Summary
Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.
Abstract
O trato gastrointestinal (GI) desempenha uma série de funções essenciais para a vida. Defeitos congênitos que afetam seu desenvolvimento podem levar a distúrbios neuromusculares entéricos, ressaltando a importância da compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal. Neste estudo, apresentamos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias pós-fertilização para obtenção de células vivas viáveis que podem ser usadas para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Este protocolo baseia-se na dissecção manual do intestino do peixe-zebra, seguida de dissociação enzimática com papaína. Posteriormente, as células são submetidas à triagem celular ativada por fluorescência, e células viáveis são coletadas para scRNA-seq. Com esse método, conseguimos identificar com sucesso diferentes tipos de células intestinais, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, bem como neurônios entéricos e glia. Portanto, consideramos ser um recurso valioso para o estudo da composição do trato gastrointestinal na saúde e na doença, utilizando o peixe-zebra.
Introduction
O trato gastrointestinal (GI) é um sistema complexo que desempenha um papel vital na saúde geral e bem-estar. É responsável pela digestão e absorção de nutrientes, bem como pela eliminação de resíduos 1,2. O trato gastrointestinal é composto por múltiplos tipos celulares, incluindo células epiteliais, células musculares lisas, células imunes e sistema nervoso entérico (ENS), que se comunicam estreitamente para regular e manter a função intestinal adequada 3,4,5. Defeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal podem ter efeitos de longo alcance em vários aspectos, como absorção de nutrientes, composição da microbiota, eixo intestino-cérebro e ENS, levando a vários distúrbios neuromusculares entéricos, como a doença de Hirschsprung e a pseudo-obstrução intestinal crônica 6,7. Esses distúrbios são caracterizados por dismotilidade intestinal grave causada por alterações em várias células-chave, como as células intersticiais de Cajal, as células musculares lisas e a ENS 6,8,9. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal ainda são pouco compreendidos.
O peixe-zebra é um valioso organismo modelo para estudar o desenvolvimento e a disfunção gastrointestinal devido ao seu rápido desenvolvimento embrionário, transparência durante os estágios embrionário e larval e tratabilidade genética 10,11,12,13,14. Numerosas linhagens transgênicas de zebrafish expressando proteínas fluorescentes estão disponíveis. Um exemplo dessa linhagem é o peixe-zebra tg(phox2bb:GFP), comumente usado para estudar a ENS, pois todas as células phox2bb+, incluindo os neurônios entéricos, são marcadas15,16. Aqui, usando a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), apresentamos um método de isolamento intestinal de larvas 5 dias pós-fertilização (dpf) para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) (Figura 1).
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Protocol
Toda a criação e experimentos de zebrafish foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais do Erasmus MC e legislação de bem-estar animal. O uso de larvas de peixe-zebra aos 5 dias após a fertilização se enquadra na categoria de experimentos que não exigem aprovação ética formal, conforme descrito pelos regulamentos holandeses.
1. Obtenção de 5 dias pós-fertilização (dpf) de larvas selvagens e tg(phox2bb:GFP)
- Montar a reprodução de zebrafish selvagem e coletar 50 ovos em meio E3 tamponada com HEPES (doravante denominado E3) em uma placa de Petri de 15 cm. Use esses peixes como um controle negativo para a classificação de células ativadas por fluorescência (FACs).
- Montar a reprodução do zebrafish tg(phox2bb:GFP) e coletar aproximadamente 300 ovos em E3 em uma placa de Petri de 15 cm.
- Manter os ovos fertilizados em E3 (máximo de 50 ovos/prato) em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h, em incubadora a 28,5 °C.
- Em 1 dpf, remova os óvulos não fertilizados e deixe os fertilizados se desenvolverem até 5 dpf.
- Selecione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.
2. Dissociação de larvas inteiras selvagens
- Anestesiar larvas de 5 dpf com 0,016% de tricaína.
- Pique 30 peixes-zebra em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo 1 mL de solução de tripsina-EDTA 10x.
- Transferir o peixe-zebra picado para um tubo de microcentrífuga com um volume total de 2 mL de solução de tripsina-EDTA 10x e deixar no gelo por 3 h. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 a cada hora para estimular a dissociação.
3. Isolamento intestinal
- Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas com Tricaína a 0,016% seguidas, em placa de agarose a 1,8% (0,45 g de agarose em 25 mL de E3), sob microscópio de dissecção
- Coloque um pino de inseto na cabeça do peixe-zebra.
- Remova todo o E3 restante usando um tecido.
- Isole o intestino usando outro pino de inseto, sem perturbar quaisquer outros órgãos. Certifique-se de que a gema é removida (Figura Suplementar S1A).
- Uma vez isolado, inspecione o intestino e remova todo o material não intestinal (por exemplo, pele, gordura, fígado), se necessário.
- Coletar o intestino com uma pinça e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga, contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), sobre gelo.
OBS: Um mínimo de 244 intestinos deve ser isolado, mantendo-se o tempo total de dissecção em 3 h. Isso é viável com duas pessoas trabalhando em paralelo.
4. Dissociação intestinal
- Imediatamente após a dissecção de todos os intestinos, centrifugar o tubo de microcentrífuga a toda velocidade (13.800 × g) por 30 s.
- Remova o PBS/10% FCS, mas deixe uma pequena quantidade (~100 μL) para evitar que os intestinos sequem. Adicionar 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína em HBSS contendo CaCl2 e MgCl2, para dissociar as células.
- Ativar papaína com 2,5 μL de cisteína (1 M).
- Incubar as vísceras em banho-maria a 37 °C durante 10 min. Pipetar para cima e para baixo na metade do caminho (após 5 min) para estimular a digestão enzimática do tecido.
- Transfira as células para um tubo FACS usando um filtro celular de 35 μm, pré-umedecido com 0,5 mL de PBS/10% FCS.
- Lave o filtro adicionando um total de 2 mL de PBS/FCS a 10% em passos de 0,5 mL.
- Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 300 μL de PBS/10% FCS.
- Adicionar 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar as células mortas (1:1.000) e incubar por 5 min para permitir sua exclusão durante a FACS.
5. Enriquecimento FACS
- Use a amostra wildtype para definir as portas da população de células classificadas registrando 3.000 células no citômetro de fluxo (Figura suplementar S1B-E).
- Use um bocal de 100 μm, ajuste a precisão de classificação na pureza e coloque o tubo de coleta contendo 200 μL de PBS/5% FCS, na máquina FACS.
- Carregar a suspensão celular das vísceras e classificar células vivas (DAPI-negativas), unicélulas no tubo de coleta (Figura 2C), excluindo-se duplos (Figura 2B) e células mortas (Figura 2C).
NOTA: Para o peixe-zebra tg(phox2bb), a proporção de células GFP+ é verificada apenas para referência, pois todas as células vivas individuais são classificadas. - Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem celular.
- Conte a suspensão celular com um hemocitômetro, incluindo uma verificação de viabilidade com azul de tripano. Se a viabilidade for de pelo menos 80%, continue com o próximo passo.
- As células agora estão prontas para processar para scRNAseq (ou seja, plataforma 10x Genomics Chromium). Use aproximadamente 20.000 células por amostra.
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Representative Results
Com este protocolo, obtivemos sucesso no isolamento e dissociação de intestinos inteiros de larvas de 5 dpf. Usando papaína como enzima de dissociação, aumentamos significativamente a viabilidade celular, permitindo a captura de 46.139 eventos envolvendo células únicas viáveis (6,4% de todas as células) de 244 intestinos isolados (Figura 2A). Larvas inteiras selvagens foram usadas como controle para garantir que o processo de triagem fosse otimizado, permitindo a identificação e triagem celular eficaz. Larvas inteiras poderiam ser usadas como nós só classificamos para células vivas e únicas (Figura Suplementar S1B-E). Todas as células intestinais selecionadas foram posteriormente submetidas à plataforma seq scRNA. No total, 9.858 células foram sequenciadas com leituras médias por célula de 21.106. Para a análise do scRNA-seq, foi utilizado o Seurat V317. No total, foram identificados 48 agrupamentos representando 12 diferentes tipos celulares, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, além de neurônios entéricos e glia18.
Figura 1: Planejamento experimental para sequenciamento de RNA unicelular de intestinos isolados de zebrafish. Abreviações: FACS = fluorescence-activated cell sorting; scRNA-seq = sequenciamento de RNA de célula única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de gating para classificar células vivas e únicas do intestino do peixe-zebra. (A) Análise pós-classificação com gating de tamanho FCS/SSC. (B) Dupla discriminação. (C) População triada e de células vivas/mortas. (D) Células Phox2bb:GFP+ presentes na população viva triada. Em cada painel, a porcentagem de células fechadas é mostrada. Abreviações: FCS-A = área do pico de dispersão anterior; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; GFP = proteína fluorescente verde; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Isolamento intestinal e estratégia de confinamento para classificar células vivas e únicas de larvas inteiras de zebrafish selvagem. (A) Imagem de campo claro do isolamento intestinal de 5 dias após a fertilização de larvas de zebrafish. A linha vermelha indica a linha de dissecção. (B) Análise pós-classificação, mostrando todas as células com limitação de tamanho FCS/SSC. (C) Seleção singlet. (D) Fechamento DAPI. (E) Phox2bb:GFP+ gating. A porcentagem de células fechadas é mostrada em cada painel. Abreviações: FCS-A = área do pico de dispersão anterior; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; GFP = proteína fluorescente verde; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, apresentamos um método para isolamento e dissociação do intestino de larvas de 5 dpf de zebrafish usando FACS. Com este método, diferentes tipos celulares intestinais foram coletados e analisados com sucesso por scRNA-seq, utilizando a plataforma 10x Genomics Chromium. Selecionamos a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), pois queríamos uma indicação de que células viáveis do ENS também seriam isoladas (Figura 2D). No entanto, é importante notar que este método pode ser prontamente estendido a outras linhagens de peixe-zebra de interesse, pois usamos apenas o gating phox2bb para avaliar a viabilidade neuronal, e não para selecionar para uma população celular específica. Uma vez que decidimos usar uma abordagem imparcial para coletar todas as células intestinais presentes em 5 dpf, o critério de classificação depende principalmente da identificação de células vivas e individuais. Esta é também a razão por trás do uso de larvas inteiras para estabelecer uma estratégia de confinamento confiável e consistente. Considerando o trabalho envolvido no isolamento de intestinos individuais, torna-se impraticável isolar mais intestinos para servir como controle negativo, dentro do prazo dado a este experimento. Portanto, embora reconheçamos que os tipos celulares das larvas inteiras diferem daqueles encontrados no intestino, e até mesmo métodos de dissociação distintos foram usados, é notável que a estratégia de gating aplicada para classificar as células intestinais pode ser inicialmente validada usando larvas inteiras, pois estávamos interessados apenas em avaliar a viabilidade celular.
Para realizar scRNA-seq, uma etapa crítica neste protocolo seria isolar um número suficiente de células viáveis (~20.000 células). Ao mesmo tempo, o tempo gasto para o isolamento intestinal deve ser mantido o mais curto possível para evitar um efeito prejudicial sobre a viabilidade celular. Relatos anteriores enfocando intestinos de larvas de peixe-zebra empregaram acutase ou tripsina para dissociação celular 19,20,21. Entretanto, enquanto ambas as enzimas de dissociação foram capazes de isolar células viáveis suficientes para scRNA-seq, a accutase não permitiu a captura de células neuronais entéricas19,20. A tripsina, entretanto, capturou predominantemente células epiteliais, produzindo apenas um baixo número de células neuronais entéricas21. A papaína é comumente reconhecida por sua suavidade, que pode ser particularmente benéfica para preservar a integridade neuronal entérica22. Nossos resultados mostraram que a papaína é realmente eficaz na manutenção da viabilidade das células neuronais, confirmando aplicações anteriores em que essa enzima foi usada para digerir a retina adulta e o cérebro de peixes-zebra23,24. Entretanto, vale ressaltar que, mesmo com a papaína, a viabilidade celular pós-isolamento e dissociação intestinal foi de apenas 6,4%. Isso sugere que a etapa subsequente da FACS é, portanto, crucial para selecionar células viáveis. Tais resultados podem ser considerados uma limitação, principalmente quando se trata de células de interesse escassas e desafiadoras para a captura.
Estudos futuros devem enfocar novos métodos de dissociação para melhorar a viabilidade celular durante o protocolo de isolamento. Uma vez aumentado, este método torna-se viável para classificar células reporter-positivas e realizar scRNA-seq em tipos específicos de células intestinais. No entanto, o método aqui apresentado permite a captura de células viáveis suficientes para a posterior identificação de diferentes tipos celulares dentro do intestino, tais como células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares, imunes e até mesmo neurônios entéricos e glia, que não foram capturados antes nesta fase celular usando abordagens semelhantes. Uma vez que a capacidade de isolar e analisar esses diferentes tipos celulares é essencial para obter mais informações sobre o desenvolvimento e disfunção gastrointestinal, consideramos este método particularmente valioso, pois fornece uma abordagem confiável para estudar a composição intestinal usando o peixe-zebra, como um organismo modelo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos amigos da Fundação Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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