Это видео демонстрирует протокол метод для создания трансгенных<em> Xenopus laevis</em> Путем внедрения трансгенов в ядрах сперматозоидов следуют ядерной трансплантации в неоплодотворенные яйца.
Стабильная интеграция продуктов клонированных генов в геноме Xenopus необходимо контролировать время и место выражения, чтобы выразить гены на более поздних стадиях эмбрионального развития, и определить, как усилители и промоутеров регулируют экспрессию генов в эмбрион. Протокол продемонстрировали здесь может быть использован для эффективного получения трансгенных Xenopus laevis эмбрионов. Этот подход включает в себя трансгенез трех частей: 1. Сперма ядер изолированы от взрослых X. laevis яичка обработкой лизолецитин, который permeabilizes спермы плазматической мембране. 2. Яйцо экстракт готовится низкой скорости центрифугирования, добавление кальция вызывает экстракт для перехода к интерфазе клеточного цикла, а также высокоскоростным центрифугированием, чтобы изолировать межфазной цитозоле. 3. Ядерной трансплантации: ядер и экстракта в сочетании с линеаризованной плазмидой ДНК, чтобы вводить в качестве трансгенов и небольшое количество фермента рестрикции. Во время короткой реакции, яичный экстракт частично decondenses спермы хроматина и рестрикции генерирует хромосомных разрывов, которые способствуют рекомбинации трансгенов в геном. Лечение спермы ядер затем пересаживают в неоплодотворенные яйца. Интеграция трансгенов обычно происходит до первого эмбрионального расщепления, что в результате эмбрионы не являются химерные. Эти эмбрионы могут быть проанализированы без необходимости разводить для следующего поколения, что позволяет для эффективного и быстрого поколение трансгенных эмбрионов для анализа промоутер и функции гена. Взрослый X. laevis в результате этой процедуры также распространяются через трансгенов зародышевой линии и может быть использован для создания линии трансгенных животных для различных целей.
Для каждого трансгенного построить для тестирования, мы, как правило пересадки ядер в 500-1000 яиц, в этом масштабе, мы можем создать трансгенных эмбрионов выражении до 10 различных конструкций в сутки, в зависимости от того, сколько женщин индуцированные чтобы отложить яйца. Из этих трансп?…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование для нашей работы обеспечивается NIH, март Dimes, и американского Общества рака.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)