Summary
Her beskriver vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning, for encellet RNA-sekvenseringsanalyse.
Abstract
Den gastrointestinale (GI) -kanalen utfører en rekke funksjoner som er avgjørende for livet. Medfødte defekter som påvirker utviklingen kan føre til enteriske nevromuskulære lidelser, og fremhever viktigheten av å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon. I denne studien presenterer vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning for å oppnå levende, levedyktige celler som kan brukes til encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse. Denne protokollen er basert på manuell disseksjon av sebrafisktarmen, etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon med papain. Deretter blir celler sendt til fluorescensaktivert cellesortering, og levedyktige celler samles for scRNA-seq. Med denne metoden var vi i stand til å identifisere forskjellige tarmcelletyper, inkludert epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller, samt enteriske nevroner og glia. Derfor anser vi det for å være en verdifull ressurs for å studere sammensetningen av GI-kanalen i helse og sykdom, ved hjelp av sebrafisken.
Introduction
Mage-tarmkanalen (GI) er et komplekst system som spiller en viktig rolle i generell helse og velvære. Det er ansvarlig for fordøyelsen og absorpsjonen av næringsstoffer, samt eliminering av avfallsprodukter 1,2. GI-kanalen består av flere celletyper, inkludert epitelceller, glatte muskelceller, immunceller og det enteriske nervesystemet (ENS), som kommuniserer tett sammen for å regulere og opprettholde riktig tarmfunksjon 3,4,5. Defekter i utviklingen av GI-kanalen kan ha vidtgående effekter på ulike aspekter som næringsopptak, mikrobiotasammensetning, tarm-hjerneaksen og ENS, noe som fører til flere enteriske nevromuskulære lidelser, som Hirschsprung sykdom og Kronisk intestinal pseudoobstruksjon 6,7. Disse lidelsene kjennetegnes av alvorlig tarmdysmotilitet forårsaket av endringer i forskjellige nøkkelceller, som interstitielle celler i Cajal, glatte muskelceller og ENS 6,8,9. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon fortsatt dårlig forstått.
Sebrafisken er en verdifull modellorganisme for å studere GI-utvikling og dysfunksjon på grunn av sin raske embryonale utvikling, gjennomsiktighet under embryonale stadier og larvestadier og genetisk trekkbarhet 10,11,12,13,14. Tallrike transgene sebrafisklinjer som uttrykker fluorescerende proteiner er tilgjengelige. Et eksempel på en slik linje er tg (phox2bb: GFP) sebrafisk, som vanligvis brukes til å studere ENS, da alle phox2bb + -celler, inkludert enteriske nevroner, er merket15,16. Her presenterer vi ved hjelp av tg(phox2bb:GFP) sebrafisklinjen en metode for tarmisolering på 5 dager etter befruktning (dpf) larver for encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt sebrafiskhold og forsøk ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjene i Erasmus MC og dyrevelferdslovgivningen. Bruk av sebrafisklarver 5 dager etter befruktning faller inn under kategorien forsøk som ikke krever formell etisk godkjenning, som beskrevet i nederlandsk regelverk.
1. Oppnå 5 dager etter befruktning (dpf) villtype og tg (phox2bb: GFP) larver
- Sett opp avl av villtype sebrafisk og samle 50 egg i HEPES-bufret E3 medium (heretter kalt E3) i en 15 cm petriskål. Bruk disse fiskene som en negativ kontroll for fluorescensaktivert cellesortering (FAC).
- Sett opp avl av tg (phox2bb: GFP) sebrafisk og samle ca 300 egg i E3 i en 15 cm petriskål.
- Hold befruktede egg i E3 (maksimalt 50 egg / tallerken) på en 14 t / 10 t lys / mørk syklus, i en inkubator ved 28,5 ° C.
- Ved 1 dpf, fjern ubefruktede egg og la de befruktede utvikle seg til 5 dpf.
- Velg tg(phox2bb:GFP) larver ved 1 dpf.
2. Wildtype hele larver dissosiasjon
- Bedøv 5 dpf larver med 0,016% Tricaine.
- Hakk 30 sebrafisk i små biter ved hjelp av et barberblad i en petriskål som inneholder 1 ml 10x trypsin-EDTA-løsning.
- Overfør den hakkede sebrafisken til et mikrosentrifugerør med et totalt volum på 2 ml 10x trypsin-EDTA-løsning og la den ligge på is i 3 timer. Pipett opp og ned med en P1000-pipette hver time for å stimulere dissosiasjon.
3. Isolasjon av tarmen
- Plasser 6-10 5 dpf larver bedøvet med 0,016% Tricaine på rad, på en 1,8% agaroseplate (0,45 g agarose i 25 ml E3), under et disseksjonsmikroskop
- Sett en insektnål i hodet på sebrafisken.
- Fjern all gjenværende E3 ved hjelp av et vev.
- Isoler tarmen ved hjelp av en annen insektnål, uten å forstyrre andre organer. Pass på at eggeplommen er fjernet (tilleggsfigur S1A).
- Når isolert, inspiser tarmen og fjern alt ikke-intestinalt materiale (f.eks. hud, fett, lever) om nødvendig.
- Samle tarmen med pinsett og legg den i et mikrosentrifugerør, som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS) med 10% føtal kalveserum (FCS), på is.
MERK: Minst 244 tarmer bør isoleres, og den totale disseksjonstiden holdes på 3 timer. Dette er mulig med to personer som jobber parallelt.
4. Gut dissosiasjon
- Umiddelbart etter disseksjon av alle tarmene, sentrifuge mikrosentrifugerøret i full hastighet (13 800 × g) i 30 s.
- Fjern PBS/10% FCS, men la det være en liten mengde (~100 μL) for å forhindre at tarmene tørker ut. Tilsett 500 μL 2,17 mg / ml papain i HBSS som inneholder CaCl2 og MgCl2, for å dissosiere celler.
- Aktiver papain med 2,5 μL cystein (1 M).
- Inkuber tarmen i et vannbad ved 37 °C i 10 minutter. Pipett opp og ned halvveis (etter 5 minutter) for å stimulere fordøyelsen av enzymatisk vev.
- Overfør celler til et FACS-rør ved hjelp av en 35 μm cellesil, prewetted med 0,5 ml PBS / 10% FCS.
- Vask silen ved å tilsette totalt 2 ml PBS/10 % FCS i trinn på 0,5 ml.
- Sentrifuge ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 300 mikrol PBS/10 % FCS.
- Legg til 1 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å merke døde celler (1: 1,000) og inkubere i 5 minutter for å tillate utelukkelse under FACS.
5. FACS-berikelse
- Bruk villtypeprøven til å stille inn portene til den sorterte cellepopulasjonen ved å registrere 3000 celler på strømningscytometeret (tilleggsfigur S1B-E).
- Bruk en 100 μm dyse, sett sorteringspresisjon på renhet, og sett oppsamlingsrøret som inneholder 200 μL PBS/5% FCS, i FACS-maskinen.
- Legg cellesuspensjonen i tarmen og sorter levende (DAPI-negative), enkeltceller i oppsamlingsrøret (figur 2C), ved å ekskludere dubletter (figur 2B) og døde celler (figur 2C).
MERK: For tg (phox2bb) sebrafisk blir andelen GFP + -celler bare sjekket for referanse, da alle enkeltlevende celler er sortert. - Oppbevar oppsamlingsrøret på is etter cellesortering.
- Telle cellesuspensjonen med et hemocytometer, inkludert en levedyktighetskontroll med trypanblå. Hvis levedyktigheten er minst 80%, fortsett med neste trinn.
- Celler er nå klare til å behandle for scRNAseq (dvs. 10x Genomics Chromium-plattform). Bruk omtrent 20 000 celler per prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denne protokollen oppnådde vi vellykket isolering og dissosiasjon av hele tarmen fra 5 dpf larver. Ved å bruke papain som dissosiasjonsenzym, forbedret vi signifikant cellens levedyktighet, noe som muliggjorde fangst av 46 139 hendelser som involverte enkle, levedyktige celler (6, 4% av alle celler) ut av 244 isolerte tarmer (figur 2A). Wildtype hele larver ble brukt som en kontroll for å sikre at sorteringsprosessen ble optimalisert, noe som muliggjorde effektiv celleidentifikasjon og sortering. Hele larver kan brukes da vi bare sorterer etter levende, enkeltceller (tilleggsfigur S1B-E). Alle sorterte tarmceller ble deretter sendt til scRNA seq-plattformen. Totalt ble 9 858 celler sekvensert med gjennomsnittsavlesninger per celle på 21 106. For scRNA-seq-analyse brukte vi Seurat V317. Totalt ble 48 klynger identifisert som representerte 12 forskjellige celletyper, inkludert epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller, samt enteriske nevroner og glia18.
Figur 1: Eksperimentelt design for encellet RNA-sekvensering av isolert sebrafisktarm. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; scRNA-seq = encellet RNA-sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi for å sortere levende, enkeltceller fra sebrafisktarmen. (A) Post sorteringsanalyse med FCS / SSC størrelse gating. (B) Dublett diskriminering. (C) Levende/døde celler og sortert populasjon. (D) Phox2bb: GFP + celler som finnes i den sorterte levende populasjonen. I hvert panel vises prosentandelen av inngjerdede celler. Forkortelser: FCS-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; GFP = grønt fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Tarmisolering og gatingstrategi for å sortere levende, enkeltceller fra hele villtype sebrafisklarver. (A) Brightfield-bilde av tarmisolasjon fra 5 dager etter befruktning sebrafisklarver. Den røde linjen angir disseksjonslinjen. (B) Post-sort analyse, som viser alle celler med FCS / SSC størrelse gating. (C) Singlet utvalg. (D) DAPI-gating. (E) Phox2bb: GFP + gating. Prosentandelen av inngjerdede celler vises i hvert panel. Forkortelser: FCS-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; GFP = grønt fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en metode for isolering og dissosiasjon av tarmen hos 5 dpf sebrafisklarver ved bruk av FACS. Med denne metoden ble forskjellige tarmcelletyper vellykket samlet og analysert av scRNA-seq, ved hjelp av 10x Genomics Chromium-plattformen. Vi valgte tg(phox2bb:GFP)-sebrafisklinjen, da vi ønsket en indikasjon på at levedyktige ENS-celler også ville være isolerte (figur 2D). Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden lett kan utvides til andre sebrafisklinjer av interesse, da vi bare brukte phox2bb-gating for å vurdere nevronal levedyktighet, og ikke å velge for en bestemt cellepopulasjon. Siden vi bestemte oss for å bruke en objektiv tilnærming for å samle alle tarmceller som er tilstede ved 5 dpf, er sorteringskriteriet først og fremst avhengig av å identifisere levende, individuelle celler. Dette er også årsaken bak bruken av hele larver for å etablere en pålitelig og konsistent gatingstrategi. Med tanke på arbeidet som er involvert i å isolere individuelle tarmer, blir det upraktisk å isolere flere tarmer for å tjene som en negativ kontroll, innenfor den gitte tidsrammen for dette eksperimentet. Derfor, mens vi erkjenner at celletyper fra hele larver skiller seg fra de som finnes i tarmen, og til og med forskjellige dissosiasjonsmetoder ble brukt, er det bemerkelsesverdig at gating-strategien som brukes til å sortere tarmceller, i utgangspunktet kan valideres ved hjelp av hele larver, da vi bare var interessert i å vurdere cellenes levedyktighet.
For å utføre scRNA-seq, vil et kritisk trinn i denne protokollen være å isolere et tilstrekkelig antall levedyktige celler (~ 20.000 celler). Samtidig bør tiden for tarmisolering holdes så kort som mulig for å unngå en skadelig effekt på cellens levedyktighet. Tidligere rapporter med fokus på sebrafisk larver tarmer ansatt accutase eller trypsin for celle dissosiasjon 19,20,21. Imidlertid, mens begge dissosiasjonsenzymer var i stand til å isolere nok levedyktige celler for scRNA-seq, tillot accutase ikke fangst av enteriske nevronceller19,20. Trypsin fanget imidlertid overveiende epitelceller, noe som bare ga et lavt antall enteriske nevronceller21. Papain er anerkjent for sin mildhet, noe som kan være spesielt gunstig for å bevare enterisk nevronintegritet22. Våre resultater viste at papain faktisk er effektiv for å opprettholde levedyktigheten til nevronceller, og bekrefter tidligere applikasjoner der dette enzymet ble brukt til å fordøye sebrafisk voksen retina og hjerne23,24. Det er imidlertid bemerkelsesverdig å nevne at selv med papain, var cellens levedyktighet etter tarmisolasjon og dissosiasjon bare 6,4%. Dette antyder at det påfølgende FACS-trinnet dermed er avgjørende å velge for levedyktige celler. Slike resultater kan betraktes som en begrensning, spesielt når det gjelder knappe og utfordrende å fange celler av interesse.
Fremtidige studier bør fokusere på nye dissosiasjonsmetoder for å forbedre cellens levedyktighet under isolasjonsprotokollen. Når den er økt, blir denne metoden mulig å sortere ut reporter-positive celler og utføre scRNA-seq på spesifikke tarmcelletyper. Ikke desto mindre tillater metoden som presenteres her fangst av nok levedyktige celler for etterfølgende identifisering av forskjellige celletyper i tarmen, for eksempel epitel, stromal, blod, muskel, immunceller og til og med enteriske nevroner og glia, som ikke har blitt fanget før på dette cellestadiet ved hjelp av lignende tilnærminger. Siden evnen til å isolere og analysere disse forskjellige celletypene er avgjørende for å få mer innsikt i GI-utvikling og dysfunksjon, anser vi denne metoden for å være spesielt verdifull, da den gir en pålitelig tilnærming til å studere tarmsammensetning ved hjelp av sebrafisk, som modellorganisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av venner av Sophia Foundation (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
