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Developmental Biology

Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65876
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1
1Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology, the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology, Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology, Maastricht University Medical Center

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.

Abstract

Le tractus gastro-intestinal (GI) remplit une série de fonctions essentielles à la vie. Les malformations congénitales affectant son développement peuvent entraîner des troubles neuromusculaires entériques, d’où l’importance de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation afin d’obtenir des cellules vivantes et viables qui peuvent être utilisées pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Ce protocole est basé sur la dissection manuelle de l’intestin du poisson-zèbre, suivie d’une dissociation enzymatique avec de la papaïne. Par la suite, les cellules sont soumises à un tri cellulaire activé par fluorescence et les cellules viables sont collectées pour le scRNA-seq. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à identifier différents types de cellules intestinales, notamment les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires et immunitaires, ainsi que les neurones entériques et les cellules gliales. Par conséquent, nous considérons qu’il s’agit d’une ressource précieuse pour étudier la composition du tractus gastro-intestinal dans la santé et la maladie, en utilisant le poisson-zèbre.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (GI) est un système complexe qui joue un rôle essentiel dans la santé et le bien-être en général. Il est responsable de la digestion et de l’absorption des nutriments, ainsi que de l’élimination des déchets 1,2. Le tractus gastro-intestinal est composé de plusieurs types de cellules, y compris les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le système nerveux entérique (SNE), qui communiquent étroitement entre elles pour réguler et maintenir une fonction intestinale appropriée 3,4,5. Les défauts dans le développement du tractus gastro-intestinal peuvent avoir des effets considérables sur divers aspects tels que l’absorption des nutriments, la composition du microbiote, l’axe intestin-cerveau et le SNE, conduisant à plusieurs troubles neuromusculaires entériques, tels que la maladie de Hirschsprung et la pseudo-obstruction intestinale chronique 6,7. Ces troubles sont caractérisés par une dysmotilité intestinale sévère causée par des altérations de diverses cellules clés, telles que les cellules interstitielles de Cajal, les cellules musculaires lisses et l’ENS 6,8,9. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal sont encore mal compris.

Le poisson-zèbre est un organisme modèle précieux pour l’étude du développement et du dysfonctionnement gastro-intestinal en raison de son développement embryonnaire rapide, de sa transparence pendant les stades embryonnaire et larvaire et de sa tractabilité génétique 10,11,12,13,14. De nombreuses lignées transgéniques de poissons-zèbres exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles. Un exemple d’une telle lignée est le poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), couramment utilisé pour étudier le SNE, car toutes les cellules phox2bb+, y compris les neurones entériques, sont étiquetées15,16. Ici, en utilisant la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), nous présentons une méthode d’isolement intestinal de larves 5 jours après la fécondation (dpf) pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) (Figure 1).

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Protocol

Tous les élevages et expériences de poissons-zèbres ont été menés conformément aux directives institutionnelles du programme Erasmus MC et à la législation sur le bien-être animal. L’utilisation de larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation entre dans la catégorie des expériences qui ne nécessitent pas d’approbation éthique formelle, comme le prévoit la réglementation néerlandaise.

1. Obtention de 5 jours après la fécondation (dpf) larves de type sauvage et tg(phox2bb :GFP)

  1. Mettre en place l’élevage de poissons-zèbres de type sauvage et recueillir 50 œufs dans un milieu E3 tamponné HEPES (ci-après dénommé E3) dans une boîte de Pétri de 15 cm. Utilisez ces poissons comme témoin négatif pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FAC).
  2. Mettre en place l’élevage de poissons-zèbres tg(phox2bb :GFP) et collecter environ 300 œufs en E3 dans une boîte de Pétri de 15 cm.
  3. Conservez les œufs fécondés en E3 (maximum 50 œufs/boîte) selon un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h, dans un incubateur à 28,5 °C.
  4. À 1 dpf, retirez les œufs non fécondés et laissez les œufs fécondés se développer jusqu’à 5 dpf.
  5. Sélectionner les larves tg(phox2bb :GFP) à 1 dpf.

2. Dissociation des larves entières de type sauvage

  1. Anesthésier 5 larves dpf avec 0,016 % de tricaïne.
  2. Couper 30 poissons-zèbres en petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir dans une boîte de Pétri contenant 1 mL de solution 10x trypsine-EDTA.
  3. Transférez le poisson-zèbre haché dans un tube de microcentrifugation d’un volume total de 2 mL de solution de trypsine-EDTA 10x et laissez-le sur glace pendant 3 h. Pipeter de haut en bas avec une pipette P1000 toutes les heures pour stimuler la dissociation.

3. Isolement intestinal

  1. Placer 6 à 10 larves de 5 dpf anesthésiées avec 0,016 % de tricaïne dans une rangée, sur une plaque d’agarose à 1,8 % (0,45 g d’agarose dans 25 mL d’E3), sous un microscope à dissection
  2. Mettez une épingle à insectes dans la tête du poisson-zèbre.
  3. Retirez tous les E3 restants à l’aide d’un mouchoir en papier.
  4. Isolez l’intestin à l’aide d’une autre épingle à insectes, sans déranger les autres organes. Assurez-vous que le jaune d’œuf est enlevé (figure supplémentaire S1A).
  5. Une fois l’appareil isolé, inspectez l’intestin et retirez tout le matériel non intestinal (p. ex., peau, graisse, foie) si nécessaire.
  6. Prélevez l’intestin à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans un tube de microcentrifugation, contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS), sur de la glace.
    REMARQUE : Un minimum de 244 intestins doivent être isolés, en maintenant le temps total de dissection à 3 h. C’est faisable avec deux personnes travaillant en parallèle.

4. Dissociation intestinale

  1. Immédiatement après la dissection de tous les intestins, centrifuger le tube de microcentrifugation à pleine vitesse (13 800 × g) pendant 30 s.
  2. Retirez le PBS/10% FCS mais laissez une petite quantité (~100 μL) pour éviter que les intestins ne se dessèchent. Ajouter 500 μL de papaïne à 2,17 mg/mL dans HBSS contenant du CaCl2 et du MgCl2, pour dissocier les cellules.
  3. Activer la papaïne avec 2,5 μL de cystéine (1 M).
  4. Incuber les intestins au bain-marie à 37 °C pendant 10 min. Pipeter de haut en bas à mi-course (après 5 min) pour stimuler la digestion des tissus enzymatiques.
  5. Transférez les cellules dans un tube FACS à l’aide d’une crépine de 35 μm, préhumidifiée avec 0,5 mL de PBS/10 % FCS.
  6. Lavez la passoire en ajoutant un total de 2 mL de PBS/10 % de FCS par pas de 0,5 mL.
  7. Centrifuger à 700 × g pendant 5 min à 4 °C.
  8. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de PBS/10 % FCS.
  9. Ajouter 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour marquer les cellules mortes (1 :1 000) et incuber pendant 5 min pour permettre leur exclusion pendant le FACS.

5. Enrichissement du FACS

  1. Utilisez l’échantillon de type sauvage pour définir les portes de la population de cellules triées en enregistrant 3 000 cellules sur le cytomètre en flux (figure supplémentaire S1B-E).
  2. Utilisez une buse de 100 μm, réglez la précision de tri sur la pureté et placez le tube de collecte contenant 200 μL de PBS/5 % FCS dans la machine FACS.
  3. Chargez la suspension cellulaire des intestins et triez les cellules individuelles vivantes (DAPI-négatives) dans le tube de collecte (Figure 2C), en excluant les doublets (Figure 2B) et les cellules mortes (Figure 2C).
    REMARQUE : Pour le poisson-zèbre tg(phox2bb), la proportion de cellules GFP+ n’est vérifiée qu’à titre de référence, car toutes les cellules vivantes individuelles sont triées.
  4. Conservez le tube de prélèvement sur de la glace après le tri des cellules.
  5. Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre, y compris un contrôle de viabilité avec du bleu de trypan. Si la viabilité est d’au moins 80 %, passez à l’étape suivante.
  6. Les cellules sont maintenant prêtes à être traitées pour le scRNAseq (c’est-à-dire la plateforme 10x Genomics Chromium). Utilisez environ 20 000 cellules par échantillon.

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Representative Results

Grâce à ce protocole, nous avons réussi à isoler et à dissocier des intestins entiers de 5 larves dpf. En utilisant la papaïne comme enzyme de dissociation, nous avons considérablement amélioré la viabilité cellulaire, permettant la capture de 46 139 événements impliquant des cellules uniques et viables (6,4 % de toutes les cellules) sur 244 intestins isolés (Figure 2A). Des larves entières de type sauvage ont été utilisées comme témoin pour s’assurer que le processus de tri était optimisé, ce qui a permis une identification et un tri efficaces des cellules. Les larves entières pourraient être utilisées, car nous ne trions que les cellules vivantes et individuelles (figure supplémentaire S1B-E). Toutes les cellules intestinales triées ont ensuite été soumises à la plateforme de séquençage de l’ARNc. Au total, 9 858 cellules ont été séquencées avec une moyenne de 21 106 lectures par cellule. Pour l’analyse scRNA-seq, nous avons utilisé Seurat V317. Au total, 48 clusters ont été identifiés représentant 12 types de cellules différentes, y compris des cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires et immunitaires, ainsi que des neurones entériques et des cellules gliales18.

Figure 1
Figure 1 : Plan expérimental pour le séquençage de l’ARN unicellulaire d’intestins isolés de poissons-zèbres. Abréviations : FACS = tri cellulaire activé par fluorescence ; scRNA-seq = séquençage de l’ARN unicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Stratégie de contrôle pour trier les cellules vivantes et individuelles de l’intestin du poisson-zèbre. (A) Analyse post-tri avec contrôle de taille FCS/SSC. (B) Discrimination par doublet. (C) Cellules vivantes/mortes et population triée. (D) Cellules Phox2bb :GFP+ présentes dans la population vivante triée. Dans chaque panneau, le pourcentage de cellules fermées est affiché. Abréviations : FCS-A = zone de pic de diffusion vers l’avant ; SSC-A = zone de pic de diffusion latérale ; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant ; GFP = protéine fluorescente verte ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Isolement intestinal et stratégie de contrôle pour trier les cellules vivantes et individuelles des larves entières de poisson-zèbre sauvage. (A) Image en fond clair de l’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation. La ligne rouge indique la ligne de dissection. (B) Analyse post-tri, montrant toutes les cellules avec un contrôle de taille FCS/SSC. (C) Sélection du singulet. (D) Portail DAPI. (E) Phox2bb :GFP+ déclenchement. Le pourcentage de cellules fermées est indiqué dans chaque panneau. Abréviations : FCS-A = zone de pic de diffusion vers l’avant ; SSC-A = zone de pic de diffusion latérale ; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant ; GFP = protéine fluorescente verte ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Nous présentons ici une méthode d’isolement et de dissociation de l’intestin de 5 larves de poisson-zèbre dpf à l’aide de FACS. Grâce à cette méthode, différents types de cellules intestinales ont été collectés et analysés avec succès par scRNA-seq, à l’aide de la plateforme 10x Genomics Chromium. Nous avons sélectionné la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), car nous voulions une indication que les cellules ENS viables seraient également isolées (Figure 2D). Cependant, il est important de noter que cette méthode peut être facilement étendue à d’autres lignées de poisson-zèbre d’intérêt, car nous n’avons utilisé le déclenchement phox2bb que pour évaluer la viabilité neuronale, et non pour sélectionner une population cellulaire spécifique. Comme nous avons décidé d’utiliser une approche non biaisée pour collecter toutes les cellules intestinales présentes à 5 dpf, le critère de tri repose principalement sur l’identification des cellules vivantes et individuelles. C’est aussi la raison pour laquelle on utilise des larves entières pour établir une stratégie de contrôle fiable et cohérente. Compte tenu du travail impliqué dans l’isolement des intestins individuels, il devient peu pratique d’isoler plus d’intestins pour servir de contrôle négatif, dans le délai imparti de cette expérience. Par conséquent, bien que nous reconnaissions que les types de cellules des larves entières diffèrent de ceux trouvés dans l’intestin, et que même des méthodes de dissociation distinctes ont été utilisées, il est à noter que la stratégie de déclenchement appliquée pour trier les cellules intestinales peut être initialement validée en utilisant des larves entières, car nous ne nous intéressions qu’à l’évaluation de la viabilité cellulaire.

Pour effectuer le scRNA-seq, une étape critique de ce protocole serait d’isoler un nombre suffisant de cellules viables (~20 000 cellules). Dans le même temps, le temps consacré à l’isolement intestinal doit être aussi court que possible pour éviter un effet néfaste sur la viabilité cellulaire. Des rapports antérieurs portant sur les intestins des larves de poisson-zèbre utilisaient l’accutase ou la trypsine pour la dissociation cellulaire 19,20,21. Cependant, alors que les deux enzymes de dissociation ont été capables d’isoler suffisamment de cellules viables pour le scRNA-seq, l’accutase n’a pas permis la capture des cellules neuronales entériques19,20. La trypsine, cependant, a principalement capturé les cellules épithéliales, ne produisant qu’un faible nombre de cellules neuronales entériques21. La papaïne est communément reconnue pour sa douceur, ce qui peut être particulièrement bénéfique pour préserver l’intégrité neuronale entérique22. Nos résultats ont montré que la papaïne est effectivement efficace pour maintenir la viabilité des cellules neuronales, confirmant les applications précédentes dans lesquelles cette enzyme était utilisée pour digérer la rétine et le cerveau adultes du poisson-zèbre23,24. Cependant, il convient de mentionner que même avec la papaïne, la viabilité cellulaire après l’isolement et la dissociation de l’intestin n’était que de 6,4%. Cela suggère que l’étape FACS suivante est donc cruciale pour sélectionner les cellules viables. De tels résultats peuvent être considérés comme une limitation, en particulier lorsqu’il s’agit de cellules d’intérêt rares et difficiles à capturer.

Les études futures devraient se concentrer sur de nouvelles méthodes de dissociation pour améliorer la viabilité cellulaire pendant le protocole d’isolement. Une fois augmentée, cette méthode devient réalisable pour trier les cellules rapporteur-positives et effectuer un scRNA-seq sur des types de cellules intestinales spécifiques. Néanmoins, la méthode présentée ici permet de capturer suffisamment de cellules viables pour l’identification ultérieure de différents types de cellules dans l’intestin, telles que les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires, immunitaires, et même les neurones entériques et gliales, qui n’ont pas été capturés auparavant à ce stade cellulaire en utilisant des approches similaires. Étant donné que la capacité d’isoler et d’analyser ces différents types de cellules est essentielle pour mieux comprendre le développement et le dysfonctionnement gastro-intestinal, nous considérons que cette méthode est particulièrement précieuse, car elle fournit une approche fiable pour étudier la composition intestinale en utilisant le poisson-zèbre, comme organisme modèle.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par les amis de la Fondation Sophia (SSWO WAR-63).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

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References

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Biologie du développement numéro 201
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