Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.
Abstract
Der Magen-Darm-Trakt erfüllt eine Reihe von Funktionen, die für das Leben unerlässlich sind. Angeborene Defekte, die seine Entwicklung beeinträchtigen, können zu enterischen neuromuskulären Erkrankungen führen, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung vor, um lebende, lebensfähige Zellen zu erhalten, die für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) verwendet werden können. Dieses Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion des Zebrafischdarms, gefolgt von der enzymatischen Dissoziation mit Papain. Anschließend werden die Zellen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unterzogen und lebensfähige Zellen für die scRNA-Sequenzierung gesammelt. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich verschiedene Darmzelltypen identifizieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel- und Immunzellen sowie enterische Neuronen und Gliazellen. Daher betrachten wir es als eine wertvolle Ressource, um die Zusammensetzung des Magen-Darm-Trakts bei Gesundheit und Krankheit anhand des Zebrafisches zu untersuchen.
Introduction
Der Magen-Darm-Trakt ist ein komplexes System, das eine wichtige Rolle für die allgemeine Gesundheit und das Wohlbefinden spielt. Es ist für die Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen sowie für die Ausscheidung von Abfallproduktenverantwortlich 1,2. Der Magen-Darm-Trakt besteht aus mehreren Zelltypen, darunter Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Immunzellen und das enterische Nervensystem (ENS), die eng miteinander kommunizieren, um die ordnungsgemäße Darmfunktion zu regulieren und aufrechtzuerhalten 3,4,5. Defekte in der Entwicklung des Magen-Darm-Trakts können weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte wie die Nährstoffaufnahme, die Zusammensetzung der Mikrobiota, die Darm-Hirn-Achse und das ENS haben und zu verschiedenen enterischen neuromuskulären Erkrankungen wie Morbus Hirschsprung und chronischer intestinaler Pseudoobstruktion führen 6,7. Diese Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine schwere Darmdysmotilität, die durch Veränderungen in verschiedenen Schlüsselzellen verursacht wird, wie z. B. den interstitiellen Zellen des Cajal, den glatten Muskelzellen und dem ENS 6,8,9. Die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen, sind jedoch noch wenig verstanden.
Der Zebrafisch ist aufgrund seiner schnellen Embryonalentwicklung, seiner Transparenz während des Embryonal- und Larvenstadiums und seiner genetischen Lenkbarkeit ein wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung der Magen-Darm-Entwicklung und -Dysfunktion 10,11,12,13,14. Es stehen zahlreiche transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Ein Beispiel für eine solche Linie ist der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafisch, der häufig zur Untersuchung des ENS verwendet wird, da alle phox2bb+-Zellen, einschließlich enterischer Neuronen, mit15,16 markiert sind. In dieser Arbeit stellen wir unter Verwendung der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie eine Methode zur Darmisolierung von Larven nach der Befruchtung (dpf) für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)-Analyse vor (Abbildung 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Zebrafischhaltungen und -versuche wurden nach den institutionellen Richtlinien des Erasmus MC und der Tierschutzgesetzgebung durchgeführt. Die Verwendung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung fällt unter die Kategorie der Experimente, die keine formelle ethische Genehmigung erfordern, wie es in den niederländischen Vorschriften festgelegt ist.
1. Gewinnung von 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Wildtyp- und tg(phox2bb:GFP)-Larven
- Richten Sie eine Wildtyp-Zebrafischzucht ein und sammeln Sie 50 Eier in HEPES-gepuffertem E3-Medium (im Folgenden als E3 bezeichnet) in einer 15 cm großen Petrischale. Verwenden Sie diese Fische als Negativkontrolle für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACs).
- Richten Sie die Zucht von tg(phox2bb:GFP) Zebrafischen ein und sammeln Sie ca. 300 Eier in E3 in einer 15 cm Petrischale.
- Befruchtete Eier in E3 (maximal 50 Eier/Schale) in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h in einem Inkubator bei 28,5 °C aufbewahren.
- Bei 1 dpf entfernen Sie unbefruchtete Eier und lassen Sie die befruchteten Eier auf 5 dpf entwickeln.
- Selektieren Sie tg(phox2bb:GFP)-Larven bei 1 dpf.
2. Dissoziation ganzer Wildtyp-Larven
- 5 dpf Larven mit 0,016% Tricain anästhesieren.
- Zerkleinern Sie 30 Zebrafische mit einer Rasierklinge in einer Petrischale, die 1 ml 10x Trypsin-EDTA-Lösung enthält, in kleine Stücke.
- Den gehackten Zebrafisch in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von 2 ml 10x Trypsin-EDTA-Lösung überführen und 3 h auf Eis liegen lassen. Pipettieren Sie stündlich mit einer P1000-Pipette auf und ab, um die Dissoziation zu stimulieren.
3. Darm-Isolierung
- 6-10 mit 0,016 % Tricain betäubte Larven mit 5 dpf hintereinander auf eine 1,8%ige Agaroseplatte (0,45 g Agarose in 25 ml E3) unter ein Präpariermikroskop legen
- Stecken Sie eine Insektennadel in den Kopf des Zebrafisches.
- Entfernen Sie alle verbleibenden E3 mit einem Taschentuch.
- Isolieren Sie den Darm mit einem weiteren Insektenstift, ohne andere Organe zu stören. Achten Sie darauf, dass das Eigelb entfernt wird (Ergänzende Abbildung S1A).
- Nach der Isolierung untersuchen Sie den Darm und entfernen Sie bei Bedarf sämtliches Nicht-Darmmaterial (z. B. Haut, Fett, Leber).
- Sammeln Sie den Darm mit einer Pinzette und legen Sie ihn auf Eis in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) enthält.
HINWEIS: Es sollten mindestens 244 Därme isoliert werden, wobei die Gesamtdissektionszeit bei 3 Stunden gehalten werden sollte. Dies ist möglich, wenn zwei Personen parallel arbeiten.
4. Darmdissoziation
- Unmittelbar nach der Dissektion aller Därme zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei voller Geschwindigkeit (13.800 × g) für 30 s.
- Entfernen Sie das PBS/10% FCS, aber lassen Sie eine kleine Menge (~100 μl) stehen, um ein Austrocknen des Darms zu verhindern. 500 μl 2,17 mg/ml Papain in HBSS mit CaCl2 und MgCl2 zugeben, um die Zellen zu dissoziieren.
- Papain mit 2,5 μl Cystein (1 M) aktivieren.
- Den Darm in einem Wasserbad bei 37 °C für 10 min inkubieren. Pipettieren Sie auf halbem Weg (nach 5 Minuten) auf und ab, um die Verdauung des enzymatischen Gewebes zu stimulieren.
- Übertragen Sie die Zellen in ein FACS-Röhrchen mit einem 35-μm-Zellsieb, das mit 0,5 ml PBS/10 % FCS benetzt ist.
- Waschen Sie das Sieb, indem Sie in 0,5-ml-Schritten insgesamt 2 ml PBS/10 % FCS hinzufügen.
- Bei 700 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl PBS/10% FCS.
- 1 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Markierung toter Zellen (1:1.000) hinzufügen und 5 Minuten lang inkubieren, um ihren Ausschluss während der FACS zu ermöglichen.
5. FACS-Anreicherung
- Verwenden Sie die Wildtyp-Probe, um die Tore der sortierten Zellpopulation zu setzen, indem Sie 3.000 Zellen auf dem Durchflusszytometer aufzeichnen (ergänzende Abbildung S1B-E).
- Verwenden Sie eine 100-μm-Düse, stellen Sie die Sortiergenauigkeit auf die Reinheit ein und geben Sie das Sammelröhrchen mit 200 μl PBS/5 % FCS in die FACS-Maschine.
- Laden Sie die Zellsuspension der Eingeweide und sortieren Sie lebende (DAPI-negative) Einzelzellen in das Sammelröhrchen (Abbildung 2C), indem Sie Dubletten (Abbildung 2B) und tote Zellen (Abbildung 2C) ausschließen.
HINWEIS: Für den tg(phox2bb)-Zebrafisch wird der Anteil der GFP+ -Zellen nur als Referenz überprüft, da alle einzelnen lebenden Zellen sortiert werden. - Halten Sie das Sammelröhrchen nach der Zellsortierung auf Eis.
- Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Hämozytometer, einschließlich einer Viabilitätsprüfung mit Trypanblau. Wenn die Lebensfähigkeit mindestens 80 % beträgt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Die Zellen sind nun bereit für die Verarbeitung für scRNAseq (d. h. 10x Genomics Chromium-Plattform). Verwenden Sie ca. 20.000 Zellen pro Probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit diesem Protokoll gelang es uns, den gesamten Darm von 5-dpf-Larven zu isolieren und zu dissoziieren. Durch die Verwendung von Papain als Dissoziationsenzym haben wir die Zelllebensfähigkeit signifikant verbessert und die Erfassung von 46.139 Ereignissen mit einzelnen, lebensfähigen Zellen (6,4 % aller Zellen) aus 244 isolierten Eingeweiden ermöglicht (Abbildung 2A). Als Kontrolle wurden ganze Wildtyp-Larven verwendet, um sicherzustellen, dass der Sortierprozess optimiert wurde, was eine effektive Zellidentifikation und -sortierung ermöglichte. Ganze Larven könnten verwendet werden, da wir nur nach lebenden, einzelnen Zellen sortieren (Ergänzende Abbildung S1B-E). Alle sortierten Darmzellen wurden anschließend der scRNA-seq-Plattform zugeführt. Insgesamt wurden 9.858 Zellen sequenziert, wobei die durchschnittlichen Messwerte pro Zelle bei 21.106 lagen. Für die scRNA-seq-Analyse haben wir Seurat V317 verwendet. Insgesamt wurden 48 Cluster identifiziert, die 12 verschiedene Zelltypen repräsentieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel- und Immunzellen sowie enterische Neuronen und Gliazellen18.
Abbildung 1: Experimentelles Design für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von isolierten Zebrafischdärmen. Abkürzungen: FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; scRNA-seq = Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gating-Strategie zur Sortierung lebender, einzelner Zellen aus dem Darm des Zebrafisches. (A) Post-Sort-Analyse mit FCS/SSC-Größen-Gating. (B) Dublettendiskriminierung. (C) Gating lebender/toter Zellen und sortierte Population. (D) Phox2bb: GFP+-Zellen, die in der sortierten lebenden Population vorhanden sind. In jedem Bereich wird der Prozentsatz der abgegrenzten Zellen angezeigt. Abkürzungen: FCS-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; SSC-A = seitliche Streupeakfläche; FSC-H = Streuspitzenhöhe nach vorne; GFP = grün fluoreszierendes Protein; FITC = Fluoresceinisothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Darmisolierung und Gating-Strategie zur Sortierung lebender, einzelner Zellen aus ganzen Wildtyp-Zebrafischlarven. (A) Hellfeldbild der Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung. Die rote Linie zeigt die Sezierlinie an. (B) Post-Sort-Analyse, bei der alle Zellen mit FCS/SSC-Größen-Gating angezeigt werden. (C) Singulett-Auswahl. (D) DAPI-Gating. (E) Phox2bb:GFP+-Anschnitt. Der Prozentsatz der abgegrenzten Zellen wird in jedem Bereich angezeigt. Abkürzungen: FCS-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; SSC-A = seitliche Streupeakfläche; FSC-H = Streuspitzenhöhe nach vorne; GFP = grün fluoreszierendes Protein; FITC = Fluoresceinisothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung und Dissoziation des Darms von 5 dpf Zebrafischlarven mittels FACS vor. Mit dieser Methode wurden verschiedene Darmzelltypen erfolgreich gesammelt und mittels scRNA-seq unter Verwendung der 10x Genomics Chromium-Plattform analysiert. Wir haben uns für die tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie entschieden, da wir einen Hinweis darauf haben wollten, dass auch lebensfähige ENS-Zellen isoliert werden (Abbildung 2D). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Methode leicht auf andere Zebrafischlinien von Interesse ausgeweitet werden kann, da wir das phox2bb-Gating nur zur Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit und nicht zur Selektion für eine bestimmte Zellpopulation verwendet haben. Da wir uns für einen unvoreingenommenen Ansatz entschieden haben, um alle bei 5 dpf vorhandenen Darmzellen zu sammeln, hängt das Sortierkriterium in erster Linie von der Identifizierung lebender, einzelner Zellen ab. Dies ist auch der Grund für die Verwendung ganzer Larven, um eine zuverlässige und konsistente Angussstrategie zu etablieren. In Anbetracht der Arbeit, die mit der Isolierung einzelner Eingeweide verbunden ist, wird es unpraktisch, innerhalb des vorgegebenen Zeitrahmens dieses Experiments mehr Därme zu isolieren, um als Negativkontrolle zu dienen. Während wir also anerkennen, dass sich die Zelltypen der gesamten Larve von denen im Darm unterscheiden und sogar unterschiedliche Dissoziationsmethoden verwendet wurden, ist es bemerkenswert, dass die Gating-Strategie, die zur Sortierung von Darmzellen angewendet wird, zunächst an ganzen Larven validiert werden kann, da wir nur daran interessiert waren, die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen.
Um scRNA-seq durchzuführen, wäre ein kritischer Schritt in diesem Protokoll, eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Zellen (~20.000 Zellen) zu isolieren. Gleichzeitig sollte der Zeitaufwand für die Darmisolierung so kurz wie möglich gehalten werden, um eine nachteilige Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit zu vermeiden. Frühere Berichte, die sich auf den Darm von Zebrafischlarven konzentrierten, verwendeten Accutase oder Trypsin zur Zelldissoziation 19,20,21. Während jedoch beide Dissoziationsenzyme in der Lage waren, genügend lebensfähige Zellen für die scRNA-Sequenzierung zu isolieren, erlaubte die Accutase nicht den Einfang enterischer neuronaler Zellen19,20. Trypsin eroberte jedoch überwiegend Epithelzellen und lieferte nur eine geringe Anzahl von enterischen neuronalen Zellen21. Papain ist allgemein für seine Sanftheit bekannt, die besonders vorteilhaft für die Erhaltung der enterischen neuronalen Integrität sein kann22. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Papain tatsächlich wirksam ist, um die Lebensfähigkeit neuronaler Zellen aufrechtzuerhalten, was frühere Anwendungen bestätigt, in denen dieses Enzym zur Verdauung der Netzhaut und des Gehirns von Zebrafischen verwendet wurde23,24. Es ist jedoch erwähnenswert, dass selbst mit Papain die Zelllebensfähigkeit nach Darmisolierung und Dissoziation nur 6,4 % betrug. Dies deutet darauf hin, dass der anschließende FACS-Schritt für die Selektion lebensfähiger Zellen von entscheidender Bedeutung ist. Solche Ergebnisse können als Einschränkung angesehen werden, insbesondere wenn es sich um seltene und schwer zu erfassende Zellen von Interesse handelt.
Zukünftige Studien sollten sich auf neue Dissoziationsmethoden konzentrieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen während des Isolationsprotokolls zu verbessern. Einmal erhöht, wird diese Methode möglich, um reporterpositive Zellen auszusortieren und scRNA-Seq an bestimmten Darmzelltypen durchzuführen. Nichtsdestotrotz erlaubt die hier vorgestellte Methode die Erfassung von genügend lebensfähigen Zellen für die anschließende Identifizierung verschiedener Zelltypen im Darm, wie z.B. Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel-, Immunzellen und sogar enterische Neuronen und Gliazellen, die in diesem Zellstadium mit ähnlichen Ansätzen noch nicht erfasst wurden. Da die Fähigkeit, diese verschiedenen Zelltypen zu isolieren und zu analysieren, unerlässlich ist, um mehr Einblicke in die Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zu erhalten, halten wir diese Methode für besonders wertvoll, da sie einen zuverlässigen Ansatz bietet, um die Darmzusammensetzung am Modellorganismus des Zebrafisches zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Freunden der Sophia-Stiftung (SSWO WAR-63) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
