Summary
여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
위장관(GI)은 생명에 필수적인 다양한 기능을 수행합니다. 발달에 영향을 미치는 선천적 결함은 장 신경근 장애로 이어질 수 있으며, 이는 위장 발달 및 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 이 연구에서는 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하여 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq) 분석에 사용할 수 있는 살아 있는 생존 가능한 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 장의 수동 해부 후 파파인과의 효소 해리를 기반으로 합니다. 그 후, 세포를 형광 활성화 세포 분류에 제출하고 scRNA-seq를 위해 생존 가능한 세포를 수집합니다. 이 방법을 통해 상피, 기질, 혈액, 근육 및 면역 세포와 장 신경 세포 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별할 수 있었습니다. 따라서 제브라피시를 사용하여 건강과 질병에서 위장관의 구성을 연구하는 데 귀중한 자료라고 생각합니다.
Introduction
위장관(GI)은 전반적인 건강과 웰빙에 중요한 역할을 하는 복잡한 시스템입니다. 그것은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 노폐물 1,2의 제거를 담당합니다. 위장관은 상피세포, 평활근세포, 면역세포, 장신경계(ENS) 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 서로 긴밀하게 소통하여 적절한 장 기능을 조절하고 유지합니다 3,4,5. 위장관 발달의 결함은 영양소 흡수, 미생물군 구성, 장-뇌 축 및 ENS와 같은 다양한 측면에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며, 히르슈스프룽 병(Hirschsprung disease) 및 만성 장 가성 폐쇄(Chronic intestinal pseudo-obstruction)와 같은 여러 장 신경근 장애를 유발할 수 있습니다 6,7. 이러한 장애는 Cajal의 간질 세포, 평활근 세포 및 ENS 6,8,9와 같은 다양한 주요 세포의 변화로 인한 심각한 장 운동성 장애를 특징으로 합니다. 그러나 위장 발달과 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.
제브라피쉬는 빠른 배아 발달, 배아 및 유충 단계의 투명성, 유전적 다루기 쉬움으로 인해 위장 발달 및 기능 장애를 연구하는 데 귀중한 모델 유기체입니다 10,11,12,13,14. 형광 단백질을 발현하는 수많은 형질전환 제브라피시 계통을 사용할 수 있습니다. 이러한 계통의 예로는 장 뉴런을 포함한 모든 phox2bb+ 세포가15,16으로 표지되어 있기 때문에 ENS를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시가 있습니다. 여기에서는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 사용하여 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 분석을 위한 수정 후 5일(dpf) 유충의 장 분리 방법을 제시합니다(그림 1).
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Protocol
모든 제브라피시 사육 및 실험은 에라스무스 MC 및 동물 복지 법률의 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 수정 후 5일 동안 제브라피시 유충을 사용하는 것은 네덜란드 규정에 명시된 대로 공식적인 윤리적 승인이 필요하지 않은 실험 범주에 속합니다.
1. 수정 후 5일(dpf) 야생형 및 tg(phox2bb:GFP) 유충 획득
- 야생형 제브라피시 사육을 설정하고 15cm 페트리 접시에 HEPES 완충 E3 배지(이하 E3)에 50개의 알을 수집합니다. 이 물고기를 형광 활성화 세포 분류(FAC)를 위한 음성 대조군으로 사용하십시오.
- tg(phox2bb:GFP) 제브라피쉬를 번식시키고 15cm 페트리 접시에 E3에서 약 300개의 알을 수집합니다.
- 수정란을 3°C의 인큐베이터에서 14시간/10시간 밝음/어두움 주기로 E28.5(접시당 최대 50개)에 보관합니다.
- 1 dpf에서 수정되지 않은 난자를 제거하고 수정란이 5 dpf로 발달하도록 합니다.
- 1dpf에서 tg(phox2bb:GFP) 유충을 선택합니다.
2. 야생형 전체 유충 해리
- 5 dpf 유충에 0.016 % 트리카인을 마취합니다.
- 10x 트립신-EDTA 용액 1mL가 들어 있는 페트리 접시에 면도날을 사용하여 제브라피시 30마리를 작은 조각으로 자릅니다.
- 잘게 썬 제브라피시를 총 부피 2mL의 10x 트립신-EDTA 용액이 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 얼음 위에 3시간 동안 그대로 둡니다. 해리를 자극하기 위해 매시간 P1000 피펫으로 피펫을 위아래로 움직입니다.
3. 장 격리
- 0.016% 트리카인으로 마취된 6-10 dpf 유충을 1.8% 아가로스 플레이트(E3 25mL에 아가로스 0.45g)에 연속으로 놓습니다.
- 제브라피쉬의 머리에 곤충 핀 하나를 꽂습니다.
- 티슈를 사용하여 남아 있는 E3를 모두 제거합니다.
- 다른 장기를 건드리지 않고 다른 곤충 핀을 사용하여 장을 분리하십시오. 노른자가 제거되었는지 확인하십시오(보충 그림 S1A).
- 격리 후 장을 검사하고 필요한 경우 장과 관련이 없는 모든 물질(예: 피부, 지방, 간)을 제거합니다.
- 핀셋으로 장을 채취하여 얼음 위에 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 포함된 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
알림: 최소 244개의 장을 격리해야 하며 총 해부 시간을 3시간으로 유지해야 합니다. 이것은 두 사람이 동시에 작업할 때 가능합니다.
4. 장 해리
- 모든 내장을 해부한 직후 미세 원심분리기 튜브를 최대 속도(13,800× g)로 30초 동안 원심분리합니다.
- PBS/10% FCS를 제거하되 장이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량(~100μL)을 남겨 둡니다. CaCl2 및 MgCl2 를 함유한 HBSS에 500μL의 2.17mg/mL 파파인을 첨가하여 세포를 해리시킵니다.
- 2.5μL의 시스테인(1M)으로 파파인을 활성화합니다.
- 내장을 37°C의 수조에서 10분 동안 배양합니다. 피펫을 중간(5분 후)에 위아래로 움직여 효소 조직 소화를 자극합니다.
- 0.5mL의 PBS/10% FCS로 미리 습윤된 35μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 FACS 튜브로 옮깁니다.
- 0.5mL 단위로 총 2mL의 PBS/10% FCS를 추가하여 스트레이너를 세척합니다.
- 700× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 펠릿을 300μL의 PBS/10% FCS에 재현탁시킵니다.
- 죽은 세포(1:1,000)를 라벨링하기 위해 1μg/mL의 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 추가하고 FACS 중에 제외할 수 있도록 5분 동안 배양합니다.
5. FACS 강화
- wildtype 샘플을 사용하여 유세포 분석기에 3,000개의 세포 를 기록하여 분류된 세포 집단의 게이트를 설정합니다(보충 그림 S1B-E).
- 100μm 노즐을 사용하고 순도에 대한 분류 정밀도를 설정하고 200μL의 PBS/5% FCS가 포함된 수집 튜브를 FACS 기계에 넣습니다.
- 내장의 세포 현탁액을 로드하고 이중세포(그림 2B)와 죽은 세포(그림 2C)를 제외하여 살아있는 세포(DAPI 음성), 단일 세포를 수집 튜브(그림 2C)로 분류합니다.
참고: tg(phox2bb) 제브라피쉬의 경우 모든 단일 살아있는 세포가 정렬되므로 GFP+ 세포의 비율은 참조용으로만 확인됩니다. - 세포 분류 후 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- trypan blue를 사용한 생존력 검사를 포함하여 혈구계로 세포 현탁액을 계산합니다. 생존 가능성이 80% 이상이면 다음 단계를 계속합니다.
- 이제 세포는 scRNAseq(즉, 10x Genomics Chromium 플랫폼)를 위해 처리할 준비가 되었습니다. 샘플당 약 20,000개의 세포를 사용합니다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 5개의 dpf 유충에서 전체 장을 성공적으로 분리하고 해리했습니다. 파파인을 해리 효소로 사용하여 세포 생존율을 크게 향상시켜 244개의 분리된 장에서 단일 생존 가능한 세포(전체 세포의 6.4%)와 관련된 46,139개의 이벤트를 포착할 수 있었습니다(그림 2A). 야생형 전체 유충을 대조군으로 사용하여 분류 공정을 최적화하여 효과적인 세포 식별 및 분류를 가능하게 했습니다. 살아있는 단일 세포만 분류할 때 전체 유충을 사용할 수 있습니다(보충 그림 S1B-E). 분류된 모든 장 세포는 이후에 scRNA seq 플랫폼에 제출되었습니다. 총 9,858개의 세포가 시퀀싱되었으며 셀당 평균 판독 횟수는 21,106회였습니다. scRNA-seq 분석에는 Seurat V317을 사용했습니다. 상피세포, 기질세포, 혈액세포, 근육세포, 면역세포, 장뉴런세포, 신경교세포(18) 등 12가지 세포 유형을 대표하는 총 48개의 군집이 확인되었습니다.
그림 1: 분리된 제브라피시 내장의 단세포 RNA 염기서열분석을 위한 실험 설계. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; scRNA-seq = 단일 세포 RNA 염기서열분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제브라피시 내장에서 살아있는 단일 세포를 분류하기 위한 게이팅 전략. (A) FCS/SSC 크기 게이팅을 사용한 사후 분류 분석. (B) 이중항 차별. (C) 살아있는/죽은 세포 게이팅 및 분류된 개체군. (D) Phox2bb:GFP+ 세포는 분류된 살아있는 모집단에 존재합니다. 각 패널에는 제어된 셀의 백분율이 표시됩니다. 약어: FCS-A = 순방향 산란 피크 영역; SSC-A = 측면 산란 피크 영역; FSC-H = 순방향 산란 피크 높이; GFP = 녹색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 전체 야생형 제브라피시 유충에서 살아있는 단일 세포를 분류하기 위한 장 분리 및 게이팅 전략. (A) 수정 후 5일 동안의 장내 분리 제브라피시 유충의 명시야 이미지. 빨간색 선은 색인선을 나타냅니다. (B) FCS/SSC 크기 게이팅이 있는 모든 셀 을 보여주는 정렬 후 분석. (C) 단일항 선택. (D) DAPI 게이팅. (E) Phox2bb:GFP+ 게이팅. 제어된 셀의 백분율이 각 패널에 표시됩니다. 약어: FCS-A = 순방향 산란 피크 영역; SSC-A = 측면 산란 피크 영역; FSC-H = 순방향 산란 피크 높이; GFP = 녹색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 FACS를 사용하여 5dpf 제브라피시 유충의 내장을 분리하고 해리하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 10x Genomics Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq로 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 수집 및 분석했습니다. 우리는 생존 가능한 ENS 세포도 분리할 수 있다는 징후를 원했기 때문에 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 선택했습니다(그림 2D). 그러나 이 방법은 신경 세포 생존력을 평가하기 위해서만 phox2bb 게이팅을 사용하고 특정 세포 집단을 선택하지 않았기 때문에 다른 제브라피시 관심 계통으로 쉽게 확장될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 5dpf에 존재하는 모든 장 세포를 수집하기 위해 편향되지 않은 접근 방식을 사용하기로 결정했기 때문에 분류 기준은 주로 살아있는 개별 세포를 식별하는 데 달려 있습니다. 이것은 또한 신뢰할 수 있고 일관된 게이팅 전략을 수립하기 위해 전체 유충을 사용하는 이유이기도 합니다. 개별 내장을 분리하는 데 수반되는 노동력을 고려할 때, 이 실험의 주어진 시간 내에 음성 대조군 역할을 하기 위해 더 많은 장을 분리하는 것은 비현실적입니다. 따라서 전체 유충의 세포 유형이 장에서 발견되는 세포 유형과 다르고 별개의 해리 방법이 사용되었다는 것을 인정하지만, 세포 생존력 평가에만 관심이 있었기 때문에 장 세포를 분류하는 데 적용된 게이팅 전략이 전체 유충을 사용하여 초기에 검증될 수 있다는 점은 주목할 만합니다.
scRNA-seq를 수행하기 위해 이 프로토콜의 중요한 단계는 충분한 수의 생존 가능한 세포(~20,000개 세포)를 분리하는 것입니다. 동시에 장 분리에 소요되는 시간은 세포 생존력에 해로운 영향을 미치지 않도록 가능한 한 짧게 유지해야 합니다. 제브라피시 유충 장에 초점을 맞춘 이전 보고서에서는 세포 해리를 위해 아큐타아제 또는 트립신을 사용했습니다 19,20,21. 그러나, 두 해리 효소 다 scRNA seq를 위한 충분한 생존 가능한 세포를 고립시킬 수 있는 동안, accutase는 장 신경 세포19,20의 붙잡기를 허용하지 않았다. 그러나 트립신은 주로 상피 세포를 포획하여 장 신경 세포의 수가 적었습니다21. 파파인은 일반적으로 부드러움으로 잘 알려져 있으며, 이는 장 신경 세포의 무결성을 보존하는 데 특히 도움이 될 수 있습니다22. 우리의 결과는 파파인이 신경 세포의 생존력을 유지하는 데 실제로 효과적이라는 것을 보여주었으며, 이 효소가 제브라피시 성인 망막과 뇌를 소화하는 데 사용되었던 이전 응용 프로그램을 확인했습니다23,24. 그러나 파파인을 사용하더라도 장 분리 및 해리 후 세포 생존율은 6.4%에 불과했다는 점은 주목할 만합니다. 이는 후속 FACS 단계가 생존 가능한 세포를 선택하는 것이 중요하다는 것을 시사합니다. 이러한 결과는 특히 희소하고 포착하기 어려운 관심 세포를 다룰 때 한계로 간주될 수 있습니다.
향후 연구는 분리 프로토콜 동안 세포 생존력을 개선하기 위한 새로운 해리 방법에 초점을 맞춰야 합니다. 이 방법이 증가하면 reporter-positive 세포를 분류하고 특정 장 세포 유형에 대해 scRNA-seq를 수행할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 방법은 상피, 기질, 혈액, 근육, 면역 세포, 심지어 장 뉴런 및 신경교와 같은 장 내 다양한 세포 유형의 후속 식별을 위해 충분한 생존 가능한 세포를 포착할 수 있습니다. 이러한 다양한 세포 유형을 분리하고 분석하는 능력은 위장 발달 및 기능 장애에 대한 더 많은 통찰력을 얻는 데 필수적이기 때문에 제브라피시를 모델 유기체로 사용하여 장 구성을 연구하는 데 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공하기 때문에 이 방법이 특히 가치가 있다고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 소피아 재단(SSWO WAR-63)의 친구들이 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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