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Developmental Biology

एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65876
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1
1Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology, the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology, Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology, Maastricht University Medical Center

Summary

यहां, हम एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए 5 दिनों के बाद निषेचन में जेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ जीवन के लिए आवश्यक कार्यों की एक श्रृंखला करता है। इसके विकास को प्रभावित करने वाले जन्मजात दोष एंटरिक न्यूरोमस्कुलर विकारों को जन्म दे सकते हैं, जीआई विकास और शिथिलता के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के महत्व पर प्रकाश डालते हैं। इस अध्ययन में, हम जीवित, व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए निषेचन के 5 दिनों के बाद जेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफिश आंत के मैनुअल विच्छेदन पर आधारित है, इसके बाद पपैन के साथ एंजाइमेटिक पृथक्करण होता है। इसके बाद, कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए प्रस्तुत किया जाता है, और व्यवहार्य कोशिकाओं को स्आरएनए-सीक्यू के लिए एकत्र किया जाता है। इस पद्धति के साथ, हम उपकला, स्ट्रोमल, रक्त, मांसपेशी, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, साथ ही एंटरिक न्यूरॉन्स और ग्लिया सहित विभिन्न आंतों के सेल प्रकारों की सफलतापूर्वक पहचान करने में सक्षम थे। इसलिए, हम इसे ज़ेब्राफिश का उपयोग करके स्वास्थ्य और बीमारी में जीआई पथ की संरचना का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन मानते हैं।

Introduction

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ एक जटिल प्रणाली है जो समग्र स्वास्थ्य और कल्याण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यह पाचन और पोषक तत्वों के अवशोषण, साथ ही अपशिष्ट उत्पादों 1,2 के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार है. जीआई पथ उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और एंटरिक तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) सहित कई सेल प्रकारों से बना है, जो उचित आंतों के कार्य 3,4,5को विनियमित करने और बनाए रखने के लिए एक साथ निकटता से संवाद करते हैं। जीआई पथ के विकास में दोष पोषक तत्व अवशोषण, माइक्रोबायोटा संरचना, आंत-मस्तिष्क अक्ष, और ईएनएस जैसे विभिन्न पहलुओं पर दूरगामी प्रभाव डाल सकते हैं, जिससे कई एंटरिक न्यूरोमस्कुलर विकार हो सकते हैं, जैसे कि हिर्स्चस्प्रंग रोग और क्रोनिक आंतों के छद्म रुकावट 6,7। इन विकारों को विभिन्न प्रमुख कोशिकाओं में परिवर्तन के कारण गंभीर आंत डिस्मोटिलिटी की विशेषता है, जैसे कि काजल की अंतरालीय कोशिकाएं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं और ईएनएस 6,8,9। हालांकि, जीआई विकास और शिथिलता के अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी खराब समझे जाते हैं।

ज़ेब्राफिश अपने तेजी से भ्रूण के विकास, भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान पारदर्शिता, और आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी 10,11,12,13,14के कारण जीआई विकास और शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कई ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनें उपलब्ध हैं। ऐसी रेखा का एक उदाहरण tg (phox2bb: GFP) जेब्राफिश है, जिसका उपयोग आमतौर पर ENS का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, क्योंकि एंटरिक न्यूरॉन्स सहित सभी phox2bb+ कोशिकाओं को15,16 लेबल किया जाता है। यहां, टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) जेब्राफिश लाइन का उपयोग करते हुए, हम एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण(चित्रा 1) के लिए 5 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) लार्वा के आंतों के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

सभी ज़ेब्राफिश पालन और प्रयोग इरास्मस एमसी और पशु कल्याण कानून के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे। निषेचन के बाद 5 दिनों में जेब्राफिश लार्वा का उपयोग उन प्रयोगों की श्रेणी में आता है जिन्हें औपचारिक नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं होती है, जैसा कि डच नियमों द्वारा उल्लिखित है।

1. 5 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) वाइल्डटाइप और टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) लार्वा प्राप्त करना

  1. वाइल्डटाइप जेब्राफिश का प्रजनन स्थापित करें और 15 सेमी पेट्री डिश में HEPES-बफर E3 माध्यम (इसके बाद E3 के रूप में संदर्भित) में 50 अंडे इकट्ठा करें। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (एफएसी) के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इन मछली का प्रयोग करें.
  2. टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) जेब्राफिश का प्रजनन सेट करें और 15 सेमी पेट्री डिश में ई 3 में लगभग 300 अंडे इकट्ठा करें।
  3. निषेचित अंडे E3 (अधिकतम 50 अंडे / पकवान) में 14 h/10 h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर, 28.5 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें।
  4. 1 डीपीएफ पर, अनिषेचित अंडे को हटा दें और निषेचित लोगों को 5 डीपीएफ तक विकसित होने दें।
  5. 1 डीपीएफ पर टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) लार्वा का चयन करें।

2. वाइल्डटाइप पूरे लार्वा पृथक्करण

  1. 0.016% ट्राइकेन के साथ 5 डीपीएफ लार्वा को एनेस्थेटाइज करें।
  2. 10x ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1 एमएल युक्त पेट्री डिश में रेजर ब्लेड का उपयोग करके 30 जेब्राफिश को छोटे टुकड़ों में काट लें।
  3. कटा हुआ ज़ेब्राफिश को 10x ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 2 एमएल की कुल मात्रा के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 घंटे के लिए बर्फ पर छोड़ दें। हदबंदी को प्रोत्साहित करने के लिए हर घंटे एक P1000 विंदुक के साथ पिपेट ऊपर और नीचे।

3. आंत अलगाव

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 1.8% एगरोज प्लेट (ई 3 के 25 एमएल में 0.45 ग्राम अगारोज) पर, एक पंक्ति में 0.016% ट्राइकेन के साथ 6-10 5 डीपीएफ लार्वा एनेस्थेटाइड रखें
  2. ज़ेब्राफिश के सिर में एक कीट पिन रखो।
  3. एक ऊतक का उपयोग कर शेष सभी E3 निकालें.
  4. किसी अन्य कीट पिन का उपयोग करके आंत को अलग करें, बिना किसी अन्य अंग को परेशान किए। सुनिश्चित करें कि जर्दी हटा दी गई है (पूरक चित्रा एस 1 ए)।
  5. एक बार अलग होने के बाद, आंत का निरीक्षण करें और यदि आवश्यक हो तो सभी गैर-आंतों की सामग्री (जैसे, त्वचा, वसा, यकृत) को हटा दें।
  6. चिमटी के साथ आंत लीजिए और बर्फ पर 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) युक्त, एक microcentrifuge ट्यूब में जगह है.
    नोट: 244 आंतों की एक न्यूनतम 3 घंटे में कुल विच्छेदन समय रखते हुए, अलग किया जाना चाहिए. यह समानांतर में काम करने वाले दो लोगों के साथ संभव है।

4. आंत पृथक्करण

  1. सभी आंतों के विच्छेदन के तुरंत बाद, 30 एस के लिए पूरी गति (13,800 × ग्राम) पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।
  2. पीबीएस / 10% एफसीएस निकालें लेकिन आंतों को सूखने से रोकने के लिए एक छोटी राशि (~ 100 माइक्रोन) छोड़ दें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए CaCl2 और MgCl2 युक्त HBSS में 2.17 mg/mL पपैन के 500 μL जोड़ें।
  3. सिस्टीन (1 एम) के 2.5 माइक्रोन के साथ पपैन को सक्रिय करें।
  4. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में हिम्मत सेते हैं. पिपेट ऊपर और नीचे आधे रास्ते (5 मिनट के बाद) एंजाइमी ऊतक पाचन को उत्तेजित करने के लिए.
  5. एक 35 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग कर एक FACS ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, पीबीएस / 10% एफसीएस के 0.5 एमएल के साथ prewetted.
  6. 0.5 एमएल चरणों में पीबीएस/10% एफसीएस के कुल 2 एमएल जोड़कर छलनी को धो लें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 700 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस/10% एफसीएस के 300 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. मृत कोशिकाओं (1:1,000) को लेबल करने के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के 1 माइक्रोग्राम/एमएल जोड़ें और एफएसीएस के दौरान उनके बहिष्करण की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

5. FACS संवर्धन

  1. प्रवाह साइटोमीटर (पूरक चित्रा एस 1 बी-ई) पर 3,000 कोशिकाओं को रिकॉर्ड करके क्रमबद्ध सेल आबादी के फाटकों को सेट करने के लिए वाइल्डटाइप नमूने का उपयोग करें।
  2. एक 100 माइक्रोन नोजल का उपयोग करें, शुद्धता पर सॉर्ट परिशुद्धता सेट करें, और एफएसीएस मशीन में पीबीएस / 5% एफसीएस के 200 माइक्रोन युक्त संग्रह ट्यूब डालें।
  3. हिम्मत के सेल निलंबन को लोड करें और संग्रह ट्यूब (चित्रा 2सी) में एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करें, डबल्स(चित्रा 2बी)और मृत कोशिकाओं(चित्रा 2सी)को छोड़कर।
    नोट: टीजी (फॉक्स 2 बीबी) जेब्राफिश के लिए, जीएफपी + कोशिकाओं का अनुपात केवल संदर्भ के लिए जांचा जाता है, क्योंकि सभी एकल जीवित कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जाता है।
  4. सेल छँटाई के बाद बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें.
  5. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल निलंबन की गणना करें, जिसमें ट्रिपैन ब्लू के साथ व्यवहार्यता जांच शामिल है। यदि व्यवहार्यता कम से कम 80% है, तो अगले चरण के साथ जारी रखें।
  6. कोशिकाएं अब scRNAseq (यानी, 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म) के लिए प्रक्रिया के लिए तैयार हैं। प्रति नमूना लगभग 20,000 कोशिकाओं का उपयोग करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के साथ, हमने 5 डीपीएफ लार्वा से पूरी आंतों के सफल अलगाव और पृथक्करण को हासिल किया। पृथक्करण एंजाइम के रूप में पपैन का उपयोग करते हुए, हमने सेल व्यवहार्यता को काफी बढ़ाया, जिससे 244 पृथक हिम्मत(चित्रा 2ए)में से एकल, व्यवहार्य कोशिकाओं (सभी कोशिकाओं का 6.4%) से जुड़े 46,139 घटनाओं पर कब्जा करने में सक्षम बनाया गया। वाइल्डटाइप पूरे लार्वा का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण के रूप में किया गया था कि छँटाई प्रक्रिया को अनुकूलित किया गया था, जिससे प्रभावी सेल पहचान और छँटाई सक्षम हो सके। पूरे लार्वा का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि हम केवल लाइव, एकल कोशिकाओं (पूरक चित्रा एस 1 बी-ई) के लिए सॉर्ट करते हैं। सभी क्रमबद्ध आंतों की कोशिकाओं को बाद में स्क्आरएनए सीक्यू प्लेटफॉर्म पर प्रस्तुत किया गया था। कुल मिलाकर, 9,858 कोशिकाओं को 21,106 के प्रति सेल औसत पढ़ने के साथ अनुक्रमित किया गया था। स्क्आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के लिए, हमने सेराट वी 317 का उपयोग किया। कुल मिलाकर, 48 समूहों की पहचान 12 विभिन्न सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व करने वाली की गई थी, जिनमें उपकला, स्ट्रोमल, रक्त, मांसपेशियों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ एंटरिक न्यूरॉन्स और ग्लिया18 शामिल थे।

Figure 1
चित्रा 1: पृथक जेब्राफिश हिम्मत के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए प्रायोगिक डिजाइन। संक्षिप्ताक्षर: FACS = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई; स्आरएनए-सीक्यू = एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जेब्राफिश आंत से लाइव, एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) एफसीएस / एसएससी आकार गेटिंग के साथ पोस्ट सॉर्ट विश्लेषण। (बी) दोहरा भेदभाव। (सी) लाइव/डेड सेल गेटिंग और सॉर्टेड पॉपुलेशन। (डी) फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी + कोशिकाएं क्रमबद्ध जीवित आबादी में मौजूद हैं। प्रत्येक पैनल में, गेटेड कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया गया है। संक्षिप्ताक्षर: FCS-A = आगे बिखराव-शिखर क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; FSC-H = आगे बिखराव-शिखर ऊंचाई; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; FITC = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: आंत अलगाव और पूरे वाइल्डटाइप जेब्राफिश लार्वा से एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए जीओटी। (ए) निषेचन के बाद 5 दिनों से आंत अलगाव की ब्राइटफील्ड छवि जेब्राफिश लार्वा। लाल रेखा विच्छेदन रेखा को इंगित करती है। (बी) पोस्ट-सॉर्ट विश्लेषण, एफसीएस / एसएससी आकार गेटिंग के साथ सभी कोशिकाओं को दिखा रहा है। (सी) सिंगलेट चयन। (D) DAPI गेटिंग। (ई) फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी + गेटिंग। गेटेड कोशिकाओं का प्रतिशत प्रत्येक पैनल में दिखाया गया है। संक्षिप्ताक्षर: FCS-A = आगे बिखराव-शिखर क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; FSC-H = आगे बिखराव-शिखर ऊंचाई; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; FITC = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम एफएसीएस का उपयोग करके 5 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा के आंत के अलगाव और पृथक्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस पद्धति के साथ, 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म का उपयोग करके स्आरएनए-सीक्यू द्वारा विभिन्न आंतों के सेल प्रकारों को सफलतापूर्वक एकत्र और विश्लेषण किया गया था। हमने टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) जेब्राफिश लाइन का चयन किया, क्योंकि हम एक संकेत चाहते थे कि व्यवहार्य ईएनएस कोशिकाओं को भी अलग किया जाएगा(चित्रा 2डी)। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस विधि को ब्याज की अन्य ज़ेब्राफिश लाइनों तक आसानी से बढ़ाया जा सकता है, क्योंकि हमने न्यूरोनल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए केवल phox2bb गेटिंग का उपयोग किया था, और एक विशिष्ट सेल आबादी के लिए चयन नहीं किया था। चूंकि हमने 5 डीपीएफ पर मौजूद सभी आंत कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण का उपयोग करने का निर्णय लिया है, इसलिए छँटाई मानदंड मुख्य रूप से जीवित, व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करने पर टिका है। एक विश्वसनीय और सुसंगत गेटिंग रणनीति स्थापित करने के लिए पूरे लार्वा के उपयोग के पीछे यह भी कारण है। व्यक्तिगत हिम्मत को अलग करने में शामिल श्रम को ध्यान में रखते हुए, इस प्रयोग के दिए गए समय सीमा के भीतर, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अधिक आंतों को अलग करना अव्यावहारिक हो जाता है। इसलिए, जबकि हम स्वीकार करते हैं कि पूरे लार्वा से सेल प्रकार आंत में पाए जाने वाले लोगों से भिन्न होते हैं, और यहां तक कि अलग-अलग पृथक्करण विधियों का उपयोग किया जाता था, यह उल्लेखनीय है कि आंतों की कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए लागू गेटिंग रणनीति को शुरू में पूरे लार्वा का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है, क्योंकि हम केवल सेल व्यवहार्यता का आकलन करने में रुचि रखते थे।

स्आरएनए-सीक करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं (~ 20,000 कोशिकाओं) को अलग करना होगा। इसी समय, आंत अलगाव के लिए बिताए गए समय को सेल व्यवहार्यता पर हानिकारक प्रभाव से बचने के लिए जितना संभव हो उतना कम रखा जाना चाहिए। पिछली रिपोर्ट zebrafish लार्वा आंतों पर ध्यान केंद्रित सेल पृथक्करण 19,20,21 के लिए accutase या trypsin रोजगार. हालांकि, जबकि दोनों पृथक्करण एंजाइमों scRNA-seq के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम थे, accutase एंटरिक न्यूरोनल कोशिकाओं19,20 के कब्जे की अनुमति नहीं थी. ट्रिप्सिन, हालांकि, मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया, केवल एंटरिक न्यूरोनल कोशिकाओं की एक कम संख्या21उपज. पपैन आमतौर पर अपनी कोमलता के लिए पहचाना जाता है, जो विशेष रूप से एंटरिक न्यूरोनल अखंडता22 के संरक्षण के लिए फायदेमंद हो सकता है। हमारे परिणामों से पता चला है कि पपैन वास्तव में न्यूरोनल कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने में प्रभावी है, पिछले अनुप्रयोगों की पुष्टि करता है जिसमें इस एंजाइम का उपयोग जेब्राफिश वयस्क रेटिना और मस्तिष्क23,24को पचाने के लिए किया गया था। हालांकि, यह उल्लेख करना उल्लेखनीय है कि पपैन के साथ भी, आंत अलगाव और पृथक्करण के बाद सेल व्यवहार्यता केवल 6.4% थी। इससे पता चलता है कि बाद का एफएसीएस कदम, इस प्रकार, व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तरह के परिणामों को एक सीमा माना जा सकता है, खासकर जब ब्याज की दुर्लभ और चुनौतीपूर्ण-से-कैप्चर कोशिकाओं से निपटते हैं।

भविष्य के अध्ययन अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए नए पृथक्करण तरीकों पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए. एक बार बढ़ने के बाद, यह विधि रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं को छांटने और विशिष्ट आंतों के सेल प्रकारों पर स्आरएनए-सीक्यू करने के लिए संभव हो जाती है। फिर भी, यहां प्रस्तुत विधि आंत के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों की बाद की पहचान के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं पर कब्जा करने की अनुमति देती है, जैसे कि उपकला, स्ट्रोमल, रक्त, मांसपेशियों, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और यहां तक कि एंटरिक न्यूरॉन्स और ग्लिया, जिन्हें पहले कब्जा नहीं किया गया है इसी तरह के दृष्टिकोणों का उपयोग करके इस सेल चरण में। चूंकि जीआई विकास और शिथिलता में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इन विभिन्न सेल प्रकारों को अलग करने और विश्लेषण करने की क्षमता आवश्यक है, इसलिए हम इस पद्धति को विशेष रूप से मूल्यवान मानते हैं, क्योंकि यह एक मॉडल जीव के रूप में ज़ेब्राफिश का उपयोग करके आंतों की संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सोफिया फाउंडेशन (SSWO WAR-63) के दोस्तों द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 201
एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव
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Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E.,… More

Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).

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