Questo protocollo video illustra un metodo per la generazione di transgenico<em> Xenopus laevis</em> Da introduzione di transgeni in nuclei degli spermatozoi seguita da trapianto nucleare in uova non fecondate.
Integrazione stabile dei prodotti gene clonato nel genoma Xenopus è necessario controllare il tempo e il luogo di espressione, di esprimere i geni in fasi successive dello sviluppo embrionale, e di definire come esaltatori e promotori regolare l'espressione genica all'interno dell'embrione. Il protocollo ha dimostrato qui può essere usata per produrre in modo efficiente gli embrioni transgenici Xenopus laevis. Questo approccio transgenesi coinvolge tre parti: 1. Nuclei degli spermatozoi sono isolati da adulti X. testicolo laevis da un trattamento con lisolecitina, che permeabilizes la membrana plasmatica degli spermatozoi. 2. Estratto di uovo viene preparato mediante centrifugazione a bassa velocità, l'aggiunta di calcio a causare l'estratto per passare al interfase del ciclo cellulare, e una centrifugazione ad alta velocità per isolare citosol interfase. 3. Trapianto nucleare: i nuclei ed estrarre sono combinati con il DNA plasmidico linearizzato per essere introdotto come il transgene e una piccola quantità di enzima di restrizione. Durante una reazione di breve, estratto di uovo decondenses parzialmente la cromatina spermatica e l'enzima di restrizione genera rotture cromosomiche che promuovono ricombinazione del transgene nel genoma. I nuclei degli spermatozoi trattati vengono poi trapiantate in uova non fecondate. L'integrazione del transgene avviene di solito prima della scissione primo embrionale in modo tale che gli embrioni risultanti non sono chimerici. Questi embrioni possono essere analizzati senza necessità di allevare alla prossima generazione, permettendo per la generazione efficiente e rapido di embrioni transgenici per la ricerca di promotore e funzione del gene. Adulti X. laevis risultante da questa procedura anche propagare il transgene attraverso la linea germinale e può essere utilizzato per generare linee di animali transgenici ai fini multipli.
Per ciascun costrutto transgenico da testare, in genere trapianto nuclei in 500-1000 uova; a questa scala, possiamo generare embrioni transgenici che esprimono fino a 10 diversi costrutti al giorno, a seconda di quante donne sono indotte a deporre le uova. Di questi trapianti, circa un terzo dei fendere uova e 60-80% di questi embrioni scissione procedere attraverso gastrulazione normalmente. A seconda delle condizioni di reazione utilizzate, tra 10-50% di questi embrioni esprimono il transgene di interesse. Pertanto, u…
The authors have nothing to disclose.
Finanziamenti per il nostro lavoro è fornito dalla NIH, il March of Dimes, e l'American Cancer Society.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)