إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Summary

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا

Abstract

التكامل مستقرة من المنتجات الجينات المستنسخة في جينوم القيطم هو ضروري للتحكم في الزمان والمكان والتعبير ، والتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني ، وتحديد مدى القدرة على تنظيم والمروجين التعبير الجيني داخل الجنين. ويمكن استخدام بروتوكول تظاهر هنا لتنتج بكفاءة الأجنة وراثيا القيطم المورق. هذا النهج ينطوي على transgenesis ثلاثة أجزاء : 1. يتم عزل الحيوانات المنوية من نوى عاشرا الكبار خصية المورق عن طريق العلاج مع lysolecithin التي permeabilizes غشاء البلازما المنوية. 2. مستعدة استخراج البيض بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة ، إضافة إلى الكالسيوم يؤدي إلى التقدم إلى استخراج الطور البيني من دورة الخلية ، والطرد المركزي بسرعة عالية لعزل الطور البيني العصارة الخلوية. 3. يتم الجمع بين النواة واستخراج الحمض النووي مع البلازميد الخطي لتكون كما قدم التحوير وكمية صغيرة من انزيم التقييد : زرع النووية. خلال رد فعل قصير ، استخراج البيض decondenses جزئيا لونين الحيوانات المنوية وانزيم يكسر قيود يولد الكروموسومات التي تشجع على إعادة التركيب من التحوير في جينوم. ثم يتم زرع نواة الحيوان المنوي في علاج بويضة غير مخصبة. التكامل بين التحوير وعادة ما يحدث قبل الانقسام والجنينية الأولى من نوعها أن الأجنة الناتجة ليست خيالية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون أي حاجة لتربية للجيل القادم ، والسماح لجيل فعال وسريع من الأجنة وراثيا للتحليلات المروج وظيفة الجين. عاشرا الكبار المورق الناتجة عن هذا الإجراء نشر أيضا عن طريق التحوير germline ويمكن استخدامها لتوليد حيوانات معدلة وراثيا خطوط لأغراض متعددة.

Protocol

وقد وصفت في البداية نسخ معدلة من هذا النهج transgenesis في ¹ و ^2.

A. إعداد الحيوانات المنوية النوى

ويتم تكييف هذا الأسلوب من إعداد نواة موراي ³ ، ولكن تم حذف مثبطات الأنزيم البروتيني لأنها تتداخل مع التطور اللاحق للزرع البويضات مع الحيوانات المنوية النوى. وتجمد Aliquots عند درجة -80 ويمكن أن تستخدم لزرع ما يقرب من 6 أشهر.

وينبغي إعداد جميع الحلول ووضعها على الجليد قبل بدء التحضير.

1. تخدير 1-2 الذكور البالغين X. المورق عن طريق الغمر في Tricaine مدة لا تقل عن 20 دقيقة تليها بخع ، وإزالة الخصيتين.
2. لفة الخصيتين على منشفة ورقية لإزالة الدم ، والأوعية الدموية والدهون في الجسم ، وغسل منهم لفترة وجيزة في طبق بتري 60 ملم تحتوي على 1XMMR ، وإزالة أي قطعة إضافية من الدهون في الجسم. الحرص على عدم ثقب الخصيتين ، حيث أن هذه النشرات الحيوانات المنوية.
3. نقل الخصيتين إلى طبق بيتري الجافة من عيار 60 ملم والخصيتين أضعف بالملقط حتى لا توجد أجزاء مرئية. وينبغي أن يتم النقع على أكمل وجه ممكن للحصول على عوائد عالية من النوى.
4. إضافة 2mLs الباردة العازلة إعداد النووي (NPB ؛ 1X من المخزون) إلى أضعف وماصة بلطف صعودا وهبوطا.
5. بخ أضعف من خلال حوالي 4 سمك القماش القطني على القمع ، وجمع في أنبوب 15 مل (مثل فالكون 2059) ؛ شطف الطبق مع 8mLs من NPB ووضع هذا شطف من خلال القماش القطني ، وجمع في الأنبوب. بأيد القفاز ضغط على القماش القطني لجمع السائل المتبقي في الأنبوب.
6. بيليه الحيوانات المنوية عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. في 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح (1480g على سبيل المثال في الدوار HB - 4 Sorvall أو ما يعادلها) مع محولات أنبوب المناسب. صب طاف ؛ إضافة إلى NPB 8mL هذا الأنبوب وماصة صعودا وهبوطا مع 10 مل ماصة لتكوير resuspend ؛ سبين أسفل مرة أخرى كما طاف أعلاه وصب. يوازن 1mL من NPB إلى درجة حرارة الغرفة خلال زيادة ونقصان.
7. Resuspend بيليه في غرفة 1mL NPB درجة الحرارة باستخدام 1 مل pipetteman الطرف ، إضافة 50μl من lysolecithin 10mg/mL الطازجة ، مزيج بلطف ، واحتضان لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة.
8. إضافة 10 مل BSA 1XNPB الباردة +3 ٪ في أنبوب لمنع رد الفعل lysolecithin ، مزيج بلطف ، وتدور باستمرار لمدة 10 دقيقة في 3000 دورة في الدقيقة في الدوار الدلو المتأرجح. صب طاف. الكرية lysolecithin المعالجة ينبغي أن ننظر قليلا أكثر شفافة (أبيض أقل غموضا) مما كان عليه قبل العلاج lysolecithin.
9. صب المزيج وطاف resuspend بيليه في 5 مل BSA NPB الباردة +0.3 ٪ ، بلطف مع ماصة 10 مل وتدور باستمرار لمدة 10 دقيقة في 3000rpm على النحو الوارد أعلاه.
10. صب وطاف بيليه resuspend في 500μl العازلة للتخزين ونقل الحيوانات المنوية إلى أنبوب مل 1.5. هذا هو المخزون الخاص بك النوى الآن. متجر على الجليد أثناء التحقق من العائد من النوى.
11. للتحقق من محصول النوى ، ومكان 98 ميكرولتر من العازلة تخفيف الحيوانات المنوية (SDB) ، 1 ميكرولتر من المخزون النووي و1μl من 1:100 التخفيف من المخزون هويشت في أنبوب إيبندورف 1.5mL. مزيج المخزون النووي بشكل جيد للغاية باستخدام أسلاك شائكة قص طرف ماصة (أو كبيرة فتح) قبل إزالة ميكرولتر 1. مزيج SDB المخفف / هويشت / النوى بشكل جيد للغاية ويسمح لكمية صغيرة في التدفق الى داخل القاعة لعدادة الكريات نويباور تحسن عمل شعري. عدد النوى في مربع من عدادة الكريات تحت المجهر المركب. من الذكور ، ويجب الحصول على التهم ما لا يقل عن 100-200 (X10 ⁴ خلايا / مل) لهذا التخفيف 1:100 من المخزون لتركيز الأسهم مخفف من الخلايا ⁵ 1 - 2X10 / ميكرولتر. إذا كان لديك مخزون أقل تركيزا ، والسماح للتسوية نواة لعدة ساعات ، وإزالة بعض طاف ، والفرز. ترك نواة في 4 درجات مئوية خلال الليل للسماح لاختراق الجلسرين لتحسين الحفظ بالتبريد ؛ المزيج ثم المخزون النووي بشكل جيد مع تلميح ماصة فوهة واسعة ، وإعداد aliquots 20μl ، والتجميد في النيتروجين السائل.

باء إعداد مستخلصات سرعة عالية

ويتم تكييف هذا الأسلوب من موراي ⁽³⁾ وينتج استخراج عصاري خلوي الطور البيني التي من شأنها تعزيز تورم وجزئية decondensation لونين من نواة الحيوان المنوي المضافة. ويمكن استخراج المجمدة في aliquots صغيرة في -80 درجة مئوية وإذابة قبل الاستخدام.

1. 3-5 أيام قبل حقن HCG ، رئيس 8-12 البالغات X. المورق من خلال ضخ 50 يو PMSG في كيس الليمفاوية الظهرية. في المساء قبل إعداد استخراج ، وضخ كل ضفدع مع 500 وحدة قوات حرس السواحل الهايتية ومكان الضفادع 2 / حاوية في 1XMMR 2 لتر. منذ عام واحد مع الضفدع lysing أو تفعيل البيض يمكن أن ينال من إعداد استخراج ، فإنه من المستحسن أن الضفادع إلى أزواج منفصلة عن الإباضة.
2. في صباح اليوم التالي ، وإعداد والبرد كل الحلول قبل بدء التحضير. بلطف ، وطرد البيض يدويا من كل ضفدع كبير في بeakers تحتوي 1X MMR. شاشة البيض من كل حاوية ، وحذف أي دفعات من البيض مع علامات lysing ، أو التبقيع التنشيط (المرئية التي تصبغ انكماش في نصف الكرة الحيواني) من هذا الإجراء. جمع البيض متواصلة مع تصبغ حتى. ويمكن أيضا أن تكون جيدة البيض التي تم جمعها من MMR 1X في الدلاء الضفادع. وينبغي أن إجمالي حجم البيض يكون> ​​100 مل من الإناث 8-12.
3. دي هلام البيض. للقيام بذلك ، إزالة MMR قدر الإمكان ، إضافة كمية صغيرة من محلول السيستين ، ودوامة البيض. استبدال حل السيستين جديدة عدة مرات خلال اجتثاث jellying. دي هلام كل دفعة من البيض بشكل منفصل وتجاهل دفعات مع الكسر أو تنشيط البويضة. الجمع بين ما تبقى من البيض.
4. غسل البيض أربع مرات في 35 مل من ~ العازلة استخراج (الميزانية) ، ثم مرتين في 25 مل من CSF - الخارجة مع مثبطات الأنزيم البروتيني.
5. لحزمة البيض : البيض في نقل أنابيب ultraclear بيكمان. السماح للبيض لتسوية. إزالة أكبر قدر - CSF الخارجة ممكن. الطرد المركزي البيض باستخدام SW بيكمان 40 تي الدوار (أو الدوار مماثلة) في 1000 دورة في الدقيقة (150g) لثوانى 60 ~ في 4 درجات مئوية. الحل إزالة الفائض من الجزء العلوي من البيض معبأة.
6. لسحق البيض وتوليد هيولي استخراج : الطرد المركزي البيض في 10000 دورة في الدقيقة (16،000 ز) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. ينبغي للبيض منفصلة في ثلاث طبقات : دهن (العلوي) ، السيتوبلازم (في الوسط) ، وصفار (القاع). جمع طبقة هيولي من كل أنبوب مع إبرة عيار 18 عن طريق إدخال الإبرة من خلال أنبوب في قاعدة طبقة هيولي. نقل السيتوبلازم لأنبوب جديد بيكمان ultraclear على الجليد.
7. إضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني السيتوبلازم معزولة إلى التركيز النهائي لل1X. Recentrifuge السيتوبلازم على 16000 ز لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع السيتوبلازم توضيح كما هو موضح أعلاه. نتوقع الحصول على ،75-1 السيتوبلازم مل / الضفادع.
8. إضافة 1 / 20 من حجم استخراج من خليط الطاقة في العينة. نقل السيتوبلازم في أنابيب البولي ذات الجدران السميكة للنابذة فائقة السرعة بيكمان TL - 100. عقد أنابيب حوالي 3 مل لكل وينبغي أن لا يقل عن نصف الكامل.
9. إضافة 1 م ₂ CaCl إلى كل أنبوب إلى تركيز النهائي من 0.4 مم. احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هذا يعطل CSF ويدفع إلى استخراج الطور البيني.
10. التوازن أنابيب الطرد المركزي ومنها في نابذة فائقة السرعة بيكمان TL - 100 - 100.3 باستخدام TLA الدوار في 70000 دورة في الدقيقة (200000 ز) مقابل 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. والسيتوبلازم يجزئ إلى أربع طبقات ، من أعلى إلى أسفل : الدهون ، العصارة الخلوية ، غشاء / الميتوكوندريا ، والجليكوجين / ريبوسوم.
11. إزالة الطبقة عصاري خلوي من كل أنبوب (~ 1 مل إذا تم تحميلها 2-3 مل في أنبوب) عن طريق إدراج حقنة في الجزء العلوي من أنبوب من خلال طبقة الدهون. نقل جزء عصاري خلوي لأنابيب جديدة وrecentrifuge العينات في 70000 دورة في الدقيقة (200000 ز) لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
12. قسامة وطاف في 25 ميكرولتر aliquots في 0.5 مل من الأنابيب. سريع تجميد aliquots في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لتحديد ما إذا كان استخراج فعال ، يمكن حضنت نواة الحيوان المنوي في استخراج وملطخة هويشت لتحديد ما إذا نوى تضخم بشكل واضح (رشاقته وإطالة) في غضون 10 دقيقة من إضافة في درجة حرارة الغرفة.

رد فعل جيم Transgenesis ونقل النووي

هام : تأكد من أن الحلول والمعدات والضفادع كلها جاهزة قبل بداية رد فعل. بمجرد أن تبدأ ، يجب المضي قدما في التفاعل باستخدام جدول زمني تقريبي هو موضح أدناه ، لأن العديد من مكونات لا تبقى ثابتة لمدة 30 دقيقة>. في حين يتم الاحتفاظ الأسهم نواة الحيوان المنوي على الجليد ، يجب أن تبقى ردود الفعل transgenesis (سواء مخففة ومركزة) في درجة حرارة الغرفة.

1. إناث الضفادع الوزراء. في المساء قبل transgenesis ، وضخ عدة (3-5) الضفدع الإناث البالغات مع 800 وحدة HCG في كيس الليمفاوية الظهرية للحصول على البيض الطازج وضعت بداية في اليوم التالي.
2. في يوم من إجراء transgenesis ، وإعداد أو تقديمهم إلى درجة حرارة الحلول اللازمة لtransgenesis :
   1. الطازجة السيستين (2.5 ٪ في 1XMMR ، pH8.0). ستحتاج عدة مئات من ملليلتر لاستخدامها في ذلك اليوم.
   2. 0.2XMMR Ficoll +6 ٪ للأطباق وزرع الأجنة وراثيا الانتعاش و0.2XMMR +100 ميكروغرام / مل جنتاميسين (بدون Ficoll) لجمع الأجنة. وينبغي أن الحلول لن تكون أكثر دفئا من 18-21 يجب رفع درجة مئوية ، والأجنة وراثيا من خلال الانشقاقات المبكرة في درجات حرارة تتراوح بين 16 و 21 درجة مئوية ، لأن ارتفاع درجات الحرارة يؤثر سلبا على كل من تواتر transgenesis والتطور الجنيني.
   3. ذوبان الجليد ويوازن aliquots إلى درجة حرارة الغرفة المجمدة للSDB (الحيوانات المنوية العازلة التخفيف) لزرع اليوم ، ذوبان الجليد في استخراج عالية السرعة والمكان على الجليد ، وإعداد 100mM MgCl ₂ الحل.
   4. الخروج عشرأطباق ه حقن agarose وملء مع MMR / Ficoll الحل ، وإعداد وقبل تشغيل مضخة التسريب لتحقيق الاستقرار في التدفق.
   5. تأكد من أن الضفادع الإناث وضع البيض وذات جودة عالية. على النحو الأمثل ، ينبغي أن يكون لها قشرة البيض شركة (شكل عقد بعد jellying دي).
3. إعداد رد فعل transgenesis :
   1. بلطف شديد (باستخدام ماصة غيض قص) خلط الأوراق المالية والجمع بين النوى في أنبوب إيبندورف 1.5mL :
      4μl النوى (~ 4 - 8X10 نوى ⁵⁾
      خطي 2μl البلازميد (100ng/μl)
      احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. بينما يسير الحضانة ، تمييع 0.5μl من انزيم التقييد في 4.5μl O ₂ H وإضافة 1μl إنزيم المخفف ل18μl من SDB ، 2μl من MgCl ₂ و 2μl استخراج عالية السرعة. إضافة إلى هذا الخليط التفاعل النوى ، البلازميد. احتضان 10 دقيقة ليرتفع أكثر من النوى.
   3. خلال هذه الحضانة ، أزمة البيض 2-3 الضفادع ودي هلام في حل السيستين. غسلها جيدا (5X) مع 1XMMR ، واستخدام ماصة واسعة تحمل لنقل البيض dejellied 400-500 على كل طبق بشكل جيد يحتوي على agarose 0.2X MMR Ficoll +4 ٪. هذا يستغرق عادة حوالي 10 دقيقة ، وذلك مرة واحدة على استعداد أطباق البيض وعادة ما يكون رد الفعل هو على استعداد لتخفيف.
   4. حوالي 15-20 دقيقة بعد بدء خطوة ، مزيج بلطف رد الفعل (نوى / استخراج / DNA) مع طرف قص وإضافة إلى 150 حول 5μl SDB ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. النوى في هذا المزيج المخفف في حالة مستقرة لمدة 1hr. ، في حين أنها لا تحتفظ القدرة زرع طالما عندما غادرت في خليط المركزة.
4. تحميل الإبرة : مزيج من رد فعل مخفف أعد أعلاه بلطف شديد مع طرف فوهة ماصة واسعة ، ثم تحميل الإبرة على وجه السرعة ، كما نوى سوف يستقر بسرعة في أنبوب. لإبرة backload ، ضع قطعة من أنبوب Tygon غرامة على نهاية الحافة ماصة 200μl قص. رسم الحل في تلميح ماصة ، ثم إرفاق أنابيب إلى الإبرة والسماح للحل لدخول إبرة عن طريق الجاذبية أو محبطة بلطف الغطاس ماصة.
5. إبرة تعلق على ضخ أنابيب وتبدأ عملية زرع النوى. وينبغي أن يكون سريعا الحقن ، الضحلة وعمودي تقريبا غشاء البلازما البويضة لتجنب إحداث أضرار. بمعدل تدفق اقترح (10nl/sec) ، والحفاظ على ابرة في البويضة لثوان 0.5 ~. يجب إكمال 1-2 الاطباق زرع في غضون 20-30 دقيقة.

بعد الحقن ، وترك الأطباق في 16-20 درجة مئوية حتى الأجنة وصلت إلى مرحلة الخلية 4-8. فرز الأجنة الشق بعيدا عن جيرانهم غير الشق من خلال نقل (مع ماصة باستير الزجاج مع تلميح تقريبا قطرها نفس البويضة) إلى صحن كبير جديدة من Ficoll 0.2XMMR +4 ٪. تقسيم الأجنة الشق إلى مجموعات صغيرة (10-15 الأجنة / بئر لوحة 6 أيضا) والثقافة في 0.2XMMR (لا Ficoll) +100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين من خلال التنمية في وقت مبكر. يجب فحص الأجنة أثناء تكون المعيدة مع أي أجنة الموت إزالتها فورا وتغيير وسائل الإعلام حسب الحاجة.

المشاكل :

1. تم حظر الإبرة : تدفق الحل من الإبرة ينبغي ظهر بوضوح خلال عمليات الزرع. إذا كانت إبرة يصبح سدت الجسيمات مرئية ، وتغيير الإبر أو محاولة لازالة الانقاض من قبل طرف لقطة مع ملقط ودفع حل عن طريق الإبرة.
2. لم يتم الحصول على البيض الشق : تأكد من أن التخفيفات نوى حجم الحيوانات المنوية والحقن المناسبة وأنه لا يتم حظر الإبرة خلال الزرع. إذا كان حجم حقن عالية جدا ، قد لا يلتصق البيض أيضا ، وبدلا من اظهار تصبغ مشوه أو أضرار.
3. العديد من الأجنة تموت أثناء تكون المعيدة. ويمكن لعوامل عدة تعزز بقاء الجنين :
   1. رعاية مع نوى خلال إعداد والتفاعل الأنزيمي. نوى Decondensed هشة وتحتاج إلى زرع باستخدام الجدول الزمني المذكور أعلاه. لا مكان لهم على الجليد.
   2. الأضرار التي لحقت الكروموسومات نواة الحيوان المنوي أثناء عملية التفاعل ونقل النووي انزيم يؤثر على وتيرة transgenesis والتطور الطبيعي للأجنة. الضرر الكروموسومات إلى نوى يعزز كفاءة transgenesis بل يؤثر سلبا على البقاء على قيد الحياة / التطور الطبيعي. ويمكن خفض أو حذف انزيم التقييد خلال حضانة الانزيم تعزيز معدل النمو الطبيعي ولكن قد يقلل تواتر transgenesis البلازميد أو عدد النسخ التي أدخلت على جينوم الجنين.
   3. إذا الأريمة الراحل من خلال أجنة المعيدة تظهر علامات اللون أو موت الخلية فإنه من الممكن أيضا أن يستخدم كاشف للزرع وسامة بالنسبة للبيض. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان البيضق لم يكن لديك قشرة ثابتة ، فإنها قد تخضع لتخارج المعيدة وتفشل في توليد الطبيعي بعد المعيدة الأجنة.
4. عدد الأجنة معربا عن التحوير منخفضة. زيادة كمية الانزيم قيود.

ممثل نتائج الأجنة وراثيا

وينبغي أن تثار الأجنة وراثيا الناتجة عن نقل المواد النووية حتى التعبير عن مروج للاهتمام واضح. في الشكل 1 أعلاه ، مروج أكتين العضلات محركات التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء في somites هذا الشرغوف المعدلة وراثيا.

Discussion

ليتم اختبارها كل بناء المعدلة وراثيا ، ونحن عموما زرع النوى في 500-1000 البيض ، وفي هذا النطاق ، ونحن يمكن أن تولد الأجنة وراثيا التعبير عن ما يصل الى 10 بنيات مختلفة في اليوم الواحد ، اعتمادا على كيفية العديد من الإناث التي يسببها لوضع البيض. هذه زرع حوالي ثلث يلتصق البيض و60-80 ٪ من هذه الأجنة المضي قدما من خلال الشق عادة تكون المعيدة. تبعا للظروف التفاعل المستخدمة ، وبين 10-50 ٪ من هذه الأجنة تعبر عن والتحوير في المصالح. لذلك ، بمجرد إنشاء هذا الإجراء في المختبر ، فمن الممكن لعامل واحد لخلق السكان الأجنة وراثيا معربا عن عدد من البلازميدات مختلفة في يوم واحد. الجينات المحورة الاندماج في الجينوم باعتباره متسلسل (5-35 نسخة) ، لذلك يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لcointegrate أكثر من التحوير مختلفة في جينوم جنين واحد في وتيرة عالية (80-90 ٪) ^4.

نهج transgenesis الموصوفة هنا قد استخدمت بنجاح لmisexpress الجينات في المصالح ، لدراسة تنظيم الجينات ، وتوليد أجنة التي تعبر عن علامة / مراسل الفلورسنت في الخلايا أو هياكل الفائدة (على سبيل المثال ، ^4-7). وقد تم نشر الجينات المحورة من خلال germline ^8. أخيرا ، على الرغم من تظاهر الإجراء للاستخدام مع المورق القيطم هنا ، كما تم تكييفها للاستخدام في الأنواع ذات الصلة مضاعفا ، القيطم مداري ^9.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)