Summary
在这里，我们描述了一种在受精后 5 天从斑马鱼幼虫中分离肠道的方法，用于单细胞 RNA 测序分析。
Abstract
胃肠道 （GI） 执行一系列对生命至关重要的功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠道神经肌肉疾病，这凸显了了解胃肠道发育和功能障碍的分子机制的重要性。在这项研究中，我们提出了一种在受精后 5 天从斑马鱼幼虫中分离肠道的方法，以获得可用于单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 分析的活细胞。该协议基于斑马鱼肠道的手动解剖，然后与木瓜蛋白酶酶解离。随后，将细胞提交荧光激活细胞分选，并收集活细胞进行scRNA-seq。通过这种方法，我们能够成功地识别不同的肠道细胞类型，包括上皮细胞、基质细胞、血液细胞、肌肉细胞和免疫细胞，以及肠道神经元和神经胶质细胞。因此，我们认为它是使用斑马鱼研究胃肠道在健康和疾病中的组成方面的宝贵资源。
Introduction
胃肠道 （GI） 是一个复杂的系统，在整体健康和福祉中起着至关重要的作用。它负责营养物质的消化和吸收，以及废物的消除 1,2。胃肠道由多种细胞类型组成，包括上皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞和肠神经系统 （ENS），它们紧密地相互通信以调节和维持适当的肠道功能 3,4,5。胃肠道发育的缺陷会对营养吸收、微生物群组成、肠脑轴和 ENS 等各个方面产生深远的影响，导致多种肠道神经肌肉疾病，例如先天性巨结肠和慢性假性肠梗阻 6,7。这些疾病的特征是由各种关键细胞（例如 Cajal 的间质细胞、平滑肌细胞和 ENS 6,8,9）的改变引起的严重肠道运动障碍。然而，胃肠道发育和功能障碍的分子机制仍然知之甚少。
斑马鱼是研究胃肠道发育和功能障碍的有价值的模式生物，因为它具有快速的胚胎发育、胚胎和幼虫阶段的透明度以及遗传可处理性 10,11,12,13,14。有许多表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系可供选择。这种品系的一个例子是tg（phox2bb：GFP）斑马鱼，通常用于研究ENS，因为所有phox2bb+细胞，包括肠神经元，都被标记为15,16。在这里，使用tg（phox2bb：GFP）斑马鱼系，我们提出了一种在受精后5天（dpf）幼虫肠道分离的方法，用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图1）。
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Protocol
所有斑马鱼的饲养和实验都是根据伊拉斯谟MC和动物福利立法的制度准则进行的。受精后 5 天使用斑马鱼幼虫属于不需要正式伦理批准的实验类别，如荷兰法规所述。
1.获得受精后5天（dpf）野生型和tg（phox2bb：GFP）幼虫
- 设置野生型斑马鱼的繁殖，并在 15 cm 培养皿中收集 50 个卵在 HEPES 缓冲的 E3 培养基（以下简称 E3）中。使用这些鱼作为荧光激活细胞分选（FAC）的阴性对照。
- 设置tg（phox2bb：GFP）斑马鱼的繁殖，并在15厘米培养皿中收集E3中的约300个卵。
- 在28.5°C的培养箱中，以14小时/ 10小时的光照/黑暗循环将受精卵保持在E3（最多50个鸡蛋/培养皿）中。
- 在 1 dpf 下，取出未受精的卵子，让受精的卵子发育到 5 dpf。
- 选择 1 dpf 的 tg（phox2bb：GFP） 幼虫。
2.野生型全幼虫解离
- 用0.016%Tricaine麻醉5 dpf幼虫。
- 在含有 1 mL 10x 胰蛋白酶-EDTA 溶液的培养皿中使用剃须刀片将 30 条斑马鱼切成小块。
- 将切碎的斑马鱼转移到总体积为 2 mL 的 10x 胰蛋白酶-EDTA 溶液的微量离心管中，并在冰上放置 3 小时。每小时用P1000移液器上下移液一次，以刺激解离。
3.肠道隔离
- 在解剖显微镜下，将用 0.016% Tricaine 麻醉的 6-10 个 5 dpf 幼虫连续放置在 1.8% 琼脂糖平板（0.45 g 琼脂糖在 25 mL E3 中）上
- 在斑马鱼的头上放一根昆虫针。
- 用纸巾去除所有剩余的 E3。
- 使用另一个昆虫别针隔离肠道，不要干扰任何其他器官。确保去除了蛋黄（补充图S1A）。
- 分离后，检查肠道并根据需要去除所有非肠道物质（例如皮肤、脂肪、肝脏）。
- 用镊子收集肠道并将其置于含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）和10%胎牛血清（FCS）的微量离心管中，置于冰上。
注意：应分离至少 244 个肠子，将总解剖时间保持在 3 小时。这在两个人并行工作的情况下是可行的。
4.肠道解离
- 解剖所有肠后，立即将微量离心管全速（13,800× g）离心30秒。
- 取出PBS / 10%FCS，但保留少量（~100μL）以防止肠道变干。在含有 CaCl2 和 MgCl 2 的 HBSS 中加入 500 μL 2.17 mg/mL 木瓜蛋白酶以 解离细胞。
- 用 2.5 μL 半胱氨酸 （1 M） 激活木瓜蛋白酶。
- 将内脏在37°C的水浴中孵育10分钟。中途上下移液（5分钟后）以刺激酶组织消化。
- 使用 35 μm 细胞过滤器将细胞转移到 FACS 管中，预润湿 0.5 mL PBS/10% FCS。
- 以 0.5 mL 为步长，加入总共 2 mL 的 PBS/10% FCS，清洗过滤器。
- 在4°C下以700× g 离心5分钟。
- 除去上清液，将沉淀重悬于300μL PBS / 10%FCS中。
- 加入 1 μg/mL 的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 以标记死细胞 （1：1,000） 并孵育 5 分钟以使其在 FACS 期间排除。
5. 流式细胞仪富集
- 通过在流式细胞仪上记录 3,000个细胞 ，使用野生型样品设置分选细胞群的门（补充图S1B-E）。
- 使用 100 μm 喷嘴，设置纯度的分选精度，并将含有 200 μL PBS/5% FCS 的收集管放入 FACS 机器中。
- 通过排除双联体（图2B）和死细胞（图2C），将肠道的细胞悬液加载并将活的（DAPI阴性）单细胞分类到收集管中（图2C）。
注：对于tg（phox2bb）斑马鱼，仅检查GFP + 细胞的比例作为参考，因为所有单个活细胞都经过分选。 - 细胞分选后将收集管保持在冰上。
- 用血细胞计数器计数细胞悬液，包括用台盼蓝检查活力。如果存活率至少为 80%，请继续下一步。
- 细胞现在可以处理 scRNAseq（即 10x Genomics Chromium 平台）。每个样品使用大约 20,000 个细胞。
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Representative Results
通过该协议，我们成功地从5个dpf幼虫中分离和解离了整个肠道。使用木瓜蛋白酶作为解离酶，我们显着增强了细胞活力，能够在 244 个分离的肠道中捕获 46,139 个涉及单个活细胞（占所有细胞的 6.4%）的事件（图 2A）。使用野生型全幼虫作为对照，以确保分选过程得到优化，从而实现有效的细胞鉴定和分选。整个幼虫可以用于我们只对活的单细胞进行分类（补充图S1B-E）。随后将所有分选的肠道细胞提交至scRNA seq平台。总共对 9,858 个细胞进行了测序，每个细胞的平均读数为 21,106。对于scRNA-seq分析，我们使用了Seurat V317。总共鉴定了代表 12 种不同细胞类型的 48 个簇，包括上皮细胞、基质细胞、血液细胞、肌肉细胞和免疫细胞，以及肠道神经元和神经胶质细胞18。
图 1：分离斑马鱼肠道单细胞 RNA 测序的实验设计。 缩写：FACS = 荧光激活细胞分选;scRNA-seq = 单细胞 RNA 测序。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：从斑马鱼肠道中分选活的单个细胞的门控策略。 （A） 使用 FCS/SSC 尺寸门控进行分选后分析。（B） 双重歧视。（C） 活细胞/死细胞门控和分选细胞群。（D） Phox2bb：GFP+细胞存在于分选的活细胞群中。在每个面板中，显示了门控细胞的百分比。缩写：FCS-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度;GFP = 绿色荧光蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图S1：从整个野生型斑马鱼幼虫中分选活的单细胞的肠道分离和门控策略。 （A） 受精后 5 天斑马鱼幼虫肠道分离的明场图像。红线表示解剖线。（B） 分选后分析，显示所有具有 FCS/SSC 大小门控的细胞 。（C） 单线态选择。（D） DAPI门控。（E） Phox2bb：GFP+门控。门控细胞的百分比显示在每个面板中。 缩写：FCS-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度;GFP = 绿色荧光蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
在这里，我们提出了一种使用FACS分离和解离5 dpf斑马鱼幼虫肠道的方法。通过这种方法，使用10x Genomics Chromium平台，通过scRNA-seq成功收集和分析了不同的肠道细胞类型。我们选择了tg（phox2bb：GFP）斑马鱼系，因为我们想要一个迹象，表明活的ENS细胞也将被分离出来（图2D）。然而，重要的是要注意，这种方法可以很容易地扩展到其他感兴趣的斑马鱼品系，因为我们只使用phox2bb门控来评估神经元活力，而不是选择特定的细胞群。由于我们决定使用无偏倚的方法来收集 5 dpf 下存在的所有肠道细胞，因此分选标准主要取决于识别活的单个细胞。这也是使用整个幼虫来建立可靠且一致的门控策略的原因。考虑到分离单个肠道所涉及的劳动，在本实验的给定时间范围内分离更多的肠道作为阴性对照变得不切实际。因此，虽然我们承认整个幼虫的细胞类型与肠道中发现的细胞类型不同，甚至使用了不同的解离方法，但值得注意的是，用于对肠道细胞进行分类的门控策略最初可以使用整个幼虫进行验证，因为我们只对评估细胞活力感兴趣。
为了进行scRNA-seq，该方案中的一个关键步骤是分离足够数量的活细胞（~20,000个细胞）。同时，肠道分离所花费的时间应尽可能短，以避免对细胞活力产生不利影响。以前关注斑马鱼幼虫肠的报告使用Accutase或胰蛋白酶进行细胞解离19,20,21。然而，虽然两种解离酶都能够分离出足够多的活细胞用于 scRNA-seq，但 accutase 不允许捕获肠道神经元细胞19,20。然而，胰蛋白酶主要捕获上皮细胞，仅产生少量的肠道神经元细胞21。木瓜蛋白酶因其温和性而广为人知，这对保持肠道神经元完整性特别有益22。我们的结果表明，木瓜蛋白酶确实能有效维持神经元细胞的活力，证实了这种酶用于消化斑马鱼成年视网膜和大脑的先前应用23,24。然而，值得一提的是，即使使用木瓜蛋白酶，肠道分离和解离后的细胞活力也仅为 6.4%。这表明，随后的FACS步骤对于选择活细胞至关重要。这种结果可以被认为是一种局限性，特别是在处理稀缺且难以捕获的目标细胞时。
未来的研究应侧重于新的解离方法，以提高分离方案期间的细胞活力。一旦增加，该方法就可用于分选报告基因阳性细胞并对特定肠道细胞类型进行scRNA-seq。然而，这里介绍的方法允许捕获足够的活细胞，以便随后鉴定肠道内的不同细胞类型，例如上皮细胞、基质细胞、血液、肌肉、免疫细胞，甚至肠道神经元和神经胶质细胞，这些细胞以前没有使用类似的方法在这个细胞阶段被捕获。由于分离和分析这些不同细胞类型的能力对于更深入地了解胃肠道发育和功能障碍至关重要，我们认为这种方法特别有价值，因为它提供了一种可靠的方法来研究使用斑马鱼作为模式生物的肠道成分。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作由索菲亚基金会之友（SSWO WAR-63）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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