Summary
Qui, presentiamo una batteria di test comportamentali completa, tra cui il nuovo serbatoio, Shoaling e i test di preferenza sociale, per determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici delle sostanze chimiche (ad esempio, metanfetamina e glifosato) sul pesce zebra adulto utilizzando un singolo acquario. Questo metodo è rilevante per la neurotossicità e la ricerca ambientale.
Abstract
La presenza di effetti neuropatologici si è rivelata, per molti anni, il principale endpoint per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica. Tuttavia, negli ultimi 50 anni, gli effetti delle sostanze chimiche sul comportamento delle specie modello sono stati attivamente studiati. Progressivamente, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora utilizzati di routine per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto forniscono un mezzo standardizzato e affidabile per studiare un'ampia gamma di comportamenti, tra cui ansia, interazione sociale, apprendimento, memoria e dipendenza. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto in genere comportano il posizionamento del pesce in un'arena sperimentale e la registrazione e l'analisi del loro comportamento utilizzando un software di tracciamento video. I pesci possono essere esposti a vari stimoli e il loro comportamento può essere quantificato utilizzando una varietà di metriche. Il nuovo test della vasca è uno dei test più accettati e ampiamente utilizzati per studiare il comportamento ansioso nei pesci. I test di shoaling e di preferenza sociale sono utili per studiare il comportamento sociale del pesce zebra. Questo saggio è particolarmente interessante in quanto viene studiato il comportamento dell'intera secca. Questi saggi hanno dimostrato di essere altamente riproducibili e sensibili alle manipolazioni farmacologiche e genetiche, rendendoli strumenti preziosi per lo studio dei circuiti neurali e dei meccanismi molecolari alla base del comportamento. Inoltre, questi saggi possono essere utilizzati nello screening farmacologico per identificare composti che possono essere potenziali modulatori del comportamento.
In questo lavoro mostreremo come applicare gli strumenti comportamentali nella neurotossicologia dei pesci, analizzando l'effetto della metanfetamina, una droga ricreativa, e del glifosato, un inquinante ambientale. I risultati dimostrano il contributo significativo dei saggi comportamentali nel pesce zebra adulto alla comprensione degli effetti neurotossicologici degli inquinanti ambientali e dei farmaci, oltre a fornire informazioni sui meccanismi molecolari che possono alterare la funzione neuronale.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è una specie di vertebrato modello popolare per l'ecotossicologia, la scoperta di farmaci e gli studi di farmacologia di sicurezza. Il suo basso costo, gli strumenti genetici molecolari ben consolidati e la conservazione dei processi fisiologici chiave coinvolti nella morfogenesi e nel mantenimento del sistema nervoso rendono il pesce zebra un modello animale ideale per la ricerca neuroscientifica, inclusa la tossicologia neurocomportamentale 1,2. L'endpoint principale per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica era, fino a poco tempo fa, la presenza di effetti neuropatologici. Ultimamente, tuttavia, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora comunemente utilizzati per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche 3,4. Inoltre, gli endpoint comportamentali sono molto rilevanti da un punto di vista ecologico, in quanto anche un cambiamento comportamentale molto lieve nei pesci potrebbe mettere in pericolo la sopravvivenza dell'animale in condizioni naturali5.
Uno dei saggi comportamentali più utilizzati nella ricerca sul pesce zebra adulto è il nuovo tank test (NTT), che misura il comportamento ansioso 6,7. In questo saggio, i pesci sono esposti a novità (i pesci sono posti in una vasca sconosciuta), a un lieve stimolo avversivo e si osservano le loro risposte comportamentali. L'NTT viene utilizzato principalmente per valutare l'attività locomotoria basale, la geotassia, il congelamento e i movimenti irregolari dei pesci. Erratic8 è caratterizzato da bruschi cambi di direzione (zigzaging) e ripetuti episodi di accelerazioni (darting). È una reazione di allarme e di solito si osserva prima o dopo episodi di congelamento. Il comportamento di congelamento corrisponde a una completa cessazione dei movimenti del pesce (ad eccezione dei movimenti opercolari e oculari) sul fondo della vasca, distinto dall'immobilità causata dalla sedazione, che provoca ipolocomozione, acinesia e affondamento8. Il congelamento è solitamente correlato a un elevato stato di stress e ansia e fa anche parte del comportamento sottomesso. I comportamenti complessi sono ottimi indicatori dello stato d'ansia degli animali. È stato dimostrato che la NTT è sensibile alla manipolazione farmacologica e genetica9, il che la rende uno strumento prezioso per studiare le basi neurali dell'ansia e dei disturbi correlati.
Il pesce zebra è una specie altamente sociale, quindi possiamo misurare una vasta gamma di comportamenti sociali. Il test di shoaling (ST) e il test di preferenza sociale (SPT) sono i test più utilizzati per valutare il comportamento sociale10. L'ST misura la tendenza dei pesci a raggrupparsi11 quantificando il loro comportamento spaziale e i loro schemi di movimento. ST è utile per studiare le dinamiche di gruppo, la leadership, l'apprendimento sociale e la comprensione del comportamento sociale di molte specie ittiche12. L'SPT nel pesce zebra adulto è stato adattato dalla preferenza di Crawley per il test di novità sociale per i topi13 ed è diventato rapidamente un test comportamentale popolare per lo studio dell'interazione sociale in questa specie modello14. Questi due test sono stati anche adattati per l'uso in saggi di screening farmacologico e si sono dimostrati promettenti per l'identificazione di nuovi composti che modulano il comportamento sociale15,16.
In generale, i saggi comportamentali nel pesce zebra adulto sono strumenti potenti che possono fornire preziose informazioni sui meccanismi comportamentali o sui neurofenotipi dei composti attivi e delle droghe abusate17. Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare questi strumenti comportamentali7 con risorse materiali di base e come applicarli nei saggi di tossicità per caratterizzare gli effetti di un'ampia gamma di composti neuroattivi. Inoltre, vedremo che gli stessi test possono essere applicati per valutare gli effetti neurocomportamentali dell'esposizione acuta a un composto neuroattivo (metanfetamina) ma anche per caratterizzare questi effetti dopo l'esposizione cronica a concentrazioni ambientali di un pesticida (glifosato).
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Protocol
Il rigoroso rispetto delle norme etiche garantisce il benessere e il corretto trattamento del pesce zebra utilizzato per la sperimentazione. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida stabilite dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (CID-CSIC). I protocolli e i risultati presentati di seguito sono stati eseguiti con la licenza concessa dal governo locale (numero di accordo 11336).
1. Stabulazione degli animali per test comportamentali
- Eseguire tutti i test (presentati nella Figura 1) in una stanza comportamentale isolata a 27-28 °C tra le 10:00 e le 17:00.
- Lavare più volte sia i pesci di controllo che quelli esposti in acqua pulita [acqua purificata ad osmosi inversa contenente 90 mg/L di sale per acquari, 0,58 mM CaSO4·2H2O e 0,59 mM NaHCO3] prima di iniziare gli esperimenti per evitare qualsiasi potenziale contaminazione della vasca sperimentale.
- Acclimatare gli animali alla stanza del comportamento 1 ora prima di iniziare gli esperimenti.
- Assicurarsi che gli animali (rapporto ≈50:50 maschi: femmine) siano sperimentalmente ingenui ed eseguire tutti i test comportamentali in modo cieco con osservatori ignari del gruppo sperimentale.
- Per ottenere risultati significativi nei saggi comportamentali, avere un numero totale di 18 soggetti per condizione (n = 18), idealmente ottenuto tra due o più esperimenti indipendenti. Ad esempio, nei singoli test, analizzare il comportamento di 9 animali per condizione, per replica. Nei test di gruppo, analizza il comportamento di un branco di 6-9 animali per condizione, per replica.
- Eseguire tutti i test seguendo un approccio di test della batteria (vedere le proposte di pianificazione nella Figura 2). Eticamente più adatto, questo metodo permette di ridurre il numero di animali necessari per lo studio, rispettando il principio di riduzione delle 3R7.
- La maggior parte delle volte, i test comportamentali sono collegati a test biologici, quindi sacrificare gli animali seguendo le linee guida sull'eutanasia18 prima di raccogliere e analizzare i campioni (OMIC o sostanze chimiche). Se l'endpoint non risulta essere il campionamento, ristabilizzare il gruppo di controllo alla fine dell'esperimento. Riutilizzare gli animali di controllo per scopi riproduttivi o sperimentali dopo alcuni giorni.
Figura 1: Configurazioni sperimentali. Tre configurazioni della vasca quadrata per studiare un'ampia gamma di comportamenti nel pesce zebra adulto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cronologia sperimentale. Due proposte progettuali per la registrazione di saggi comportamentali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Configurazioni sperimentali del serbatoio
- Comportamento ansioso: il nuovo test del carro armato (NTT)
- Regola la configurazione sperimentale (numero di vasche, telecamere e computer) per registrare il numero massimo di pesci contemporaneamente. I saggi comportamentali individuali richiedono molto tempo, quindi ottimizza tempo, materiale e spazio.
- Preparare le vasche sperimentali per NTT: Vasca quadrata (20 cm di lunghezza, 20 cm di larghezza, 25 cm di altezza) rivestita con pannelli acrilici sulle pareti laterali e sul fondo per evitare riflessi e interferenze tra i soggetti.
- Riempire le vasche sperimentali con 7 L (altezza della colonna d'acqua: 20 cm di altezza) di acqua di pesce ben ossigenata a 28 °C.
- Regolare la posizione del serbatoio davanti alla fotocamera per evitare immagini distorte.
- Controllare l'impostazione dell'illuminazione. La retroilluminazione a LED (10000 lux) fornisce un'illuminazione omogenea su tutta la parte del serbatoio per la registrazione video in buone condizioni.
- Accendere le fotocamere e regolarle seguendo la sezione 3.
- Introdurre i soggetti, uno per uno, sul fondo delle vasche sperimentali prima di iniziare a registrare il più rapidamente possibile.
NOTA: È importante iniziare a registrare con l'animale sul fondo della vasca. - Fare attenzione a non disturbare gli animali durante la registrazione. Utilizzo di una tenda o di un pannello per limitare l'interazione visiva non solo tra le vasche ma anche tra il supporto e l'esterno.
- Al termine della registrazione (il tempo di registrazione standard è di 6 minuti), trasferire gli animali che hanno già superato il test in un'altra vasca in modo da non mescolarli con gli animali naïve.
- Ripetere la procedura con tutti i soggetti disponibili. Si consiglia di avere un numero totale di 18 soggetti per condizione per ottenere risultati significativi nei singoli studi (da due o più repliche indipendenti).
- Randomizzare il gruppo sperimentale assegnato a ciascun carro armato tra una prova e l'altra per evitare potenziali effetti sul carro armato (se si registrano più condizioni contemporaneamente).
- Comportamento sociale di gruppo: il test di Shoaling (ST)
- La configurazione sperimentale di ST è la stessa di quella di NTT (gli stessi serbatoi possono essere riutilizzati direttamente).
- Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.6. per configurare la ST.
- Introdurre il banco (da 6 a 9 soggetti contemporaneamente) sul fondo delle vasche sperimentali prima di iniziare a registrare il più rapidamente possibile.
NOTA: È importante iniziare a registrare con l'animale sul fondo della vasca. - Seguire i passaggi 2.1.8-2.1.11. per eseguire l'ST.
- Ripetere la procedura con tutti i soggetti disponibili. Per ottenere risultati significativi in questo saggio, eseguire almeno due repliche indipendenti con la stessa dimensione del banco in ciascuna replica.
- Mantenere la dimensione del branco coerente per tutti i gruppi sperimentali e le repliche all'interno dello stesso esperimento.
- Comportamento sociale individuale: il test delle preferenze sociali (SPT)
- Regolare la configurazione sperimentale per ottimizzare lo spazio sperimentale e il tempo di registrazione.
- Preparare le vasche sperimentali per SPT: Serbatoio quadrato (20 cm di lunghezza, 20 cm di larghezza, 25 cm di altezza) trasparente (vetro o plastica) per offrire visibilità laterale. Il pesce a focale singola è libero di interagire con una zona virtuale conspecifica - un branco di pesci posto nella vasca di alloggiamento esterna unilaterale, o con la zona virtuale non specifica - una vasca di alloggiamento vuota esterna su un lato.
- Riempire le vasche sperimentali con 5 L (altezza della colonna d'acqua: 15 cm, stessa altezza della colonna d'acqua nelle vasche di stabulazione esterna) di acqua pulita per pesci a 28 °C.
- Regolare la posizione del serbatoio davanti alla fotocamera per evitare immagini distorte.
- Verificare che l'impianto riceva un'illuminazione omogenea.
- Introdurre i soggetti, uno per uno, sul fondo delle vasche sperimentali prima di iniziare immediatamente la registrazione con l'animale al centro.
- Evitare le interazioni visive tra osservatori e animali durante la registrazione.
- Al termine della registrazione di 6 minuti, trasferisci gli animali presenti in un'altra vasca in modo da non mescolarli con gli animali ingenui.
- Ripetere la procedura con tutti i soggetti disponibili. Avere un numero totale di 18 soggetti per condizione per ottenere risultati significativi in studi individuali (da due o più repliche indipendenti).
3. Registrazione video per test comportamentali
- Aprire Gestione videocamera per verificare la disponibilità della videocamera GigE su ciascun computer.
- Avvia il software di controllo della telecamera GigE (come uEye Cockpit, descritto qui). Apri l'opzione Fotocamera , seleziona la modalità Monocromatica e regola le dimensioni dell'immagine (1:2).
- Apri le proprietà della videocamera
- In Fotocamera, impostare Pixel Clock su Massimo, impostare la frequenza fotogrammi su 30 fotogrammi al secondo (fps) e regolare l'esposizione (regolazione automatica o manuale se l'immagine è troppo scura).
- In Immagine, impostare il guadagno su 0 (Auto) e i livelli di nero (regolazione automatica o manuale per ottenere un buon contrasto).
- In Dimensioni, regolare le dimensioni della finestra in base all'area da incidere (Larghezza: Larghezza-Sinistra, Altezza: Altezza-Alto). Questo passaggio permette di ridurre le dimensioni dell'immagine e, quindi, la dimensione finale del video.
- Chiudere Proprietà videocamera.
- Crea una cartella generale per la sessione dell'esperimento per salvare le impostazioni della fotocamera e i video.
- Per salvare le impostazioni della fotocamera, impostare File > Salva parametri > Su file e selezionare la cartella dell'esperimento creata di recente.
NOTA: Il file delle impostazioni della telecamera può quindi essere ricaricato nell'applicazione per continuare a lavorare con gli stessi parametri dell'immagine in qualsiasi momento (ad esempio quando la telecamera si spegne improvvisamente o per riutilizzare le stesse impostazioni, riducendo il tempo di configurazione e omogeneizzando le condizioni sperimentali). Se, in un momento, la fotocamera si blocca tra un video e l'altro, interrompere la registrazione, uscire e spegnere la fotocamera. Riaccendilo, ricarica i parametri della fotocamera andando su File > Carica parametri > su File e riavvia la registrazione. Controlla se il video attuale è stato completamente acquisito per scartare o ripetere il pesce (prima di ripetere, dai agli animali un po' di tempo per riacclimatarsi). - Ripetere questa procedura di configurazione della fotocamera (passaggi 3.1-3.5) su tutte le telecamere.
- Quando tutte le videocamere sono configurate correttamente, apri Registra sequenza video.
- Seleziona Crea per salvare come nuovo file video, seleziona la cartella dell'esperimento creata di recente e riporta nel nome del file video le informazioni sull'argomento, il tipo di esperimento e la data.
- Selezionare Numero massimo di fotogrammi. Digitare 10800 nella casella del telaio. Il video standard è la registrazione di 6 minuti (Video 1) a 30 fps in formato AVI; Pertanto, 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 fotogrammi in totale.
- Selezionare Calc. Frame Rate o indicare manualmente il frame rate (velocità di registrazione: 30 fps).
- Ripetere la procedura di creazione del file video su tutti i computer.
- Introdurre i soggetti, uno per uno, sul fondo di ogni vasca sperimentale. Tutti i test verranno eseguiti contemporaneamente.
- Avviare rapidamente le registrazioni facendo clic su Registra e attendere di ottenere il numero massimo di fotogrammi richiesti (passaggio 3.10).
- Una volta registrati i video, viene visualizzata una finestra di chat con il messaggio Numero massimo di fotogrammi raggiunti!. Selezionare Accetta.
- Selezionare Chiudi per terminare la registrazione e chiudere il file video.
- Rimuovere i pesci che sono stati appena osservati. Fai attenzione a separarli dai pesci ingenui.
- Seleziona direttamente Crea e ripeti il processo per continuare a registrare video.
- Una volta completate tutte le registrazioni, seleziona Esci.
- Per spegnere le telecamere, selezionare Chiudi telecamera ed esci dal programma.
4. Analisi dei video registrati
- Avviare il software di analisi (vedere la tabella dei materiali).
- Per elaborare un nuovo modello, fai clic su Nuovo da modello > Applicato un modello predefinito > Da file video e seleziona un video per iniziare a configurare il modello. Prova a scegliere un video rappresentativo dell'esperimento con un soggetto che mostra una buona mobilità e buone condizioni di registrazione.
- In Parametri, configurare i parametri nelle finestre seguenti (da 1 a 4/7). Seleziona il modello Pesce > Zebrafish adulto, l'arena Open Field Square > One Arena, il numero di soggetti per arena (per la ST è richiesto un pacchetto multi tracking [traccia vari soggetti in un'arena]), il tipo di rilevamento per punto centrale e infine regola il frame rate a 30 fps. Nelle finestre successive (da 5 a 7/7), non modificare i parametri; la configurazione predefinita è OK.
- Assegna all'esperimento un nome come modello e inseriscilo nella stessa cartella del resto del video archiviato. Il modello verrà creato come cartella dell'esperimento con diverse suddivisioni contenenti tutte le informazioni di configurazione.
- In Impostazioni esperimento, controlla la configurazione definita (da file video, arena, numero di soggetti, fotogrammi al secondo). Qui è possibile modificare le unità di sistema.
- In Impostazioni arena, fai clic con il pulsante destro del mouse al centro dello schermo e seleziona Afferra. Da File nel display. Scegli un'immagine video di buona qualità e Accetta per acquisire questa immagine per le impostazioni di sfondo. Innanzitutto, calibrare l'immagine, generando una regola calibrata. Utilizzare la larghezza del serbatoio come scala (19 cm). Quindi, disegna l'arena. Fate attenzione a fare il quadrato quel tanto che basta per evitare i riflessi dell'animale quando quest'ultimo si avvicina alla superficie o l'eventuale confusione del software del pesce con le zone nere della vasca. Infine, disegna le zone della forma con la funzione Cornice .
- Per NTT e ST, dividere la parte anteriore del serbatoio in due zone virtuali uguali, in alto e in basso (vedere la Figura 1). Disegna due caselle orizzontali uguali. Le scatole coprono mezza arena per ognuna. Assegnare un nome rispettivamente a Superiore e Inferiore per le zone superiore e inferiore. Fai attenzione che le caselle abbiano la stessa larghezza (9-10 cm) e lunghezza (8-9 cm), non superino i confini dell'arena (quadrato arancione) e non si sovrappongano, controllando che ogni zona freccia indichi esattamente le sue zone.
- Per SPT, dividere concettualmente l'arena sperimentale in tre zone di uguali dimensioni: vuota, centrale e conspecifica (vedere la Figura 1). Disegna tre caselle verticali uguali. Assegna un nome alla casella orientata verso il serbatoio della secca come Conspecifico, la casella orientata verso il serbatoio vuoto come Vuoto e quella centrale come Centro. Fai attenzione che i palchi abbiano la stessa larghezza (6 cm) e lunghezza (18-19 cm), non superino i limiti dell'arena e non si sovrappongano.
- In Impostazioni di rilevamento, verificare quale video deve essere gestito nel file video. Quindi, controlla la qualità del rilevamento (pesce in giallo, punto centrale rosso). Fare clic su Rilevamento automatico per regolare il rilevamento, rimettendo a fuoco l'animale (scegliere un'immagine in cui l'animale sta nuotando di profilo su sfondo bianco, disegnare l'immagine riprendendo l'intero corpo e convalidare il rilevamento con Sì). Apri Avanzate per migliorare il rilevamento selezionando Sottrazione dinamica, Soggetto più scuro, Impostazioni sfondo, Apprendimento in background, Dimensioni soggetto, Riduzione rumore, ecc.
- In Impostazioni versioni di prova, inserisci una versione di prova ed elimina le altre (fai clic con il pulsante destro del mouse ed elimina)
- In Impostazioni dati, crea le finestre di dialogo Risultati . Parametrizza i risultati per ora e per zona. Ad esempio, creare una finestra Risultati per l'output dei dati in minuti e un'altra per l'output dei dati in base al tempo totale (6 min). Richiedere l'output dei dati per ogni zona (richiederlo se è necessaria la distanza in ciascuna zona). Collegare le diverse finestre dei risultati alla finestra Start con le frecce.
- In Analizza impostazioni, selezionare i parametri da analizzare e il tipo di statistiche per ciascun parametro. Questi parametri verranno calcolati automaticamente in base ai dati acquisiti dal tracciamento.
- Per NTT e SPT, selezionare le opzioni definite di seguito:
- Selezionare Distanza percorsa (selezionare Totale) per ottenere la distanza percorsa nell'arena (cm) e la distanza percorsa nelle rispettive zone (cm).
- Selezionare In zone (selezionare Zone, Frequenza, Cumulativo e Latenza alla prima) per avere il tempo trascorso nelle zone e la latenza fino al primo ingresso nelle zone.
- Selezionare Transizione zona (selezionare Soglia: 0 cm, Aggiungi Zona 1 > Zona 2; Zona 2 > Zona 1, in qualsiasi zona, Frequenza) per ottenere il numero di ingressi nelle zone.
- Selezionare Mobility Sate (inserire High mobile above 70%, Immobile below 3%, minimum 150 frames e selezionare frequency, cumulative e latency to first) per avere la durata dell'ipermobilità (s), la durata del congelamento (s).
NOTA: vedere la sezione Discussione per maggiori dettagli sull'approssimazione del comportamento di congelamento utilizzando l'analisi automatizzata e sul numero e la durata degli episodi di congelamento. - Selezionare Accelerazione e Angolo di sterzata (selezionare la frequenza e cumulativo) per valutare il verificarsi di comportamenti complessi come guizzi e irregolarità (movimenti di accelerazione rapida).
- Per il ST, oltre ai parametri esplorativi di cui sopra, selezionare l'opzione Distanza tra i soggetti (selezionare tutti i soggetti, media, massima, minima) per ottenere la distanza media tra i pesci (cm), la distanza media tra il vicino più vicino (cm) e la distanza media tra il vicino più lontano.
- Per NTT e SPT, selezionare le opzioni definite di seguito:
- Il modello è pronto per l'uso. Salva le ultime modifiche e chiudi il modello senza acquisire alcun dato dal video (mantieni il file del modello; è leggero e facile da gestire e copiare). Se sono presenti più licenze software, analizza i video dello stesso modello copiato su ciascun computer.
- Per copiare e utilizzare il modello, sono disponibili due opzioni:
- Apri il file modello con il software di analisi del comportamento, vai su File > Salva con nome per creare un nuovo file identico.
- Nell'interfaccia di benvenuto, seleziona Nuovo da modello > Applicato un modello personalizzato > Da file video (scegli modello. EthXV). Assegna un nome al nuovo esperimento e selezionane la posizione. Il software potrebbe impiegare alcuni minuti per copiare le informazioni dal file modello.
- Vai su Impostazioni Arena per regolare nuovamente il modello se il video è stato registrato con una videocamera diversa (segui i passaggi 4.6 e 4.7).
- Andare su Impostazioni di rilevamento o Acquisizione per verificare quale video è selezionato e, se necessario, modificare il file video.
- In Acquisizione selezionare DDS > Pronto per iniziare. Potrebbero essere necessari alcuni minuti prima che il software elabori il video.
- Al termine dell'acquisizione, vai a Track Editor. Seleziona l'accelerazione x16 per leggere il video elaborato più velocemente e controlla se il tracciamento è corretto.
NOTA: A volte, potrebbero esserci "perdite" nel tracciamento (a causa di riflessioni o confusione del software stesso). Possono essere modificati manualmente da questa parte se sono pochi; in caso contrario, è preferibile rielaborare l'intero esperimento, migliorando la definizione della tela e la rilevazione. - In Statistiche, fare clic su Calcola > Esporta dati. L'esportazione dei dati si trova direttamente nella cartella dell'esperimento.
- In Visualizzazione traccia o Mappe di calore, genera ed esporta (clic destro, esporta immagine, seleziona la cartella Esporta file dell'esperimento per salvare questi dati con il report del foglio di calcolo) le immagini di tracciamento dell'animale.
- Vai su File per chiudere l'esperimento attivo e ripeti questa procedura per il video successivo.
5. Analisi statistica
- Analizzare la normalità (test di Shapiro-Wilk) dei dati in ciascun gruppo.
- Valuta l'omoschedasticità con il test di Levene.
- Utilizzare l'ANOVA unidirezionale seguita dai test di confronto multipli di Dunnett e Tukey per testare le differenze tra i gruppi quando i criteri di normalità e omoschedasticità non possono essere rifiutati.
- Utilizzare il test di Kruskal-Wallis seguito da un confronto a coppie utilizzando la correzione di Bonferroni per testare le differenze tra i gruppi quando i criteri di normalità e omoschedasticità vengono rifiutati.
- Tracciare i dati con un software grafico.
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Representative Results
In questa sezione, esamineremo alcune possibili applicazioni di questi strumenti comportamentali nella neurotossicologia dei pesci. I seguenti risultati corrispondono alla caratterizzazione degli effetti acuti o di abbuffata della metanfetamina (METH), una droga ricreativa, e degli effetti sub-cronici del glifosato, uno dei principali erbicidi presenti negli ecosistemi acquatici.
Caratterizzazione di un modello di neurotossicità da metanfetamina in zebrafish adulto
Nel valutare l'effetto di 40 mg/L di METH su NTT (Figura 3), il test di Kruskal-Wallis ha confermato che gli animali esposti presentavano una geotassi positiva, caratterizzata da una diminuzione del tempo di esplorazione nella zona superiore della vasca sperimentale (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), nonché nella distanza percorsa in questa parte (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) e nel numero di visite (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Abbiamo anche osservato un aumento significativo del tempo di latenza che precede la prima visita alla zona superiore (H(2) = 17,264, P = 0,00018). È importante notare che le differenze osservate nei parametri misurati nell'NTT dopo l'esposizione a METH sono coerenti nel tempo, come confermato dalla correzione di Bonferroni (P > 0,8). È stato riscontrato un effetto significativo del tempo di esposizione per il comportamento di congelamento (H(2) = 13,120, P = 0,0014).
Figura 3: Comportamento ansioso valutato in un nuovo test standard di 6 minuti (NTT) di pesce zebra adulto esposto a 40 mg/L di metanfetamina (METH) per 3 ore e 48 ore. I dati di ciascun esperimento sono stati normalizzati ai corrispondenti valori di controllo. I dati combinati sono riportati come grafico a dispersione con la mediana (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Test di Kruskal Wallis con correzione di Bonferroni per endpoint NTT. Dati provenienti da 2 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Bedrossiantz et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I movimenti di congelamento possono essere quantificati valutando la frequenza, la latenza, la durata o la posizione del congelamento. Il modo migliore per valutarli è senza dubbio l'occhio di un osservatore esperto, che è piuttosto laborioso e complesso, quindi abbiamo provato un'alternativa automatizzata utilizzando il software EthoVision per rilevare il comportamento di congelamento19. Abbiamo scoperto che il numero, la latenza e la durata degli attacchi di congelamento calcolati dal software (Tabella 1A) sono correlati con buona precisione con gli episodi valutati manualmente dall'osservatore (Tabella 1B). Mentre i due metodi sono equivalenti in termini di risultati (P = 0,958, test di Student), abbiamo utilizzato l'approccio automatizzato per valutare il congelamento qui. Dopo 3 ore di esposizione alla metanfetamina, il tempo di congelamento è aumentato significativamente (P = 0,0012), mentre non è stata riscontrata alcuna differenza con il controllo dopo 48 ore di esposizione (P = 0,16). La metanfetamina non ha prodotto alcun effetto sui movimenti irregolari in entrambi i momenti.
Abbiamo utilizzato due paradigmi sperimentali per valutare gli effetti sul comportamento sociale dopo l'esposizione acuta alla metanfetamina. La ST (Figura 4) ha rivelato che la distanza media e la distanza più lontana tra gli individui erano significativamente maggiori per i pesci trattati con METH (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 per le distanze medie e più lontane, rispettivamente), indicando un fenotipo comportamentale di isolamento sociale. Ancora una volta, osserviamo che non è stato riscontrato alcun effetto temporale utilizzando il test post hoc di Bonferroni (P > 0,5).
Figura 4: Comportamento sociale del pesce zebra adulto esposto in acqua a 40 mg/L di metanfetamina (METH) per 3 ore e 48 ore. Risultati del test di Shoaling (ST), comprese le distanze medie e più lontane tra i pesci. I dati combinati sono riportati come grafico a dispersione con la mediana (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Test di Kruskal Wallis con correzione di Bonferroni. Dati provenienti da 2 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Bedrossiantz et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nell'SPT (Figura 5), i pesci trattati mostrano una significativa diminuzione del tempo trascorso e della distanza percorsa nella zona conspecifica (F(2,74) = 14.497, P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13.461, P = 0.00001 rispettivamente per il tempo trascorso e la distanza percorsa nella zona conspecifica). Questi risultati riaffermano il fenotipo di isolamento sociale suggerito dai risultati della TS. Il test post hoc Honest Significant Difference (HSD) di Tukey non ha escluso possibili differenze tra i due tempi di analisi (P > 0,5).
Figura 5: Comportamento sociale del pesce zebra adulto esposto in acqua a 40 mg/L di metanfetamina (METH) per 3 ore e 48 ore. I risultati del test di preferenza sociale (SPT), inclusi il tempo e la distanza dei pesci in ciascuna delle tre zone virtuali della vasca sperimentale: vuota, centrale e conspecifica. I dati di ciascun esperimento sono stati normalizzati ai corrispondenti valori di controllo. I dati combinati sono riportati come grafico a dispersione con la mediana (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Dunnett. Dati provenienti da 2 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Bedrossiantz et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Effetto comportamentale dell'esposizione subcronica ai livelli ambientali di glifosato
L'analisi comportamentale degli effetti dell'esposizione sub-cronica a 3 μg/L di glifosato sull'NTT (Figura 6) rivela una significativa diminuzione del tempo trascorso ad esplorare la cima (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), della distanza percorsa in questa parte (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) e del numero di visite (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Questi effetti sono caratteristici del comportamento positivo della geotassi, così come l'aumento dell'effetto osservato sul tempo di latenza che precede la prima visita alla parte superiore della vasca (H(2) = 9,628, P = 0,008). L'espressione di comportamenti erratici e congelanti degli animali esposti è stata analizzata anche nel NTT. La durata (H(2) = 17.261, P = 0.025) e il numero di episodi irregolari (F2,76 = 10.073, P = 0.0001) sono stati significativamente aumentati dal glifosato. Al contrario, non sono state riscontrate differenze di congelamento con il controllo (Pearson Chi-Square(2) = 2,964, P = 0,253). Applicate a un contesto ecologico, le osservazioni fatte a NTT suggeriscono che il glifosato potrebbe diminuire significativamente il comportamento esplorativo dei pesci, mettendo a repentaglio la loro capacità di sopravvivere in natura.
Figura 6: Comportamento ansioso valutato in un nuovo test standard di 6 minuti (NTT) di pesce zebra adulto esposto a 0,3 μg/L e 3 μg/L di glifosato per 2 settimane. Parametri comportamentali analizzati, oltre ad un cartone animato della vasca sperimentale divisa in due zone virtuali uguali, in alto e in basso. Dati riportati come grafico a dispersione con la mediana (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Dunnett (Distanza totale, Distanza in alto, Tempo in alto, Transizioni verso l'alto, Attacchi irregolari, Alta frequenza di mobilità) o test di Kruskal Wallis con correzione di Bonferroni (Latenza verso l'alto, Durata irregolare). Non sono state riscontrate differenze (P > 0,05) nella durata del congelamento e negli attacchi di congelamento. Dati provenienti da 2-4 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Faria et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La scolarizzazione, gruppi non polarizzati di conspecifici che sono tenuti insieme dalla pressione sociale per proteggersi dai predatori, è una tendenza naturale di Danio rerio. Il branco può "stringersi" o "espandersi" a seconda del livello di ansia o paura degli animali, un particolare effetto visivo che è molto facile da identificare sperimentalmente (Figura 7). Nell'esperimento del glifosato, il test di shoaling ha rivelato un aumento dell'ansia nei pesci esposti a 3 μg/L, riflesso da un raggruppamento del branco e quindi una significativa diminuzione della distanza media e della distanza più lontana tra gli individui (F2,56 = 5,664, P = 0,006 e F2,56 = 7,413, P = 0,001, per le distanze medie e più lontane tra i pesci, rispettivamente) rispetto al controllo.
Figura 7: Comportamento sociale del pesce zebra adulto esposto in acqua a glifosato 0,3 μg/L e 3 μg/L per 2 settimane. Dati riportati come grafico a dispersione con la mediana (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Dunnett (distanza media tra i pesci e distanza più lontana) Dati da 2 a 4 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Faria et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Un'approssimazione del comportamento di congelamento utilizzando un'analisi automatizzata. I dati riportati in questa tabella provengono dalla stessa registrazione (Video 1) analizzata con due metodi diversi. (A) Approssimazione del comportamento di congelamento mediante calcolo automatico con il software EthoVision V13. La mobilità variabile è calcolata dal cambiamento dell'area tematica tra due campioni, quindi dipende dalla frequenza di acquisizione di quest'area. Abbiamo impostato una soglia di immobilità molto bassa (meno del 3% di mobilità) e la frequenza di campionamento a un tempo continuo minimo di 5 s (più di 150 fotogrammi). (B) Analisi del comportamento di congelamento con Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, software libero e open-source). BORIS è un software di registrazione degli eventi per la codifica video e le osservazioni dal vivo. Con BORIS, l'osservatore può codificare l'episodio di congelamento come un evento di stato, definendo i punti di inizio e di fine. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Video 1: Pesci di controllo nel nuovo test in vasca. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
I comportamenti ansiosi caratteristici osservati nella NTT sono stati correlati positivamente con i livelli di serotonina analizzati nel cervello21. Ad esempio, dopo l'esposizione alla para-clorofenilalalanina (PCPA), un inibitore della biosintesi della 5-HT, i pesci hanno mostrato geotassi positiva e livelli cerebrali di 5-HTdiminuiti 22, risultati molto simili a quelli ottenuti con la metanfetania. Pertanto, la diminuzione dei livelli di serotonina cerebrale e la visualizzazione di geotassi positive nel pesce zebra esposto a METH suggerisce che il comportamento ansioso prodotto dal farmaco è mediato dalla via serotoninergica. È interessante notare che un fenotipo comportamentale simile, cioè un effetto ansiogeno sulla geotassi, può essere osservato in pesci zebra adulti esposti per 2 settimane a 0,3 3 μg/L e 3 μg/L, due concentrazioni di glifosato rilevanti per l'ambiente. Un aumento della geotassi è stato segnalato in precedenza anche per il pesce zebra adulto con l'acrilammideneurotossica 6,23. In tutti questi casi, questo fenotipo comportamentale (un aumento della geotassi nella NTT, caratteristica della sostanza ansiogena) è stato associato alla diminuzione dei livelli di neurotrasmettitori monoaminergici. Pertanto, il paradigma NTT combinato con l'analisi neurochimica del cervello fornisce informazioni ecologicamente rilevanti, comportamento esplorativo ed efficienza di foraggiamento e collega i neurofenotipi comportamentali con le modulazioni dei neurotrasmettitori.
D'altra parte, una compromissione dei comportamenti sociali in entrambi i saggi, ST e SPT, è stata osservata anche nei pesci trattati con METH. Il risultato ottenuto in questo studio è coerente con diversi studi su ratti e scimmie, in cui l'esposizione acuta e cronica degli animali in studio alla metanfetamina provoca il ritiro sociale24. I cambiamenti del comportamento sociale associati all'abuso di metanfetamina sono stati spiegati negli esseri umani da menomazioni nella funzione socio-cognitiva24. Un effetto ansiogeno sulle dimensioni del branco è stato riscontrato nel pesce zebra esposto per 2 settimane a 3 μg/L di glifosato. Abbiamo osservato una fenocopia di questo effetto nel pesce zebra esposto a 53 mg/L (0,75 mM) di acrilammide per 3 giorni 6,23.
I saggi NTT, ST e SPT consentono di determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici25 di un'ampia gamma di sostanze chimiche, come illustrato dallo studio di modelli di tossicità acuta da metanfetamina e glifosato sub-cronica in zebrafish adulti. Il comportamento è, in tossicologia, un endpoint apicale rilevante, che caratterizza gli effetti a livello dell'organismo di una sostanza chimica per la neurotossicità e la ricerca ambientale. Oltre ad essere un endpoint subletale in condizioni di laboratorio, i cambiamenti nei comportamenti, come il comportamento esplorativo o sociale, possono essere di natura deleteria. Inoltre, la batteria di analisi comportamentale proposta è un metodo semi-automatizzato facile da implementare11 e, quindi, molto efficiente se i saggi sono pianificati consapevolmente (principio di riduzione)26. L'esecuzione di questi test come batteria di prova utilizzando un singolo serbatoio riduce il numero di animali e il tempo sperimentale e la produzione di rifiuti.
L'ordine dei saggi nella batteria è una considerazione importante se vogliamo studiare il profilo di risposta di un individuo in ogni studio. A tal fine, l'esecuzione dei singoli saggi seguiti (vedi Figura 2) consente di mantenere l'animale identificato e di correlare il suo comportamento esplorativo con le sue preferenze sociali. Inoltre, le risposte comportamentali dell'animale possono essere correlate ad altri dati biologici, come il profilo dei neurotrasmettitori o l'espressione genica, se i pesci vengono mantenuti identificati fino al punto finale del campionamento (Figura 2A).
Di solito, l'analisi comportamentale consente di osservare le differenze tra i gruppi. In primo luogo, le risposte individuali vengono calcolate sulla base del monitoraggio degli animali27 prima di raggruppare i dati per gruppo. Quindi, le medie e la differenza di varianza rispetto al gruppo di controllo vengono confrontate per ogni parametro comportamentale calcolato. Con l'analisi del branco12, è fondamentale essere molto chiari sul fatto che l'unità di varianza è il gruppo di pesci di prova, non i singoli pesci perché il comportamento di ogni singolo pesce è influenzato dagli altri pesci del branco. Questo è il modo utilizzato nella maggior parte degli articoli per elaborare i dati comportamentali28. Tuttavia, potrebbe essere utile ripensare l'analisi dei parametri comportamentali non su base parametro per parametro, ma come risposta complessiva per studio. Ad esempio, si potrebbe calcolare la covarianza di ogni misurazione effettuata in uno studio e riportarla come un modo diverso di misurare la stessa cosa: comportamento ansioso, esplorativo o gregario. Ci sono molti modi per calcolare e interpretare i dati comportamentali28,29. A seconda del numero di condizioni, del tipo di test e dell'acquisizione di immagini (2D o 3D)30,31 l'analisi può essere completamente ripensata per ottenere il meglio dai dati.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da "Agencia Estatal de Investigación" del Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (progetto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro di eccellenza Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz è stata sostenuta da una borsa di dottorato (PRE2018-083513) cofinanziata dal governo spagnolo e dal Fondo sociale europeo (FSE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
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