापदंडों के अलावा, मछली (सेमी) के बीच की औसत दूरी, निकटतम पड़ोसी (सेमी) के बीच की औसत दूरी और सबसे दूर के पड़ोसी के बीच की औसत दूरी प्राप्त करने के लिए विकल्प विषयों के बीच की दूरी (सभी विषयों का चयन करें, माध्य, अधिकतम, न्यूनतम) का चयन करें।
  11. टेम्पलेट इसके उपयोग के लिए तैयार है। अंतिम संशोधनों को सहेजें और वीडियो से कोई डेटा प्राप्त किए बिना टेम्पलेट को बंद करें (टेम्पलेट फ़ाइल बनाए रखें; यह हल्का और प्रबंधित करने और कॉपी करने में आसान है)। यदि कई सॉफ़्टवेयर लाइसेंस हैं, तो प्रत्येक कंप्यूटर पर कॉपी किए गए एक ही टेम्पलेट से वीडियो का विश्लेषण करें।
  12. टेम्पलेट को कॉपी और उपयोग करने के लिए, दो विकल्प हैं:
    1. व्यवहार विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ टेम्पलेट फ़ाइल खोलें, एक नई समान फ़ाइल बनाने के लिए फ़ाइल > सहेजें पर जाएं।
    2. स्वागत इंटरफ़ेस में, टेम्पलेट से नया चुनें > वीडियो फ़ाइल से एक कस्टम टेम्पलेट > लागू करें (टेम्पलेट चुनें। EthXV फ़ाइल)। नए प्रयोग को नाम दें और उसका स्थान चुनें. सॉफ़्टवेयर को टेम्पलेट फ़ाइल से जानकारी की प्रतिलिपि बनाने में कुछ मिनट लग सकते हैं।
  13. टेम्प्लेट को फिर से समायोजित करने के लिए एरिना सेटिंग्स पर जाएं यदि वीडियो एक अलग कैमरे से रिकॉर्ड किया गया था (चरण 4.6 और 4.7 का पालन करें)।
  14. डिटेक्शन सेटिंग्स या एक्विजिशन पर जाएं यह जांचने के लिए कि कौन सा वीडियो चुना गया है और यदि आवश्यक हो तो वीडियो फ़ाइल बदलें।
  15. अधिग्रहण के तहत, DDS > रेडी टू स्टार्ट का चयन करें। सॉफ़्टवेयर को वीडियो संसाधित करने में कुछ मिनट लग सकते हैं।
  16. अधिग्रहण समाप्त हो गया है, जब ट्रैक संपादक पर जाएँ. संसाधित वीडियो को तेज़ी से पढ़ने के लिए त्वरण x16 का चयन करें और जांचें कि ट्रैकिंग सही है या नहीं।
    नोट: कभी-कभी, ट्रैकिंग में "नुकसान" हो सकता है (सॉफ़्टवेयर के प्रतिबिंब या भ्रम के कारण)। यदि वे कम हैं तो उन्हें इस भाग से मैन्युअल रूप से संपादित किया जा सकता है; अन्यथा, पूरे प्रयोग को पुन: संसाधित करना बेहतर होता है, कैनवास की परिभाषा और पहचान में सुधार होता है।
  17. सांख्यिकी के अंतर्गत, Calculate > Export Data पर क्लिक करें. डेटा निर्यात सीधे प्रयोग फ़ोल्डर में स्थित है।
  18. ट्रैक विज़ुअलाइज़ेशन या हीटमैप्स के तहत, उत्पन्न करें और निर्यात करें (राइट क्लिक, निर्यात छवि, स्प्रेडशीट रिपोर्ट के साथ इस डेटा को बचाने के लिए प्रयोग की निर्यात फ़ाइलें फ़ोल्डर का चयन करें) जानवर की छवियों को ट्रैक करना।
  19. सक्रिय प्रयोग को बंद करने के लिए फ़ाइल पर जाएं और अगले वीडियो के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. प्रत्येक समूह में डेटा की सामान्यता (शापिरो-विल्क परीक्षण) का विश्लेषण करें।
  2. लेवेन के परीक्षण के साथ होमोसेडेस्टिसिटी का आकलन करें।
  3. सामान्यता और homoscedasticity के मानदंड खारिज नहीं किया जा सकता है जब समूहों के बीच मतभेद का परीक्षण करने के लिए Dunnett और Tukey के कई तुलना परीक्षणों के बाद एक तरह से एनोवा का उपयोग करें.
  4. क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करें, इसके बाद समूहों के बीच मतभेदों का परीक्षण करने के लिए बोनफेरोनी सुधार का उपयोग करके एक जोड़ीदार तुलना करें जब सामान्यता और होमोसेडेस्टिसिटी के मानदंडों को खारिज कर दिया जाता है।
  5. आलेखीय सॉफ्टवेयर के साथ डेटा को प्लॉट करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस खंड में, हम मछली न्यूरोटॉक्सिकोलॉजी में इन व्यवहार उपकरणों के कुछ संभावित अनुप्रयोगों को देखेंगे। निम्नलिखित परिणाम मेथामफेटामाइन (एमईटीएच), एक मनोरंजक दवा, और ग्लाइफोसेट के उप-पुराने प्रभावों के लक्षण वर्णन के अनुरूप हैं, जो जलीय पारिस्थितिक तंत्र में पाए जाने वाले मुख्य जड़ी-बूटियों में से एक है।

वयस्क जेब्राफिश में एक मेथामफेटामाइन द्वि घातुमान न्यूरोटॉक्सिसिटी मॉडल की विशेषता
एनटीटी (चित्रा 3) पर 40 मिलीग्राम/एल एमईटीएच के प्रभाव का मूल्यांकन करते समय, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण ने पुष्टि की कि उजागर जानवरों ने एक सकारात्मक जियोटैक्सिस प्रस्तुत किया, जो प्रयोगात्मक टैंक के ऊपरी क्षेत्र में अन्वेषण समय में कमी की विशेषता है (एच (2) = 35.964, पी = 1.55 x 10-8), साथ ही इस भाग में यात्रा की गई दूरी में (एच (2) = 32.272, पी = 9.82 x 10-8), और यात्राओं की संख्या में (एच (2) = 36.527, पी = 1.17 x 10-8)। हमने ऊपरी क्षेत्र (एच (2) = 17.264, पी = 0.00018) की पहली यात्रा से पहले विलंबता समय में उल्लेखनीय वृद्धि देखी। यह टिप्पणी करना महत्वपूर्ण है कि एमईटीएच एक्सपोजर के बाद एनटीटी में मापा गया मापदंडों में देखे गए अंतर समय के साथ सुसंगत हैं, जैसा कि बोनफेरोनी सुधार (पी > 0.8) द्वारा पुष्टि की गई है। ठंड व्यवहार (एच (2) = 13.120, पी = 0.0014) के लिए जोखिम समय का एक महत्वपूर्ण प्रभाव पाया गया।

Figure 3
चित्रा 3: 3 घंटे और 48 घंटे के लिए 40 मिलीग्राम / एल मेथामफेटामाइन (एमईटीएच) के संपर्क में वयस्क जेब्राफिश के मानक 6-मिनट उपन्यास टैंक परीक्षण (एनटीटी) में मूल्यांकन की गई चिंता जैसा व्यवहार। प्रत्येक प्रयोग से डेटा इसी नियंत्रण मूल्यों के लिए सामान्यीकृत थे. संयुक्त डेटा को माध्यिका (n = 14-15), **p < 0.01, ***p < 0.001 के साथ स्कैटर प्लॉट के रूप में रिपोर्ट किया गया है; NTT समापन बिंदुओं के लिए Bonferroni सुधार के साथ Kruskal Wallis परीक्षण। 2 स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा। इस आंकड़े को Bedrossiantz et al.15 की अनुमति से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फ्रीजिंग आंदोलनों को आवृत्ति, विलंबता, अवधि या ठंड के स्थान का आकलन करके निर्धारित किया जा सकता है। उन्हें स्कोर करने का सबसे अच्छा तरीका निस्संदेह एक अनुभवी पर्यवेक्षक की आंख है, जो काफी श्रमसाध्य और जटिल है, इसलिए हमने ठंड व्यवहार19 का पता लगाने के लिए EthoVision सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक स्वचालित विकल्प की कोशिश की। हमने पाया कि सॉफ्टवेयर (तालिका 1 ए) द्वारा गणना की गई ठंड हमलों की संख्या, विलंबता और अवधि पर्यवेक्षक (तालिका 1 बी) द्वारा मैन्युअल रूप से बनाए गए एपिसोड के साथ अच्छी सटीकता के साथ सहसंबंधित है। जबकि दो विधियां परिणामों के संदर्भ में बराबर हैं (पी = 0.958, छात्र का परीक्षण), हमने यहां ठंड का आकलन करने के लिए स्वचालित दृष्टिकोण का उपयोग किया। एमईटीएच के संपर्क में आने के 3 घंटे के बाद, ठंड का समय काफी बढ़ गया (पी = 0.0012), जबकि एक्सपोजर के 48 घंटे (पी = 0.16) के बाद नियंत्रण में कोई अंतर नहीं पाया गया। एमईटीएच ने किसी भी समय अनियमित आंदोलनों पर कोई प्रभाव नहीं डाला।

हमने एमईटीएच के तीव्र संपर्क के बाद सामाजिक व्यवहार पर प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए दो प्रयोगात्मक प्रतिमानों का उपयोग किया। एसटी (चित्रा 4) से पता चला है कि व्यक्तियों के बीच औसत दूरी और सबसे दूर की दूरी एमईटीएच-उपचारित मछली (एच (2) = 53.261, पी = 2.72 x 10-12 के लिए काफी अधिक थी; एच (2) = 52.504, पी = 3.97 x 10-12 क्रमशः औसत और सबसे दूर की इंटरफिश दूरी के लिए), सामाजिक अलगाव के एक व्यवहारिक फेनोटाइप की ओर इशारा करते हुए। फिर से, हम टिप्पणी करते हैं कि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक टेस्ट (पी > 0.5) का उपयोग करके कोई समय प्रभाव नहीं पाया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क जेब्राफिश जलजनित का सामाजिक व्यवहार 3 घंटे और 48 घंटे के लिए 40 मिलीग्राम / एल मेथामफेटामाइन (एमईटीएच) के संपर्क में है। शोलिंग टेस्ट (एसटी) परिणाम, जिसमें औसत और सबसे दूर की इंटरफिश दूरी शामिल है। संयुक्त डेटा को माध्यिका (n = 18), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 के साथ स्कैटर प्लॉट के रूप में रिपोर्ट किया गया है; Bonferroni सुधार के साथ Kruskal Wallis परीक्षण। 2 स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा। इस आंकड़े को Bedrossiantz et al.15 की अनुमति से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एसपीटी (चित्रा 5) में, उपचारित मछली विशिष्ट क्षेत्र में बिताए गए समय और दूरी में उल्लेखनीय कमी दिखाती है (एफ (2,74) = 14.497, पी = 4.87 x 10-6; एफ (2,73) = 13.461, पी = 0.00001 क्रमशः विशिष्ट क्षेत्र में बिताए गए समय और दूरी के लिए)। ये परिणाम टीएस परिणामों द्वारा सुझाए गए सामाजिक अलगाव फेनोटाइप की पुष्टि करते हैं। टुकी के ईमानदार महत्वपूर्ण अंतर (एचएसडी) पोस्ट हॉक परीक्षण ने दो विश्लेषण समय (पी > 0.5) के बीच कोई संभावित अंतर नहीं बताया।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क जेब्राफिश जलजनित का सामाजिक व्यवहार 3 घंटे और 48 घंटे के लिए 40 मिलीग्राम / एल मेथामफेटामाइन (एमईटीएच) के संपर्क में है। सामाजिक वरीयता परीक्षण (एसपीटी) परिणाम, प्रयोगात्मक टैंक के तीन आभासी क्षेत्रों में से प्रत्येक में मछली के समय और दूरी सहित: खाली, केंद्र और विशिष्ट। प्रत्येक प्रयोग से डेटा इसी नियंत्रण मूल्यों के लिए सामान्यीकृत थे. संयुक्त डेटा को माध्यिका (एन = 17-20), * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 के साथ एक स्कैटर प्लॉट के रूप में रिपोर्ट किया गया है; डनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरफ़ा एनोवा। 2 स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा। इस आंकड़े को Bedrossiantz et al.15 की अनुमति से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ग्लाइफोसेट के पर्यावरणीय स्तरों के उप-क्रोनिक जोखिम का व्यवहारिक प्रभाव
एनटीटी (चित्रा 6) पर 3 माइक्रोग्राम/एल ग्लाइफोसेट के उप-क्रोनिक एक्सपोजर के प्रभावों का व्यवहारिक विश्लेषण शीर्ष (एफ2,77 = 8.744, पी = 0.0004) की खोज में लगने वाले समय में उल्लेखनीय कमी का खुलासा करता है, इस हिस्से में यात्रा की गई दूरी (एफ2,77 = 9.118, पी = 0.0003), और यात्राओं की संख्या (एफ2,77 = 3.441, पी = 0.037)। ये प्रभाव सकारात्मक जियोटैक्सिस व्यवहार की विशेषता हैं, जैसा कि टैंक के शीर्ष पर पहली यात्रा से पहले विलंबता समय पर देखा गया बढ़ा हुआ प्रभाव है (एच (2) = 9.628, पी = 0.008)। उजागर जानवरों के अनियमित और ठंड व्यवहार की अभिव्यक्ति का भी एनटीटी में विश्लेषण किया गया था। अवधि (एच (2) = 17.261, पी = 0.025) और अनियमित एपिसोड की संख्या (एफ2,76 = 10.073, पी = 0.0001) ग्लाइफोसेट द्वारा काफी बढ़ गई थी। इसके विपरीत, नियंत्रण के साथ कोई ठंड अंतर नहीं पाया गया (पियर्सन ची-स्क्वायर (2) = 2.964, पी = 0.253)। एक पारिस्थितिक संदर्भ में लागू, एनटीटी में किए गए अवलोकनों से पता चलता है कि ग्लाइफोसेट मछली के खोजपूर्ण व्यवहार को काफी कम कर सकता है, जिससे जंगली में जीवित रहने की उनकी क्षमता खतरे में पड़ सकती है।

Figure 6
चित्रा 6: वयस्क जेब्राफिश के मानक 6-मिनट उपन्यास टैंक परीक्षण (एनटीटी) में मूल्यांकन की गई चिंता जैसा व्यवहार 2 सप्ताह के लिए 0.3 माइक्रोग्राम / एल और 3 माइक्रोग्राम / एल ग्लाइफोसेट के संपर्क में है। व्यवहार मापदंडों का विश्लेषण किया गया, साथ ही प्रयोगात्मक टैंक का एक कार्टून दो बराबर आभासी क्षेत्रों, ऊपर और नीचे में विभाजित है। डेटा माध्यिका (एन = 23-29), * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 के साथ एक स्कैटर प्लॉट के रूप में रिपोर्ट किया गया; डनेट के कई तुलना परीक्षण (कुल दूरी, शीर्ष में दूरी, शीर्ष में समय, शीर्ष पर संक्रमण, अनियमित मुकाबले, उच्च गतिशीलता आवृत्ति) या बोनफेरोनी सुधार (शीर्ष पर विलंबता, अनियमित अवधि) के साथ क्रुस्कल वालिस परीक्षण के साथ एकतरफा एनोवा ठंड की अवधि और ठंड मुकाबलों में कोई अंतर (पी > 0.05) नहीं पाया गया। 2-4 स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा। यह आंकड़ा फारिया एट अल.20 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्कूली शिक्षा, शिकारियों से खुद को बचाने के लिए सामाजिक दबाव द्वारा एक साथ रखे जाने वाले षड्यंत्रों के गैर-ध्रुवीकृत समूह, डैनियो रेरियो की एक स्वाभाविक प्रवृत्ति है। स्कूल जानवरों की चिंता या भय के स्तर के आधार पर "कस" या "विस्तार" कर सकता है, एक विशेष दृश्य प्रभाव जो प्रयोगात्मक रूप से पहचानना बहुत आसान है (चित्र 7)। ग्लाइफोसेट प्रयोग में, शोलिंग परीक्षण ने 3 μg/L के संपर्क में आने वाली मछलियों में चिंता में वृद्धि का खुलासा किया, जो शोल के समूह द्वारा परिलक्षित होता है और इस प्रकार व्यक्तियों के बीच औसत दूरी और सबसे दूर की दूरी में उल्लेखनीय कमी (F2,56 = 5.664, P = 0.006 और F2,56 = 7.413, P = 0.001, औसत और सबसे दूर की इंटरफिश दूरी के लिए, क्रमशः) नियंत्रण की तुलना में।

Figure 7
चित्रा 7: वयस्क जेब्राफिश जलजनित का सामाजिक व्यवहार 2 सप्ताह के लिए 0.3 μg / L और 3 μg / L ग्लाइफोसेट के संपर्क में है। माध्यिका (एन = 19-20), * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 के साथ स्कैटर प्लॉट के रूप में रिपोर्ट किया गया डेटा; डनेट के कई तुलना परीक्षण (औसत इंटरफिश दूरी और सबसे दूर दूरी) डेटा के साथ एक तरफा एनोवा 2 से 4 स्वतंत्र प्रयोगों तक। यह आंकड़ा फारिया एट अल.20 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: एक स्वचालित विश्लेषण का उपयोग करके ठंड व्यवहार का एक अनुमान। इस तालिका में रिपोर्ट डेटा एक ही रिकॉर्डिंग (1 वीडियो) दो अलग अलग तरीकों के साथ विश्लेषण से आते हैं. (ए) EthoVision V13 सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित गणना द्वारा ठंड व्यवहार का अनुमान। चर गतिशीलता की गणना दो नमूनों के बीच विषय क्षेत्र के परिवर्तन से की जाती है, इसलिए यह इस क्षेत्र की अधिग्रहण आवृत्ति पर निर्भर करता है। हमने गतिहीनता (3% से कम गतिशीलता) के साथ-साथ नमूना दर को न्यूनतम निरंतर समय 5 s (150 फ्रेम से अधिक) की बहुत कम सीमा निर्धारित की है। (बी) व्यवहार अवलोकन अनुसंधान इंटरएक्टिव सॉफ्टवेयर (बोरिस, मुफ्त और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर) के साथ ठंड व्यवहार का विश्लेषण। बोरिस वीडियो कोडिंग और लाइव अवलोकनों के लिए एक इवेंट-लॉगिंग सॉफ्टवेयर है। बोरिस के साथ, पर्यवेक्षक फ्रीज एपिसोड को एक राज्य घटना के रूप में कोड कर सकता है, जो प्रारंभ और अंत बिंदुओं को परिभाषित करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: उपन्यास टैंक परीक्षण में नियंत्रण मछली. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एनटीटी में देखे गए विशेषता चिंता व्यवहार को मस्तिष्क21 में विश्लेषण किए गए सेरोटोनिन के स्तर के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध किया गया है। उदाहरण के लिए, पैरा-क्लोरोफेनिलएलनिन (पीसीपीए) के संपर्क में आने के बाद, 5-एचटी बायोसिंथेसिस का अवरोधक, मछली ने सकारात्मक जियोटैक्सिस के साथ-साथ मस्तिष्क 5-एचटी स्तर22 में कमी का प्रदर्शन किया, परिणाम एमईटीएच के साथ प्राप्त लोगों के समान थे। इसलिए, मस्तिष्क सेरोटोनिन के स्तर में कमी और एमईटीएच-उजागर जेब्राफिश में सकारात्मक जियोटैक्सिस के प्रदर्शन से पता चलता है कि दवा द्वारा उत्पादित चिंता व्यवहार सेरोटोनर्जिक मार्ग द्वारा मध्यस्थता है। दिलचस्प बात यह है कि एक समान व्यवहार फेनोटाइप, यानी, जियोटैक्सिस पर एक एंक्सिजेनिक प्रभाव, वयस्क ज़ेब्राफिश में 2 सप्ताह के लिए 0.3 3 माइक्रोग्राम / एल और 3 माइक्रोग्राम / एल, ग्लाइफोसेट के दो पर्यावरणीय रूप से प्रासंगिक सांद्रता में देखा जा सकता है। जियोटैक्सिस में वृद्धि भी पहले न्यूरोटॉक्सिकेंट एक्रिलामाइड 6,23 के साथ वयस्क जेब्राफिश के लिए बताई गई थी। इन सभी मामलों में, यह व्यवहार फेनोटाइप (एनटीटी में जियोटैक्सिस की वृद्धि, एंक्सिजेनिक पदार्थ की विशेषता) मोनोमिनर्जिक न्यूरोट्रांसमीटर स्तरों की कमी के साथ जुड़ा हुआ था। इसलिए, मस्तिष्क के न्यूरोकेमिकल विश्लेषण के साथ संयुक्त एनटीटी प्रतिमान पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक जानकारी, खोजपूर्ण व्यवहार और फोर्जिंग दक्षता प्रदान करता है और न्यूरोट्रांसमीटर मॉड्यूलेशन के साथ व्यवहार न्यूरोफेनोटाइप को जोड़ता है।

दूसरी ओर, दोनों परख, एसटी और एसपीटी में सामाजिक व्यवहार की हानि, एमईटीएच-उपचारित मछली में भी देखी गई थी। इस अध्ययन में प्राप्त परिणाम चूहों और बंदरों के साथ कई अध्ययनों के अनुरूप है, जहां एमईटीएच के अध्ययन जानवरों के तीव्र और जीर्ण जोखिम के परिणामस्वरूप सामाजिक वापसी24 होती है। एमईटीएच दुरुपयोग से जुड़े सामाजिक व्यवहार परिवर्तनों को मनुष्यों में सामाजिक-संज्ञानात्मक कार्य24 में हानि द्वारा समझाया गया है। शोल आकार पर एक anxiogenic प्रभाव 2 सप्ताह के लिए 3 μg / L ग्लाइफोसेट के लिए उजागर ज़ेब्राफिश में पाया गया था। हमने 3 दिनोंके लिए 53 मिलीग्राम / एल (0.75 मिमी) एक्रिलामाइड के संपर्क में जेब्राफिश में इस प्रभाव की एक फेनोकॉपी देखी।

एनटीटी, एसटी, और एसपीटी परख प्रभावी ढंग से संभावित न्यूरोटॉक्सिक प्रभाव25 रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के रूप में वयस्क जेब्राफिश में तीव्र मेथामफेटामाइन और उप-पुरानी ग्लाइफोसेट विषाक्तता मॉडल के अध्ययन द्वारा सचित्र निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। व्यवहार, विष विज्ञान में, एक प्रासंगिक शिखर समापन बिंदु है, जो न्यूरोटॉक्सिसिटी और पर्यावरण अनुसंधान के लिए एक रसायन के जीव स्तर पर प्रभावों की विशेषता है। प्रयोगशाला स्थितियों में एक सबलेथल एंडपॉइंट होने के अलावा, व्यवहार में परिवर्तन, जैसे कि खोजपूर्ण या सामाजिक व्यवहार, प्रकृति में हानिकारक हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रस्तावित व्यवहार विश्लेषण बैटरी एक आसान-से-कार्यान्वयन, अर्ध-स्वचालित विधि11 है और इसलिए, बहुत कुशल है यदि परख सचेत रूप से योजनाबद्ध हैं (कमी सिद्धांत)26. एक एकल टैंक का उपयोग कर एक परीक्षण बैटरी के रूप में इन assays प्रदर्शन जानवरों की संख्या और प्रयोगात्मक समय और अपशिष्ट पीढ़ी कम कर देता है.

बैटरी में assays के क्रम एक महत्वपूर्ण विचार है अगर हम प्रत्येक परीक्षण में एक व्यक्ति की प्रतिक्रिया प्रोफ़ाइल का अध्ययन करना चाहते हैं. इस प्रयोजन के लिए, व्यक्तिगत परख का संचालन ( चित्रा 2 देखें) जानवर की पहचान रखने के लिए और अपने सामाजिक वरीयता के लिए अपने खोजपूर्ण व्यवहार से संबंधित करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, जानवर के व्यवहार प्रतिक्रियाओं को अन्य जैविक डेटा से संबंधित किया जा सकता है, जैसे कि इसके न्यूरोट्रांसमीटर प्रोफाइल या जीन अभिव्यक्ति, अगर मछली को नमूने के अंत बिंदु (चित्रा 2ए) तक पहचाना जाता है।

आमतौर पर, व्यवहार विश्लेषण समूहों के बीच मतभेदों के अवलोकन की अनुमति देता है। सबसे पहले, व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की गणना समूह द्वारा डेटा को पूल करने से पहले पशु ट्रैकिंग27 के आधार पर की जाती है। फिर, नियंत्रण समूह के संबंध में साधन और अंतर की गणना की गई प्रत्येक व्यवहार पैरामीटर के लिए विचरण में अंतर की तुलना की जाती है। शोलिंग विश्लेषण12 के साथ, यह बहुत स्पष्ट होना महत्वपूर्ण है कि विचरण की इकाई परीक्षण मछली का समूह है, व्यक्तिगत मछली नहीं क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगत मछली का व्यवहार शोल में अन्य मछली से प्रभावित होता है। यह व्यवहार डेटा28 को संसाधित करने के लिए अधिकांश कागजात में उपयोग किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, व्यवहार मापदंडों के विश्लेषण पर पैरामीटर-दर-पैरामीटर आधार पर नहीं बल्कि प्रति परीक्षण समग्र प्रतिक्रिया के रूप में पुनर्विचार करना उपयोगी हो सकता है। उदाहरण के लिए, कोई परीक्षण में किए गए प्रत्येक माप के सहप्रसरण की गणना कर सकता है और इसे एक ही चीज़ को मापने के एक अलग तरीके के रूप में रिपोर्ट कर सकता है: चिंतित, खोजपूर्ण, या मिलनसार व्यवहार। व्यवहार डेटा की गणना और व्याख्या करने के कई तरीकेहैं 28,29. शर्तों की संख्या, परीक्षण के प्रकार, और छवि अधिग्रहण (2 डी या 3 डी)30,31 के आधार पर विश्लेषण पूरी तरह से पुनर्विचार किया जा सकता है क्रम में डेटा का सबसे अच्छा बाहर पाने के लिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय (परियोजना PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, सेवेरो ओचोआ सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (CEX2018-000794-S) से "Agencia Estatal de Investigación" द्वारा समर्थित किया गया था। जूलियट Bedrossiantz एक पीएचडी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (PRE2018-083513) स्पेनिश सरकार और यूरोपीय सामाजिक कोष द्वारा सह-वित्त पोषित.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

इस महीने में JoVE अंक 201 ज़ेब्राफिश न्यूरोटॉक्सिसिटी परीक्षण वीडियो रिकॉर्डिंग खोजपूर्ण आक्रामक सामाजिक व्यवहार अनुप्रयोग
वयस्क <em>डैनियो रेरियो</em> में न्यूरोटॉक्सिसिटी आकलन एक टैंक में व्यवहार परीक्षणों की बैटरी का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter