Summary
Här beskriver vi en metod för tarmisolering från zebrafisklarver 5 dagar efter befruktning, för encellig RNA-sekvenseringsanalys.
Abstract
Mag-tarmkanalen (GI) utför en rad funktioner som är viktiga för livet. Medfödda defekter som påverkar dess utveckling kan leda till enteriska neuromuskulära störningar, vilket understryker vikten av att förstå de molekylära mekanismerna bakom GI-utveckling och dysfunktion. I denna studie presenterar vi en metod för tarmisolering från zebrafisklarver 5 dagar efter befruktning för att få levande, livskraftiga celler som kan användas för encells-RNA-sekvensering (scRNA-seq) analys. Detta protokoll är baserat på manuell dissektion av zebrafiskens tarmar, följt av enzymatisk dissociation med papain. Därefter underkastas cellerna fluorescensaktiverad cellsortering, och livsdugliga celler samlas in för scRNA-seq. Med denna metod kunde vi framgångsrikt identifiera olika celltyper i tarmen, inklusive epitel-, stroma-, blod-, muskel- och immunceller, samt enteriska nervceller och gliaceller. Därför anser vi att det är en värdefull resurs för att studera mag-tarmkanalens sammansättning vid hälsa och sjukdom, med hjälp av zebrafisken.
Introduction
Mag-tarmkanalen (GI) är ett komplext system som spelar en viktig roll för den allmänna hälsan och välbefinnandet. Det är ansvarigt för matsmältningen och absorptionen av näringsämnen samt eliminering av avfallsprodukter 1,2. Mag-tarmkanalen består av flera celltyper, inklusive epitelceller, glatta muskelceller, immunceller och det enteriska nervsystemet (ENS), som kommunicerar nära varandra för att reglera och upprätthålla korrekt tarmfunktion 3,4,5. Defekter i utvecklingen av mag-tarmkanalen kan ha långtgående effekter på olika aspekter såsom näringsupptag, mikrobiotasammansättning, tarm-hjärna-axeln och ENS, vilket leder till flera enteriska neuromuskulära sjukdomar, såsom Hirschsprungs sjukdom och kronisk intestinal pseudoobstruktion 6,7. Dessa sjukdomar kännetecknas av allvarlig tarmdysmotilitet orsakad av förändringar i olika nyckelceller, såsom de interstitiella cellerna i Cajal, glatta muskelceller och ENS 6,8,9. De molekylära mekanismerna bakom GI-utveckling och dysfunktion är dock fortfarande dåligt kända.
Zebrafisken är en värdefull modellorganism för att studera utveckling och dysfunktion av mag-tarmkanalen på grund av dess snabba embryonala utveckling, transparens under embryonala och larvstadier och genetisk spårbarhet 10,11,12,13,14. Det finns ett stort antal transgena zebrafisklinjer som uttrycker fluorescerande proteiner. Ett exempel på en sådan linje är tg(phox2bb:GFP) zebrafisken, som vanligtvis används för att studera ENS, eftersom alla phox2bb+-celler, inklusive enteriska neuroner, är märkta15,16. Här, med hjälp av tg(phox2bb:GFP) zebrafisklinjen, presenterar vi en metod för tarmisolering av 5 dagar efter befruktning (dpf) larver för encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) analys (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All uppfödning och alla experiment med zebrafiskar utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna i Erasmus MC och djurskyddslagstiftningen. Användningen av zebrafisklarver 5 dagar efter befruktning faller under kategorin experiment som inte kräver formellt etiskt godkännande, enligt de nederländska bestämmelserna.
1. Erhållande 5 dagar efter befruktning (dpf) vildtyp och tg (phox2bb: GFP) larver
- Sätt upp uppfödning av vildtypszebrafiskar och samla in 50 ägg i HEPES-buffrat E3-medium (nedan kallat E3) i en 15 cm petriskål. Använd dessa fiskar som en negativ kontroll för fluorescensaktiverad cellsortering (FAC).
- Sätt upp uppfödning av tg(phox2bb:GFP) zebrafiskar och samla in cirka 300 ägg i E3 i en 15 cm petriskål.
- Förvara befruktade ägg i E3 (max 50 ägg/skål) under en 14 timmar/10 timmars ljus/mörk cykel, i en inkubator vid 28,5 °C.
- Vid 1 dpf, ta bort obefruktade ägg och låt de befruktade utvecklas till 5 dpf.
- Välj tg(phox2bb:GFP) larver vid 1 dpf.
2. Dissociation av hela larver av vildtyp
- Bedöva 5 dpf-larver med 0,016% trikain.
- Hacka 30 zebrafiskar i små bitar med hjälp av ett rakblad i en petriskål som innehåller 1 ml 10x trypsin-EDTA-lösning.
- Överför den hackade zebrafisken till ett mikrocentrifugrör med en total volym på 2 ml 10x trypsin-EDTA-lösning och låt den ligga på is i 3 timmar. Pipettera upp och ner med en P1000-pipett varje timme för att stimulera dissociation.
3. Isolering av tarmen
- Placera 6-10 5 dpf-larver bedövade med 0,016 % trikain i rad, på en 1,8 % agarosplatta (0,45 g agaros i 25 ml E3), under ett dissektionsmikroskop
- Sätt en insektsnål i huvudet på zebrafisken.
- Ta bort all återstående E3 med en servett.
- Isolera tarmen med hjälp av en annan insektsnål, utan att störa några andra organ. Se till att äggulan är borttagen (tilläggsfigur S1A).
- När du har isolerat, inspektera tarmen och ta bort allt icke-tarmmaterial (t.ex. hud, fett, lever) om det behövs.
- Samla upp tarmen med en pincett och placera den i ett mikrocentrifugrör, innehållande fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med 10 % fetalt kalvserum (FCS), på is.
OBS: Minst 244 tarmar bör isoleras, med den totala dissektionstiden på 3 timmar. Detta är möjligt med två personer som arbetar parallellt.
4. Dissociation av tarmen
- Omedelbart efter dissektionen av alla tarmar, centrifugera mikrocentrifugröret med full hastighet (13 800 × g) i 30 s.
- Ta bort PBS/10% FCS men lämna en liten mängd (~100 μL) för att förhindra att tarmarna torkar ut. Tillsätt 500 μl 2,17 mg/ml papain i HBSS innehållande CaCl2 och MgCl2 för att dissociera celler.
- Aktivera papain med 2,5 μL cystein (1 M).
- Inkubera tarmarna i ett vattenbad vid 37 °C i 10 min. Pipettera upp och ner halvvägs (efter 5 minuter) för att stimulera enzymatisk vävnadssmältning.
- Överför cellerna till ett FACS-rör med hjälp av en 35 μm cellsil, förfuktad med 0,5 ml PBS/10 % FCS.
- Tvätta silen genom att tillsätta totalt 2 ml PBS/10 % FCS i steg om 0,5 ml.
- Centrifugera vid 700 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 μl PBS/10 % FCS.
- Tillsätt 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för att märka döda blodkroppar (1:1 000) och inkubera i 5 minuter så att de utesluts under FACS.
5. FACS-berikning
- Använd vildtypsprovet för att ställa in grindarna för den sorterade cellpopulationen genom att registrera 3 000 celler på flödescytometern (tilläggsfigur S1B-E).
- Använd ett 100 μm munstycke, ställ in sorteringsprecisionen på renhet och lägg uppsamlingsröret som innehåller 200 μL PBS/5 % FCS i FACS-maskinen.
- Ladda tarmens cellsuspension och sortera levande (DAPI-negativa), enskilda celler i uppsamlingsröret (figur 2C) genom att utesluta dubbletter (figur 2B) och döda celler (figur 2C).
OBS: För tg(phox2bb) zebrafisken kontrolleras andelen GFP+ -celler endast som referens, eftersom alla enskilda levande celler sorteras. - Håll uppsamlingsröret på is efter cellsortering.
- Räkna cellsuspensionen med en hemocytometer, inklusive en viabilitetskontroll med trypanblått. Om lönsamheten är minst 80 %, fortsätt med nästa steg.
- Cellerna är nu redo att bearbetas för scRNAseq (dvs. 10x Genomics Chromium-plattformen). Använd cirka 20 000 celler per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med detta protokoll uppnådde vi framgångsrik isolering och dissociation av hela tarmar från 5 dpf-larver. Genom att använda papain som dissociationsenzym förbättrade vi cellviabiliteten avsevärt, vilket gjorde det möjligt att fånga 46 139 händelser som involverade enstaka, livskraftiga celler (6,4 % av alla celler) av 244 isolerade tarmar (Figur 2A). Hela larver av vildtyp användes som kontroll för att säkerställa att sorteringsprocessen optimerades, vilket möjliggjorde effektiv cellidentifiering och sortering. Hela larver skulle kunna användas eftersom vi bara sorterar efter levande, enstaka celler (tilläggsfigur S1B-E). Alla sorterade tarmceller skickades sedan in till scRNA seq-plattformen. Totalt sekvenserades 9 858 celler med ett medelvärde på 21 106 läsningar per cell. För scRNA-seq-analys använde vi Seurat V317. Totalt identifierades 48 kluster som representerade 12 olika celltyper, inklusive epitel-, stroma-, blod-, muskel- och immunceller, samt enteriska neuroner och glia18.
Figur 1: Experimentell design för encells-RNA-sekvensering av isolerade zebrafisktarmar. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; scRNA-seq = encells-RNA-sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Grindstrategi för att sortera levande, enskilda celler från zebrafiskens tarm. (A) Eftersorteringsanalys med FCS/SSC-storleksgating. (B) Dubbel diskriminering. C) Levande/döda celler och sorterad population. (D) Phox2bb:GFP+-celler som finns i den sorterade levande populationen. I varje panel visas procentandelen grindade celler. Förkortningar: FCS-A = framåtriktad spridningstoppare; SSC-A = sidospridningstoppsarea; FSC-H = höjd framåtriktad spridningstopp, GFP = grönt fluorescerande protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Tarmisolering och grindstrategi för att sortera levande, enskilda celler från hela zebrafisklarver av vildtyp. (A) Ljusfältsbild av tarmisolering från 5 dagar efter befruktning zebrafisklarver. Den röda linjen indikerar dissektionslinjen. (B) Eftersorteringsanalys, som visar alla celler med FCS/SSC-storlek. (C) Val av singlett. D) DAPI-gating. (E) Phox2bb:GFP+ gating. Procentandelen grindade celler visas i varje panel. Förkortningar: FCS-A = framåtriktad spridningstoppare; SSC-A = sidospridningstoppsarea; FSC-H = höjd framåtriktad spridningstopp, GFP = grönt fluorescerande protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metod för isolering och dissociation av tarmen hos 5 dpf zebrafisklarver med hjälp av FACS. Med denna metod har olika tarmcelltyper framgångsrikt samlats in och analyserats med scRNA-seq, med hjälp av 10x Genomics Chromium-plattformen. Vi valde tg(phox2bb:GFP) zebrafisklinjen, eftersom vi ville ha en indikation på att livskraftiga ENS-celler också skulle isoleras (Figur 2D). Det är dock viktigt att notera att denna metod lätt kan utvidgas till andra zebrafisklinjer av intresse, eftersom vi bara använde phox2bb-grinden för att bedöma neuronal livskraft, och inte för att selektera för en specifik cellpopulation. Eftersom vi bestämde oss för att använda ett opartiskt tillvägagångssätt för att samla in alla tarmceller som finns vid 5 dpf, hänger sorteringskriteriet främst på att identifiera levande, enskilda celler. Detta är också anledningen till att man använder hela larver för att skapa en pålitlig och konsekvent grindstrategi. Med tanke på det arbete som krävs för att isolera enskilda tarmar blir det opraktiskt att isolera fler tarmar för att fungera som en negativ kontroll, inom den givna tidsramen för detta experiment. Därför, även om vi erkänner att celltyper från hela larver skiljer sig från de som finns i tarmen, och till och med distinkta dissociationsmetoder användes, är det anmärkningsvärt att den grindstrategi som tillämpas för att sortera tarmceller initialt kan valideras med hjälp av hela larver, eftersom vi bara var intresserade av att bedöma cellviabilitet.
För att utföra scRNA-seq skulle ett kritiskt steg i detta protokoll vara att isolera ett tillräckligt antal livskraftiga celler (~20 000 celler). Samtidigt bör tiden för tarmisolering hållas så kort som möjligt för att undvika en skadlig effekt på cellviabiliteten. Tidigare rapporter med fokus på zebrafisklarver använde accutas eller trypsin för celldissociation 19,20,21. Men medan båda dissociationsenzymerna kunde isolera tillräckligt många livskraftiga celler för scRNA-seq, tillät accutase inte infångning av enteriska neuronala celler19,20. Trypsin fångade dock främst epitelceller, vilket endast gav ett lågt antal enteriska neuronala celler21. Papain är allmänt känd för sin mildhet, vilket kan vara särskilt fördelaktigt för att bevara enterisk neuronal integritet22. Våra resultat visade att papain verkligen är effektivt för att upprätthålla livskraften hos neuronala celler, vilket bekräftar tidigare tillämpningar där detta enzym användes för att smälta zebrafiskars vuxna näthinna och hjärna23,24. Det är dock värt att nämna att även med papain var cellviabiliteten efter tarmisolering och dissociation endast 6,4 %. Detta tyder på att det efterföljande FACS-steget därför är avgörande för att selektera för livskraftiga celler. Sådana resultat kan betraktas som en begränsning, särskilt när det handlar om sällsynta och utmanande att fånga celler av intresse.
Framtida studier bör fokusera på nya dissociationsmetoder för att förbättra cellviabiliteten under isoleringsprotokollet. När denna metod väl har ökats blir den möjlig för att sortera ut reporterpositiva celler och utföra scRNA-seq på specifika tarmcelltyper. Icke desto mindre gör metoden som presenteras här det möjligt att fånga tillräckligt med livskraftiga celler för efterföljande identifiering av olika celltyper i tarmen, såsom epitel-, stroma-, blod-, muskel-, immunceller och till och med enteriska neuroner och glia, som inte har fångats tidigare i detta cellstadium med liknande metoder. Eftersom förmågan att isolera och analysera dessa olika celltyper är avgörande för att få mer insikt i GI-utveckling och dysfunktion, anser vi att denna metod är särskilt värdefull, eftersom den ger ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att studera tarmsammansättning med zebrafisken som modellorganism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Sophia Foundations vänner (SSWO WAR-63).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al.
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al.
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
