Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ仔魚の受精後5日目の腸管分離法について、シングルセルRNAシーケンシング解析法について述べる。
Abstract
消化管は、生命に不可欠なさまざまな機能を果たしています。その発達に影響を与える先天性欠損は、腸管性神経筋障害につながる可能性があり、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムを理解することの重要性を強調しています。本研究では、ゼブラフィッシュ仔魚を受精後5日目に腸管から分離し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)解析に使用できる生細胞を採取する方法を紹介します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腸の手動解剖と、それに続くパパインとの酵素解離に基づいています。その後、細胞を蛍光活性化セルソーティングにかけ、生細胞をscRNA-seq用に収集します。この方法により、上皮細胞、間質細胞、血液細胞、筋肉細胞、免疫細胞、腸神経細胞、グリアなど、さまざまな種類の腸細胞を同定することに成功しました。したがって、ゼブラフィッシュを使用して、健康と病気における消化管の組成を研究するための貴重なリソースであると考えています。
Introduction
消化管は、全体的な健康と幸福に重要な役割を果たす複雑なシステムです。それは栄養素の消化と吸収、そして老廃物の除去に関与しています1,2。消化管は、上皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、腸神経系(ENS)など、複数の細胞タイプで構成されており、これらは密接に通信して適切な腸機能を調節および維持しています3,4,5。消化管の発達における欠陥は、栄養吸収、微生物叢組成、腸脳軸、ENSなどのさまざまな側面に広範囲に影響を及ぼし、ヒルシュスプルング病や慢性腸偽閉塞などのいくつかの腸管性神経筋障害につながる可能性があります6,7。これらの障害は、カハールの間質細胞、平滑筋細胞、ENS 6,8,9などのさまざまな主要細胞の変化によって引き起こされる重度の腸管運動障害を特徴としています。しかし、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムはまだよくわかっていません。
ゼブラフィッシュは、胚発生の速さ、胚期および幼生期の透明性、遺伝的扱いやすさ10,11,12,13,14により、消化管の発達と機能障害を研究するための貴重なモデル生物です。蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統が多数存在します。このような系統の例は、腸ニューロンを含むすべてのphox2bb+細胞が15,16と標識されているため、ENSの研究に一般的に使用されるtg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュです。ここでは、tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュ系統を用いて、受精後5日(dpf)幼生の腸管分離法を1細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)解析で紹介します(図1)。
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Protocol
すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、エラスムスMCおよび動物福祉法の制度的ガイドラインに従って行われました。受精後5日目のゼブラフィッシュ幼生の使用は、オランダの規制で概説されているように、正式な倫理的承認を必要としない実験のカテゴリーに分類されます。
1. 受精後5日(dpf)野生型とtg(phox2bb:GFP)幼虫の獲得
- 野生型ゼブラフィッシュの繁殖を設定し、15cmのシャーレに入れたHEPES緩衝E3培地(以下、E3)に50個の卵を採取します。これらの魚を蛍光活性化細胞選別(FAC)のネガティブコントロールとして使用してください。
- tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュの繁殖を設定し、E3で約300個の卵を15cmシャーレに集めます。
- 受精卵をE3(最大50個/皿)で14時間/10時間の明暗サイクルで、28.5°Cのインキュベーターで保管します。
- 1dpfで、未受精卵を取り除き、受精卵を5dpfに成長させます。
- tg(phox2bb:GFP)幼虫を1dpfで選別します。
2. 野生型幼虫全体の解離
- 5 dpfの幼虫に0.016%トリカインを麻酔します。
- 10xトリプシン-EDTA溶液1 mLを含むペトリ皿にカミソリの刃を入れ、30匹のゼブラフィッシュを細かく刻みます。
- みじん切りにしたゼブラフィッシュを、総容量2 mLの10倍トリプシン-EDTA溶液を入れた微量遠心チューブに移し、氷上に3時間放置します。P1000ピペットで1時間ごとにピペットを上下に動かし、解離を刺激します。
3.腸の分離
- 0.016%トリカインで麻酔した6-10 5dpf幼虫を、1.8%アガロースプレート(E3 25 mL中0.45 gのアガロース)に連続して置き、解剖顕微鏡下に置く
- ゼブラフィッシュの頭に昆虫ピンを1つ入れます。
- ティッシュを使用して残りのE3をすべて除去します。
- 他の臓器を邪魔することなく、別の昆虫ピンを使用して腸を分離します。卵黄が取り除かれていることを確認してください(補足図S1A)。
- 分離したら、腸を検査し、必要に応じて腸以外の物質(皮膚、脂肪、肝臓など)をすべて取り除きます。
- ピンセットで腸を採取し、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む微量遠心チューブに入れ、氷上に入れます。
注:最低244個の腸を分離し、合計解剖時間を3時間に保つ必要があります。これは、2 人が並行して作業することで実現可能です。
4.腸の解離
- 全腸の解剖直後に、微量遠心チューブをフルスピード(13,800 × g)で30秒間遠心分離します。
- PBS/10% FCSを除去しますが、腸の乾燥を防ぐために少量(~100μL)を残します。CaCl2 と MgCl 2 を含む HBSS に 2.17 mg/mL のパパインを 500 μL 添加して細胞 を解離します。
- 2.5 μLのシステイン(1 M)でパパインを活性化します。
- 内臓を37°Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。ピペットを半分(5分後)まで上下に動かして、酵素組織消化を刺激します。
- 0.5 mLのPBS/10% FCSでプレウェットした35 μmのセルストレーナーを使用して、細胞をFACSチューブに移します。
- 合計2 mLのPBS/10%FCSを0.5 mLステップで添加して、ストレーナを洗浄します。
- 700 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、ペレットを300 μLのPBS/10% FCSに再懸濁します。
- 1 μg/mL の 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を死細胞(1:1,000)の標識に添加し、5 分間インキュベートして FACS 中にそれらを除外できるようにします。
5. FACSエンリッチメント
- ワイルドタイプサンプルを用いて、フローサイトメーターに 3,000個の細胞 を記録し、ソートした細胞集団のゲートを設定します(補足図S1B-E)。
- 100μmのノズルを使用し、純度に選別精度を設定し、200μLのPBS/5%FCSが入ったコレクションチューブをFACS装置に入れます。
- 腸の細胞懸濁液をロードし、ダブレット(図2B)と死細胞(図2C)を除外して、生細胞(DAPI陰性)の単一細胞をコレクションチューブ(図2C)に選別します。
注:tg(phox2bb)ゼブラフィッシュの場合、GFP+ 細胞の割合は、すべての単一の生細胞が選別されているため、参照用にのみチェックされます。 - 細胞選別後、コレクションチューブを氷上に保管してください。
- 血球計算盤で細胞懸濁液をカウントし、トリパンブルーによる生存率チェックを含めます。生存率が80%以上の場合は、次の手順に進みます。
- これで、細胞をscRNAseq(10x Genomics Chromiumプラットフォーム)で処理する準備が整いました。サンプルあたり約 20,000 個の細胞を使用します。
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Representative Results
このプロトコルにより、5 dpf 幼虫から腸全体の分離と解離に成功しました。パパインを解離酵素として使用することで、細胞の生存率が大幅に向上し、244個の単離された腸内から単一の生存細胞(全細胞の6.4%)を含む46,139個のイベントを捕捉することができました(図2A)。野生型全幼虫を対照として使用し、選別プロセスを最適化し、効果的な細胞の同定と選別を可能にしました。生の単一細胞のみを選別するため、全幼虫を使用できます(補足図S1B-E)。その後、選別されたすべての腸細胞をscRNA seqプラットフォームに提出しました。合計で、9,858個の細胞がシーケンシングされ、細胞あたりの平均リード数は21,106個でした。scRNA-seq解析には、Seurat V317を使用しました。合計で、上皮細胞、間質細胞、血液細胞、筋肉細胞、免疫細胞、腸ニューロン、グリアなど、12種類の細胞を代表する48のクラスターが同定されました18。
図1:単離されたゼブラフィッシュの腸の単一細胞RNAシーケンシングの実験計画。 略語:FACS = fluorescence-activated cell sorting;scRNA-seq = シングルセル RNA シーケンシング。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ゼブラフィッシュの腸から生きた単一細胞を選別するためのゲーティング戦略。 (A)FCS/SSCサイズゲーティングによるポストソート解析。(B) ダブレット差別。(C)生細胞/死細胞ゲーティングおよび選別された集団。(D)選別された生集団に存在するPhox2bb:GFP+細胞。各パネルには、ゲーテッドセルの割合が表示されます。略語: FCS-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-H = 前方散乱光ピーク高さ;GFP = 緑色蛍光タンパク質;FITC = フルオレセイン イソチオシアネート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:野生型ゼブラフィッシュ幼生全体から生きた単一細胞を選別するための腸管単離およびゲーティング戦略。 (A)ゼブラフィッシュ仔の受精後5日間の腸管分離の明視野画像。赤い線は解剖線を示します。(B) ポストソート解析で、FCS/SSCサイズゲーティングされたすべての細胞 を表示。(C)シングレットの選択。(D)DAPIゲーティング。(E) Phox2bb:GFP+ゲーティング。ゲートされたセルの割合が各パネルに表示されます。 略語: FCS-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-H = 前方散乱光ピーク高さ;GFP = 緑色蛍光タンパク質;FITC = フルオレセイン イソチオシアネート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、FACSを用いた5dpfゼブラフィッシュ仔魚の腸内分離・解離法について紹介する。この方法では、10x Genomics Chromium プラットフォームを使用して、scRNA-seq によるさまざまな腸細胞の収集と解析に成功しました。tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュ系統を選択したのは、生存可能なENS細胞も単離されることを示すためでした(図2D)。ただし、phox2bbゲーティングは神経細胞の生存率を評価するためだけに使用し、特定の細胞集団に対しては選択しなかったため、この方法は他のゼブラフィッシュのラインにも容易に拡張できることに注意することが重要です。5 dpf に存在するすべての腸細胞を収集するために偏りのないアプローチを使用することにしたため、ソーティング基準は主に生きた個々の細胞の同定にかかっています。これは、信頼性が高く一貫したゲーティング戦略を確立するために幼虫全体を使用する理由でもあります。個々の腸を分離するのにかかる労力を考えると、この実験の所定の時間枠内で、ネガティブコントロールとして機能するためにより多くの腸を分離することは現実的ではなくなります。したがって、全幼虫の細胞タイプが腸内の細胞タイプと異なり、異なる解離法が用いられていることは認識していますが、細胞の生存率を評価することだけに関心があったため、腸細胞の選別に適用されるゲーティング戦略は、幼虫全体を使用して最初に検証できることは注目に値します。
scRNA-seqを実行するために、このプロトコルの重要なステップは、十分な数の生細胞(~20,000細胞)を単離することです。同時に、細胞の生存率に悪影響が及ばないように、腸の分離に費やす時間をできるだけ短くする必要があります。ゼブラフィッシュの幼生の腸に焦点を当てた以前の報告では、細胞の解離にアキュターゼまたはトリプシンが用いられていました19,20,21。しかし、どちらの解離酵素もscRNA-seqに十分な生細胞を単離することができたが、アキュターゼは腸神経細胞の捕捉を許さなかった19,20。しかし、トリプシンは主に上皮細胞を捕捉し、少数の腸管神経細胞しか産出しなかった21。パパインは、その優しさで一般的に認識されており、腸管ニューロンの完全性を維持するのに特に有益である可能性があります22。その結果、パパインは神経細胞の生存率の維持に有効であることが示され、この酵素がゼブラフィッシュの成体の網膜と脳の消化に使用された以前の用途が確認されました23,24。しかし、パパインであっても、腸の単離と解離後の細胞生存率はわずか6.4%であったことは注目に値します。このことは、その後のFACSステップが、生細胞の選択に不可欠であることを示唆しています。このような結果は、特に希少で捕捉が困難な目的の細胞を扱う場合に限界と見なすことができます。
今後の研究では、単離プロトコル中の細胞生存率を向上させるための新しい解離法に焦点を当てる必要があります。この方法を増やすと、レポーター陽性細胞を選別し、特定の腸細胞タイプに対してscRNA-seqを実行することが可能になります。それにもかかわらず、ここで紹介する方法は、上皮、間質、血液、筋肉、免疫細胞、さらには腸ニューロンやグリアなど、腸内のさまざまな細胞タイプを同定するのに十分な生細胞を捕捉することを可能にします。消化管の発生や機能障害についてより多くの知見を得るためには、これらの異なる細胞種を単離・解析する能力が不可欠であるため、ゼブラフィッシュをモデル生物として腸内組成を研究するための信頼性の高いアプローチを提供するため、この方法は特に価値があると考えています。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、ソフィア財団の友人(SSWO WAR-63)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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