Summary
Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.
Abstract
El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.
Introduction
El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho 1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada 3,4,5. Los defectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal pueden tener efectos de gran alcance en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la composición de la microbiota, el eje intestino-cerebro y el SNE, lo que conduce a varios trastornos neuromusculares entéricos, como la enfermedad de Hirschsprung y la pseudoobstrucción intestinal crónica 6,7. Estos trastornos se caracterizan por una dismotilidad intestinal severa causada por alteraciones en varias células clave, como las células intersticiales de Cajal, las células musculares lisas y el SNE 6,8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal aún no se conocen bien.
El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar el desarrollo y la disfunción gastrointestinal debido a su rápido desarrollo embrionario, transparencia durante las etapas embrionaria y larvaria, y trazabilidad genética 10,11,12,13,14. Se dispone de numerosas líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes. Un ejemplo de este tipo de línea es el pez cebra tg(phox2bb:GFP), comúnmente utilizado para estudiar el SNE, ya que todas las células phox2bb+, incluidas las neuronas entéricas, están marcadas como15,16. Aquí, utilizando la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas 5 días después de la fertilización (dpf) para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Figura 1).
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Protocol
Toda la cría y los experimentos de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la legislación Erasmus MC y de bienestar animal. El uso de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización entra en la categoría de experimentos que no requieren aprobación ética formal, como se describe en las regulaciones holandesas.
1. Obtención de larvas de tipo silvestre y tg (phox2bb:GFP) 5 días después de la fertilización (dpf)
- Establecer la cría de peces cebra salvajes y recoger 50 huevos en medio E3 tamponado con HEPES (en lo sucesivo, E3) en una placa de Petri de 15 cm. Utilice estos peces como control negativo para la clasificación celular activada por fluorescencia (FAC).
- Establezca la cría de pez cebra tg (phox2bb: GFP) y recoja aproximadamente 300 huevos en E3 en una placa de Petri de 15 cm.
- Mantener los óvulos fecundados en E3 (máximo 50 huevos/plato) en un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h, en incubadora a 28,5 °C.
- A 1 dpf, retire los óvulos no fertilizados y deje que los fertilizados se desarrollen a 5 dpf.
- Seleccione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.
2. Disociación de larvas enteras de tipo salvaje
- Anestesiar larvas de 5 dpf con tricaína al 0,016%.
- Pica 30 peces cebra en trozos pequeños con una cuchilla de afeitar en una placa de Petri que contenga 1 ml de solución de tripsina-EDTA 10x.
- Transfiera el pez cebra picado a un tubo de microcentrífuga con un volumen total de 2 ml de solución de tripsina-EDTA 10x y déjelo en hielo durante 3 h. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 cada hora para estimular la disociación.
3. Aislamiento intestinal
- Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas con Tricaína al 0,016% seguidas, en una placa de agarosa al 1,8% (0,45 g de agarosa en 25 mL de E3), bajo un microscopio de disección
- Coloca un alfiler de insecto en la cabeza del pez cebra.
- Retire todo el E3 restante con un pañuelo de papel.
- Aísle el intestino con otro alfiler de insecto, sin perturbar ningún otro órgano. Asegúrese de retirar la yema (Figura complementaria S1A).
- Una vez aislado, inspeccione el intestino y retire todo el material no intestinal (por ejemplo, piel, grasa, hígado) si es necesario.
- Recoja el intestino con pinzas y colóquelo en un tubo de microcentrífuga, que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero fetal de ternero (FCS) al 10%, en hielo.
NOTA: Se debe aislar un mínimo de 244 intestinos, manteniendo el tiempo total de disección en 3 h. Esto es factible con dos personas trabajando en paralelo.
4. Disociación intestinal
- Inmediatamente después de la disección de todos los intestinos, centrifugar el tubo de microcentrífuga a toda velocidad (13.800 × g) durante 30 s.
- Retire el PBS/FCS al 10% pero deje una pequeña cantidad (~100 μL) para evitar que los intestinos se sequen. Añadir 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína en HBSS que contenga CaCl2 y MgCl2, para disociar las células.
- Activar la papaína con 2,5 μL de cisteína (1 M).
- Incubar las tripas al baño maría a 37 °C durante 10 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta la mitad (después de 5 minutos) para estimular la digestión enzimática del tejido.
- Transfiera las células a un tubo FACS utilizando un filtro de células de 35 μm, prehumedecido con 0,5 ml de PBS/FCS al 10%.
- Lave el colador agregando un total de 2 ml de PBS/10% FCS en pasos de 0.5 ml.
- Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL de PBS/10% FCS.
- Añadir 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar las células muertas (1:1.000) e incubar durante 5 min para permitir su exclusión durante el FACS.
5. Enriquecimiento de FACS
- Utilice la muestra de tipo salvaje para establecer las puertas de la población de células ordenadas registrando 3.000 células en el citómetro de flujo (Figura complementaria S1B-E).
- Utilice una boquilla de 100 μm, ajuste la precisión de clasificación en función de la pureza y coloque el tubo de recolección que contiene 200 μL de PBS / 5% FCS, en la máquina FACS.
- Cargue la suspensión celular de los intestinos y clasifique las células individuales vivas (DAPI-negativas) en el tubo de recolección (Figura 2C), excluyendo los dobletes (Figura 2B) y las células muertas (Figura 2C).
NOTA: Para el pez cebra tg(phox2bb), la proporción de células GFP+ sólo se comprueba como referencia, ya que todas las células vivas individuales están clasificadas. - Mantenga el tubo de recolección en hielo después de la clasificación de células.
- Cuente la suspensión celular con un hemocitómetro, incluyendo una verificación de viabilidad con azul de tripano. Si la viabilidad es de al menos el 80%, continúe con el siguiente paso.
- Las células ahora están listas para procesar para scRNAseq (es decir, la plataforma 10x Genomics Chromium). Utilice aproximadamente 20.000 células por muestra.
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Representative Results
Con este protocolo, logramos aislar y disociar con éxito intestinos enteros de larvas de 5 dpf. Utilizando papaína como enzima de disociación, mejoramos significativamente la viabilidad celular, permitiendo la captura de 46.139 eventos que involucraron células individuales viables (6,4% de todas las células) de 244 intestinos aislados (Figura 2A). Se utilizaron larvas enteras de tipo salvaje como control para garantizar que se optimizara el proceso de clasificación, lo que permitió una identificación y clasificación celulares efectivas. Las larvas enteras podrían usarse, ya que solo clasificamos las células vivas y individuales (Figura suplementaria S1B-E). Posteriormente, todas las células intestinales clasificadas se enviaron a la plataforma scRNA seq. En total, se secuenciaron 9.858 células, con una media de lecturas por célula de 21.106. Para el análisis de scRNA-seq, se utilizó Seurat V317. En total, se identificaron 48 grupos que representan 12 tipos celulares diferentes, incluyendo células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como neuronas entéricas y glía18.
Figura 1: Diseño experimental para la secuenciación de ARN unicelular de intestinos aislados de pez cebra. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; scRNA-seq = secuenciación de ARN de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de compuerta para separar células individuales vivas del intestino del pez cebra. (A) Análisis de clasificación posterior con compuerta de tamaño FCS/SSC. B) Discriminación doble. (C) Activación de celdas vivas/muertas y población clasificada. (D) Células Phox2bb:GFP+ presentes en la población viva clasificada. En cada panel, se muestra el porcentaje de celdas cerradas. Abreviaturas: FCS-A = área de pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; GFP = proteína verde fluorescente; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Aislamiento intestinal y estrategia de compuerta para separar células individuales vivas de larvas enteras de pez cebra de tipo salvaje. (A) Imagen de campo claro del aislamiento intestinal de las larvas de pez cebra 5 días después de la fertilización. La línea roja indica la línea de disección. (B) Análisis posterior a la clasificación, que muestra todas las celdas con compuerta de tamaño FCS/SSC. (C) Selección de singlete. (D) Activación DAPI. (E) Puerta Phox2bb:GFP+. El porcentaje de celdas cerradas se muestra en cada panel. Abreviaturas: FCS-A = área de pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; GFP = proteína verde fluorescente; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tener en cuenta que este método puede extenderse fácilmente a otras líneas de interés de pez cebra, ya que solo utilizamos la compuerta phox2bb para evaluar la viabilidad neuronal, y no para seleccionar una población celular específica. Dado que decidimos utilizar un enfoque imparcial para recolectar todas las células intestinales presentes a 5 dpf, el criterio de clasificación depende principalmente de la identificación de células vivas e individuales. Esta es también la razón detrás del uso de larvas enteras para establecer una estrategia de compuerta confiable y consistente. Teniendo en cuenta el trabajo involucrado en el aislamiento de intestinos individuales, se vuelve poco práctico aislar más intestinos para que sirvan como un control negativo, dentro del marco de tiempo dado de este experimento. Por lo tanto, aunque reconocemos que los tipos de células de las larvas enteras difieren de las que se encuentran en el intestino, e incluso se utilizaron métodos de disociación distintos, es notable que la estrategia de compuerta aplicada para clasificar las células intestinales puede validarse inicialmente utilizando larvas enteras, ya que solo estábamos interesados en evaluar la viabilidad celular.
Para realizar scRNA-seq, un paso crítico en este protocolo sería aislar un número suficiente de células viables (~20.000 células). Al mismo tiempo, el tiempo dedicado al aislamiento intestinal debe mantenerse lo más corto posible para evitar un efecto perjudicial sobre la viabilidad celular. Informes anteriores centrados en los intestinos de las larvas de pez cebra emplearon accutasa o tripsina para la disociación celular 19,20,21. Sin embargo, mientras que ambas enzimas de disociación fueron capaces de aislar suficientes células viables para scRNA-seq, la accutasa no permitió la captura de células neuronales entéricas19,20. La tripsina, sin embargo, capturó predominantemente células epiteliales, produciendo solo un bajo número de células neuronales entéricas21. La papaína es comúnmente reconocida por su suavidad, que puede ser particularmente beneficiosa para preservar la integridad neuronal entérica22. Nuestros resultados mostraron que la papaína es efectiva para mantener la viabilidad de las células neuronales, confirmando aplicaciones previas en las que esta enzima se utilizó para digerir la retina y el cerebro adultos del pez cebra23,24. Sin embargo, vale la pena mencionar que incluso con la papaína, la viabilidad celular después del aislamiento y disociación intestinal fue solo del 6,4%. Esto sugiere que el siguiente paso de FACS es, por lo tanto, crucial para seleccionar células viables. Estos resultados pueden considerarse una limitación, especialmente cuando se trata de células de interés escasas y difíciles de capturar.
Los estudios futuros deben centrarse en nuevos métodos de disociación para mejorar la viabilidad celular durante el protocolo de aislamiento. Una vez aumentado, este método se vuelve factible para clasificar las células reporteras positivas y realizar scRNA-seq en tipos específicos de células intestinales. Sin embargo, el método que aquí se presenta permite la captura de suficientes células viables para la posterior identificación de diferentes tipos de células dentro del intestino, como epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares, células inmunitarias e incluso neuronas entéricas y glía, que no se han capturado antes en esta etapa celular utilizando enfoques similares. Dado que la capacidad de aislar y analizar estos diferentes tipos de células es esencial para obtener más información sobre el desarrollo y la disfunción gastrointestinal, consideramos que este método es particularmente valioso, ya que proporciona un enfoque confiable para estudiar la composición intestinal utilizando el pez cebra, como organismo modelo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amigos de Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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