Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.
Abstract
מערכת העיכול מבצעת מגוון תפקודים חיוניים לחיים. פגמים מולדים המשפיעים על התפתחותה יכולים להוביל להפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, המדגישות את החשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי. במחקר זה, אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה כדי להשיג תאים חיים וברי קיימא אשר יכולים לשמש לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). פרוטוקול זה מבוסס על דיסקציה ידנית של המעי של דג הזברה, ואחריה דיסוציאציה אנזימטית עם פפאין. לאחר מכן, תאים נשלחים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ותאים בני קיימא נאספים עבור scRNA-seq. בשיטה זו הצלחנו לזהות בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שרירים ומערכת החיסון, כמו גם תאי עצב אנטריים ותאי גליה. לכן, אנו רואים את זה להיות משאב יקר ערך לחקר הרכב מערכת העיכול בבריאות ומחלות, באמצעות דג הזברה.
Introduction
מערכת העיכול (GI) היא מערכת מורכבת הממלאת תפקיד חיוני בבריאות וברווחה הכללית. הוא אחראי על העיכול והספיגה של חומרים מזינים, כמו גם חיסול של מוצרי פסולת 1,2. מערכת העיכול מורכבת ממספר סוגי תאים, כולל תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון ומערכת העצבים האנטרית (ENS), אשר מתקשרים באופן הדוק זה עם זה כדי לווסת ולשמור על תפקוד מעיים תקין 3,4,5. לפגמים בהתפתחות מערכת העיכול יכולות להיות השפעות מרחיקות לכת על היבטים שונים כגון ספיגת חומרים מזינים, הרכב המיקרוביוטה, ציר המעי-מוח וה-ENS, מה שמוביל למספר הפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, כגון מחלת הירשפרונג וחסימת מעיים כרונית 6,7. הפרעות אלה מאופיינות בחוסר תנועתיות חמור של המעי הנגרם על ידי שינויים בתאי מפתח שונים, כגון תאי interstitial של Cajal, תאי שריר חלק, ואת ENS 6,8,9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי עדיין אינם מובנים היטב.
דג הזברה הוא אורגניזם מודל רב ערך לחקר התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי שלה בשל התפתחותה העוברית המהירה, שקיפותה בשלבים עובריים וזחליים, ויכולת גנטית 10,11,12,13,14. קיימים קווי דגי זברה טרנסגניים רבים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. דוגמה לקו כזה היא דג הזברה tg(phox2bb:GFP), המשמש בדרך כלל לחקר ENS, שכן כל תאי phox2bb+, כולל נוירונים אנטריים, מסומנים15,16. כאן, באמצעות קו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים של זחלי 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) לצורך ניתוח ריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל גידול דגי הזברה והניסויים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות של ארסמוס MC וחקיקת רווחת בעלי חיים. השימוש בזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה נופל תחת הקטגוריה של ניסויים שאינם דורשים אישור אתי רשמי, כפי שנקבע בתקנות ההולנדיות.
1. השגת 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי בר ו-tg (phox2bb:GFP)
- הקימו רבייה של דגי זברה פראיים ואספו 50 ביצים בתווך E3 חוצץ HEPES (להלן E3) בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ. השתמשו בדגים אלה כבקרה שלילית למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FAC).
- הקימו רבייה של דגי זברה tg (phox2bb:GFP) ואספו כ-300 ביצים ב-E3 בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ.
- יש לשמור ביצים מופרות ב-E3 (מקסימום 50 ביצים לצלחת) במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות, באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
- ב 1 dpf, להסיר ביצים מופרות ולתת אלה מופרות להתפתח ל 5 dpf.
- בחר זחלי tg (phox2bb:GFP) ב- 1 dpf.
2. דיסוציאציה של זחלים שלמים
- מרדימים 5 זחלי dpf עם 0.016% טריקאין.
- קוצצים 30 דגי זברה לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח בצלחת פטרי המכילה 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x.
- מעבירים את דג הזברה הקצוץ לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח כולל של 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x ומשאירים על קרח למשך 3 שעות. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 כל שעה כדי לעורר דיסוציאציה.
3. בידוד המעי
- מניחים 6-10 5 זחלי dpf מורדמים עם 0.016% טריקאין ברציפות, על צלחת אגרוז 1.8% (0.45 גרם אגרוז ב 25 מ"ל של E3), תחת מיקרוסקופ דיסקציה
- שים סיכת חרק אחת בראשו של דג הזברה.
- הסר את כל E3 הנותרים באמצעות רקמה.
- בודדו את המעי באמצעות סיכת חרקים אחרת, מבלי להפריע לאיברים אחרים. ודאו שהחלמון מוסר (איור משלים S1A).
- לאחר הבידוד, בדוק את המעי והסר את כל החומר שאינו מעיים (למשל, עור, שומן, כבד) במידת הצורך.
- אספו את המעי בפינצטה והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, המכיל מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), על קרח.
הערה: יש לבודד לפחות 244 מעיים, תוך שמירה על זמן הדיסקציה הכולל על 3 שעות. זה אפשרי עם שני אנשים שעובדים במקביל.
4. דיסוציאציה של המעי
- מיד לאחר הדיסקציה של כל המעיים, צנטריפוגה את צינור microcentrifuge במהירות מלאה (13,800 × גרם) במשך 30 שניות.
- הסר את PBS / 10% FCS אך השאר כמות קטנה (~ 100 μL) כדי למנוע מהמעיים להתייבש. הוסף 500 μL של 2.17 מ"ג / מ"ל פפאין HBSS המכיל CaCl2 ו MgCl2, כדי לנתק תאים.
- הפעל פפאין עם 2.5 μL של ציסטאין (1 M).
- לדגור את המעיים באמבט מים ב 37 ° C במשך 10 דקות. פיפטה למעלה ולמטה באמצע הדרך (לאחר 5 דקות) כדי לעורר עיכול רקמות אנזימטי.
- העבר תאים לצינור FACS באמצעות מסננת תאים של 35 מיקרומטר, שהורטבה מראש עם 0.5 מ"ל של PBS / 10% FCS.
- שטפו את המסננת על ידי הוספת סך של 2 מ"ל PBS / 10% FCS בשלבים של 0.5 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
- הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 300 μL של PBS / 10% FCS.
- הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לתייג תאים מתים (1:1,000) ודגר במשך 5 דקות כדי לאפשר את הוצאתם במהלך FACS.
5. העשרת FACS
- השתמשו בדגימת wildtype כדי לקבוע את השערים של אוכלוסיית התאים הממוינת על-ידי רישום 3,000 תאים על ציטומטר הזרימה (איור משלים S1B-E).
- השתמש בפייה של 100 מיקרומטר, קבע דיוק מיון על טוהר, והכניס את צינור האיסוף המכיל 200 μL של PBS / 5% FCS, למכונת FACS.
- העמיסו את תרחיף התאים של המעי ומינו תאים בודדים חיים (DAPI-שליליים) לתוך צינור האיסוף (איור 2C), על-ידי אי הכללת תאים כפולים (איור 2B) ותאים מתים (איור 2C).
הערה: עבור דגי הזברה tg(phox2bb), היחס בין תאי GFP+ נבדק רק לצורך סימוכין, מכיוון שכל התאים החיים הבודדים ממוינים. - שמור את צינור האיסוף על קרח לאחר מיון תאים.
- ספרו את תרחיף התא עם המוציטומטר, כולל בדיקת כדאיות עם טריפאן כחול. אם הכדאיות היא לפחות 80%, המשך לשלב הבא.
- תאים מוכנים כעת לעיבוד עבור scRNAseq (כלומר, פלטפורמת כרום גנומיקה 10x). השתמש בכ- 20,000 תאים לדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעזרת פרוטוקול זה השגנו בידוד ודיסוציאציה מוצלחים של מעיים שלמים מ-5 זחלי dpf. באמצעות שימוש בפפאין כאנזים דיסוציאציה, שיפרנו באופן משמעותי את יכולת הקיום של התא, ואפשרנו לכידה של 46,139 אירועים המערבים תאים יחידים בני קיימא (6.4% מכלל התאים) מתוך 244 מעי מבודדים (איור 2A). זחלי הבר השלמים שימשו כאמצעי בקרה כדי להבטיח שתהליך המיון יהיה אופטימלי, מה שיאפשר זיהוי ומיון תאים יעילים. זחלים שלמים יכולים לשמש מאחר שאנו ממיינים רק תאים חיים ובודדים (איור משלים S1B-E). כל תאי המעי הממוינים נשלחו לאחר מכן לפלטפורמת scRNA seq. בסך הכל, 9,858 תאים רוצפו עם קריאות ממוצעות לכל תא של 21,106. עבור ניתוח scRNA-seq, השתמשנו Seurat V317. בסך הכל זוהו 48 אשכולות המייצגים 12 סוגי תאים שונים, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שריר ומערכת החיסון, כמו גם נוירונים אנטריים וגליה18.
איור 1: תכנון ניסויי לריצוף רנ"א חד-תאי של מעי דגי זברה מבודדים. קיצורים: FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות; scRNA-seq = ריצוף RNA חד-תאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית גטינג למיון תאים חיים ובודדים ממעי דג הזברה. (A) ניתוח מיון לאחר מכן עם גידור גודל FCS/SSC. (ב) אפליה כפולה. (C) תאים חיים/מתים ואוכלוסייה ממוינת. (D) Phox2bb:תאי GFP+ הנמצאים באוכלוסיית החיים הממוינים. בכל חלונית, אחוז התאים המגודרים מוצג. קיצורים: FCS-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; FITC = איזותיוציאנט פלואורסצאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: בידוד מעיים ואסטרטגיית גטינג למיון תאים חיים ובודדים מזחלי דגי זברה שלמים. (A) תמונת שדה בהיר של בידוד מעיים מ-5 ימים לאחר ההפריה של זחלי דגי זברה. הקו האדום מציין את קו הנתיחה. (B) ניתוח לאחר המיון, המציג את כל התאים עם גידור גודל FCS/SSC. (ג) בחירת סינגלט. (ד) DAPI gating. (E) Phox2bb:GFP+ gating. אחוז התאים המגודרים מוצג בכל חלונית. קיצורים: FCS-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; FITC = איזותיוציאנט פלואורסצאין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד ודיסוציאציה של המעיים של 5 זחלי דגי זברה dpf באמצעות FACS. בשיטה זו, סוגי תאי מעיים שונים נאספו ונותחו בהצלחה על ידי scRNA-seq, תוך שימוש בפלטפורמת 10x Genomics Chromium. בחרנו בקו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), מאחר שרצינו אינדיקציה לכך שגם תאי ENS בני קיימא יבודדו (איור 2D). עם זאת, חשוב לציין כי שיטה זו יכולה להיות מורחבת בקלות לקווי עניין אחרים של דגי זברה, שכן השתמשנו רק ב- phox2bb gating כדי להעריך את הכדאיות העצבית, ולא כדי לבחור עבור אוכלוסיית תאים ספציפית. מכיוון שהחלטנו להשתמש בגישה בלתי משוחדת כדי לאסוף את כל תאי המעי הנמצאים ב- 5 dpf, קריטריון המיון תלוי בעיקר בזיהוי תאים חיים ובודדים. זו גם הסיבה מאחורי השימוש בזחלים שלמים כדי לבסס אסטרטגיית גטינג אמינה ועקבית. בהתחשב בעבודה הכרוכה בבידוד מעיים בודדים, זה הופך להיות לא מעשי לבודד יותר מעיים כדי לשמש כבקרה שלילית, במסגרת הזמן הנתונה של ניסוי זה. לכן, בעוד שאנו מכירים בכך שסוגי תאים מהזחלים השלמים שונים מאלה הנמצאים במעי, ואפילו נעשה שימוש בשיטות דיסוציאציה שונות, ראוי לציין כי אסטרטגיית הגאטינג המיושמת למיון תאי מעיים ניתנת לאימות ראשוני באמצעות זחלים שלמים, מכיוון שהיינו מעוניינים רק להעריך את כדאיות התא.
כדי לבצע scRNA-seq, צעד קריטי בפרוטוקול זה יהיה לבודד מספר מספיק של תאים קיימא (~ 20,000 תאים). יחד עם זאת, הזמן המושקע לבידוד המעי צריך להישמר קצר ככל האפשר כדי למנוע השפעה מזיקה על יכולת הקיום של התא. דיווחים קודמים שהתמקדו במעי זחלי זברה השתמשו באקוטאז או טריפסין לדיסוציאציה של תאים 19,20,21. עם זאת, בעוד ששני אנזימי הדיסוציאציה הצליחו לבודד מספיק תאים ברי קיימא עבור scRNA-seq, אקוטאז לא איפשר לכידת תאים עצביים אנטריים19,20. טריפסין, לעומת זאת, לכד בעיקר תאי אפיתל, והניב רק מספר נמוך של תאים עצביים אנטריים21. פפאין מוכר בדרך כלל בעדינותו, אשר יכול להיות מועיל במיוחד לשמירה על שלמות עצבית אנטרית22. התוצאות שלנו הראו כי פפאין אכן יעיל בשמירה על יכולת הקיום של תאים עצביים, ואישרו יישומים קודמים שבהם אנזים זה שימש לעיכול דגי זברה, רשתית בוגרת ומוח23,24. עם זאת, ראוי לציין כי אפילו עם פפאין, כדאיות התאים לאחר בידוד מעיים ודיסוציאציה הייתה רק 6.4%. זה מצביע על כך ששלב FACS הבא הוא, אם כן, חיוני לבחור תאים בני קיימא. תוצאות כאלה יכולות להיחשב כמגבלה במיוחד כאשר מתמודדים עם תאים נדירים ומאתגרים ללכידה של עניין.
מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בשיטות דיסוציאציה חדשות לשיפור יכולת הקיום של התאים במהלך פרוטוקול הבידוד. לאחר הגדלתה, שיטה זו הופכת לאפשרית למיון תאים חיוביים לדיווח ולביצוע scRNA-seq על סוגי תאי מעי ספציפיים. עם זאת, השיטה המוצגת כאן מאפשרת לכידה של מספיק תאים בני קיימא לזיהוי מאוחר יותר של סוגי תאים שונים בתוך המעי, כגון אפיתל, סטרומה, דם, שריר, תאי מערכת החיסון, ואפילו נוירונים אנטריים וגליה, שלא נלכדו קודם לכן בשלב תא זה בגישות דומות. מאחר שהיכולת לבודד ולנתח את סוגי התאים השונים הללו חיונית לקבלת תובנות נוספות על התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי, אנו מחשיבים שיטה זו כבעלת ערך רב במיוחד, שכן היא מספקת גישה אמינה לחקר הרכב המעי באמצעות דג הזברה, כאורגניזם מודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי ידידי קרן סופיה (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
