Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Summary

Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem gösteriyor

Abstract

Xenopus genom içine klonlanmış genlerin ürünleri istikrarlı entegrasyon, ifadenin zaman ve yerde kontrol etmek, daha sonraki aşamada embriyonik gelişim genleri ifade etmek ve arttırıcılar ve destekçileri embriyo içinde gen ekspresyonu düzenleyen nasıl tanımlamak için gereklidir . Burada gösterilen protokol transgenik Xenopus laevis embriyolar verimli üretmek için kullanılabilir. 1: Bu transgenesis yaklaşım üç bölümden oluşur. Sperm çekirdekleri yetişkin X izole edilir laevis testiste sperm plazma membranı permeabilizes lysolecithin ile tedavi. 2. Yumurta özü düşük hızda santrifüj, hücre döngüsünün interfaz ilerleme özü neden ek kalsiyum ve interfaz sitoplazmada izole etmek için yüksek hızda santrifüj tarafından hazırlanmıştır. 3. Nükleer transplantasyonu: çekirdekleri ve özü transgen ve küçük bir miktar kısıtlama enzim olarak tanıtıldı Lineerleştirilmiş plazmid DNA ile birleştirilir. Kısa bir reaksiyon sırasında, yumurta ekstresi kısmen, sperm kromatin decondenses ve restriksiyon enzimi, genom, transgen rekombinasyon teşvik kromozom tatili üretir. Tedavi sperm çekirdekleri daha sonra döllenmemiş yumurta naklediliyor. Transgen Entegrasyonu genellikle önce Oluşan embriyolar kimerik olmadığı gibi ilk embriyonik bölünme oluşur. Bu embriyolar transgenik embriyoların, organizatörü ve gen fonksiyonu analizler için etkin ve hızlı bir nesil için izin veren yeni nesil, üremek için herhangi bir ihtiyaç olmadan analiz edilebilir. Yetişkin X Bu yordamı kaynaklanan laevis transgen germline yoluyla yaymak ve farklı amaçlar için transgenik hayvanlar hatları oluşturmak için kullanılan olabilir.

Protocol

Bu transgenesis yaklaşım değiştirilmiş sürümlerini başlangıçta ¹ ve ² tarif edildi.

A. sperm çekirdekleri hazırlanması

Bu çekirdeklerin hazırlama yöntemi Murray ³ uyarlanmıştır, ancak sperm çekirdekleri ile nakledilen yumurta sonraki gelişmesi ile müdahale olarak proteaz inhibitörleri atlanmıştır. Alikot -80 ° C'de dondurulmuş ve yaklaşık 6 ay için transplantasyon için kullanılabilir.

Tüm çözümler hazırlığı başlamadan önce hazırlanan ve buz üzerinde yerleştirilmiş olmalıdır.

1. 1-2 yetişkin erkek X anestezisi en az 20 dakika boyunca Tricaine batırılma laevis pithing takip testisler kaldırmak.
2. , Kan, kan damarları ve yağ vücut kaldırmak 1XMMR içeren bir 60 mm Petri kabında kısaca yıkayın ve yağ vücudun herhangi bir ek parçalarını kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine testis döndürün. Bu sperm bültenleri, delinme testislerin dikkat edin.
3. Görünür parçaları vardır kadar kuru bir 60 mm Petri kabı ve forseps ile ıslatarak yumuşatmak testis testis aktarın. Maserasyon çekirdeğinin yüksek verim elde etmek, mümkün olduğu kadar iyice yapılmalıdır.
4. Islatarak yumuşatmak ve hafifçe aşağı yukarı pipet ve 2mLs soğuk nükleer hazırlık tamponu (1X stok gelen NPB) ekleyin.
5. Yaklaşık 4 üzerinden Squirt ıslatarak yumuşatmak toplama içine 15 ml tüp (örneğin Falcon 2059), bir huni tülbentten kalınlıkları; NPB, çanak 8mLs ile durulayın ve bu tüp içinde toplanması, tülbentten geçirilerek durulayın koymak. Eldivenli ellerini tüpe geri kalan sıvı toplamak için bir tülbent sıkmak ile.
6. Pelet sperm için 3000 rpm'de 10 dk. 4 ° C uygun boru adaptörleri ile sallanan bir kova rotor (örneğin 1480g Sorvall HB-4 rotor veya eşdeğeri). Durusu supernatant; bu tüp eklemek 8 ml NPB ve tekrar süspansiyon pelet 10 ml pipet ile yukarı ve aşağı pipetle; üstünde ve süzün süpernatant olarak tekrar aşağı Spin. Spin sırasında oda sıcaklığında NPB 1 ml dengelenmesi.
7. Süspanse edin pelet, 1 ml pipetteman ucunu kullanarak 1 ml oda sıcaklığında NPB 50μl 10mg/ml taze yapılmış lysolecithin ekleyip hafifçe karıştırın ve 5 dakika boyunca inkübe edin. oda sıcaklığında.
8. Lysolecithin reaksiyonu durdurmak, hafifçe karıştırın ve aşağı sallanan bir kova rotor 3000 rpm'de 10 dakika dönmeye tüpüne 10 ml soğuk 1XNPB +3% BSA ekleyin. Durusu süpernatant. Lysolecithin tedavi pelet biraz daha saydam bir görünüm (daha az opak beyaz) lysolecithin tedavi öncesinde daha.
9. Durusu süpernatant ve 5 ml soğuk NPB +0.3% BSA tekrar süspansiyon pelet, 10 ml pipet yardımıyla hafifçe karıştırın ve yukarıdaki gibi 3000rpm 10 dakika aşağı doğru döndürün.
10. Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet sperm depolama tampon ve 1,5 ml tüp transfer 500μl. Bu çekirdeklerin stok şimdi. Çekirdeklerin verim kontrol ederken, buz üzerinde saklayın.
11. Yeri, 98 sperm seyreltme tamponu (SDB), nükleer stok ve 1.5mL Eppendorf tüp Hoechst stokunun 1:100 dilüsyon 1μl 1 ul ul çekirdeğinin verim kontrol etmek için. 1 ul çıkarmadan hemen önce bir jilet kırpılır (veya büyük açılış) pipet kullanarak nükleer stoğu çok iyi karıştırın. Seyreltilmiş SDB / Hoechst / çekirdekleri çok iyi karıştırın ve küçük bir miktar kapiler eylem tarafından geliştirilmiş bir Neubauer hemasitometre odasına akışına izin verin. Bir bileşik mikroskop altında hemasitometre bir kare çekirdekleri güvenin. Bir erkek, 1-2x10 ⁵ hücre / ml sulandırılmamış stok yoğunluğu, hisse senedi, bu 1:100 dilüsyon için en az 100-200 sayıları ^(X10 4 hücre / ml) almalıdır . Hisse senedi, daha az yoğun ise, çekirdek, birkaç saat için yerleşmek süpernatantı bazılarını kaldırmak ve yeniden sayılmasını sağlar. 4 çekirdekleri bırakın ° C gliserol, daha iyi kriyoprezervasyon için nüfuz etmesi için bir gecede; sonra, büyük bir orifis pipet ile nükleer stok karıştırmak 20μl alikotları hazırlamak ve sıvı nitrojen içinde dondurarak.

Yüksek Hızlı Özü B. Hazırlık

Bu yöntem, Murray ³ uyarlanan ve eklenen sperm çekirdeğinin şişme ve kısmi kromatin decondensation teşvik edecek bir interfaz sitozolik özü üretir. Özü küçük alikotları -80 ° C'de dondurulmuş ve kullanımdan önce çözülmüş olabilir.

1. HCG enjeksiyonu, asal 8-12 yetişkin dişi X öncesinde 3-5 gün 50 U dorsal lenf kese içine PMSG enjekte edilerek laevis. Akşam özü hazırlanmadan önce, 500 adet 2 litre 1XMMR HCG ve yerde 2 kurbağa / konteyner her kurbağa enjekte. Parçalama veya aktive yumurta ile bir kurbağa özü hazırlık uzlaşma bu yana, yumurtlama için çiftleri içine kurbağa ayırmak için tavsiye edilir.
2. Ertesi sabah, hazırlamak ve hazırlık başlamadan önce tüm çözümler soğuk. Yavaşça, her kurbağa büyük b elle yumurta sınırdışı1X MMR içeren eakers. Her kabı yumurta Ekran ve prosedürü beneklenme, parçalama veya aktivasyon işaretleri (hayvan yarımkürede pigmentasyon daralma tarafından görüntülenmiştir) ile yumurta herhangi bir toplu atlayabilirsiniz. Pigmentasyon ile bile kesintisiz yumurta toplayın. İyi yumurta da kurbağa kova 1X MMR toplanabilir. 8-12 kadınlarda yumurta toplam hacmi> 100 ml olmalıdır.
3. De-jöle yumurta. Bunu yapmak için, mümkün olduğunca çok MMR olarak kaldırmak için, küçük bir miktarda sistein çözüm eklemek ve girdap yumurta. Taze sistein çözeltisi ile de jellying sırasında birkaç kez değiştirin. De-jöle her parti ve ayrı yumurta kırılması veya yumurta aktivasyonu ile toplu silmek. Yumurta geri kalanı birleştirin.
4. Proteaz inhibitörleri ile yumurta özü tamponu (XB) ~ 35 ml dört kez ve daha sonra 25 ml BOS-XB iki kez yıkayın.
5. Yumurta paketi: Beckman ultraclear tüpler içine yumurta transferi. Yumurta yerleşmek için izin verin. , Mümkün olduğu BOS-Xb kadar çok çıkarın. 4 ~ 60 sn için 1000 rpm (150g) Beckman GB 40 Ti rotor (ya da benzer bir rotor) kullanarak yumurta ° C Santrifüj Ambalajlı yumurta en fazla çözüm çıkarın.
6. Yumurtaları ezmek ve sitoplazmik ayıklamak oluşturmak için: 4 10 dakika 10.000 rpm (16.000 g) ° C yumurta santrifüj Yumurta üç tabakadan ayırmak gerekir: lipid (üst), sitoplazmada (ortada) ve yumurta sarısı (altta). Sitoplazmik tabakasının dibinde tüp aracılığıyla iğne takarak 18-gauge bir iğne ile her tüpten sitoplazmik katmanı toplayın. Buz üzerinde yeni bir ultraclear Beckman tüp sitoplazma aktarın.
7. 1X nihai konsantrasyonu izole sitoplazma proteaz inhibitörleri ekleyin. Sitoplazma Recentrifuge 16.000 g de 10 dakika süreyle 4 ° C Yukarıda açıklandığı gibi açıklık sitoplazma toplayın. 0,75-1 ml sitoplazma / kurbağa elde etmek için bekliyoruz.
8. 1 / 20, numune enerji karışımı özü hacminin ekleyin. Beckman-100 TL ultrasantrifüjdeki kalın duvarlı polikarbonat tüp içine sitoplazma aktarın. Tüpler her biri 3 ml tutun ve tam olarak en az yarısı olmalıdır.
9. 0.4 mM nihai konsantrasyonu her tüpe 1 M CaCl _2. Tüpler oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu BOS inaktive özü ve interfaz içine iter.
10. Tüpler Dengesi ve 4 1.5 saat süreyle 70.000 rpm (200,000 g) TLA-100,3 rotor kullanarak Beckman-100 TL ultrasantrifüjdeki ° C onları santrifüj Sitoplazma yukarıdan aşağıya doğru, dört kat damıtmak: lipit, sitoplazmada, membran / mitokondri ve glikojen / ribozomlar.
11. Her bir tüp (~ 1 ml 2-3 ml tüp yüklü ise), lipid tabakası içine bir şırınga ile tüpün üst takarak sitozolik katmanı kaldırın. Sitozolik fraksiyonu taze tüplerine transferi ve 4, 20 dakika boyunca 70.000 rpm (200,000 g) ° C örnekleri recentrifuge
12. 25-ul alikotları 0.5 mL tüpler içine süpernatant kısım. Kullanana kadar -80 sıvı azot ve mağaza ° C alikotları Hızlı dondurma. Özü etkili olup olmadığını belirlemek için, sperm çekirdeklerinin özü inkübe ve çekirdekleri gözle görülür bir şekilde oda sıcaklığında 10 dakika içinde ek (kalınlaşmasına ve uzatmak) şişer olmadığını belirlemek için Hoechst ile boyandı.

C. Transgenesis reaksiyon ve nükleer transfer

Önemli: çözümleri, ekipman ve kurbağa bir reaksiyon başlamadan önce hazır olduğunu kontrol edin. Birçok bileşenleri> 30 dakika boyunca sabit kalmaz bu yana bir kez Başlamadan aşağıda açıklanan yaklaşık bir zaman çizelgesi kullanarak reaksiyonu ile ilerlemek gerekir. Sperm çekirdekleri stoku, buz üzerinde tutulmalıdır iken, transgenesis reaksiyonlar (seyreltilmiş ve konsantre) oda sıcaklığında tutulmalıdır.

1. Başbakan dişi kurbağa. Transgenesis önce akşam, ertesi gün başlayan taze yumurtlamada elde etmek için birkaç (3-5) yetişkin kadın kurbağa dorsal lenf kese HCG 800 adet ile enjekte edilir.
2. Transgenesis prosedürü gün hazırlamak veya sıcaklığı transgenesis için gerekli çözümler getirmek:
   1. Yeni yapılan sistein (1XMMR, pH8.0% 2.5). Siz o gün kullanılmak üzere birkaç yüz mililitre gerekecektir.
   2. 0.2XMMR +6% Ficoll nakli yemekleri ve transgenik embriyo ve 0.2XMMR embriyolar yükseltmek için 100 mg / ml gentamisin (Ficoll olmadan) kurtarma. Çözümler ° C, yüksek sıcaklıklarda bu yana transgenesis ve embriyonik gelişim hem frekans olumsuz etkileyebilir ° C ve 16 ile 21 arasındaki sıcaklıklarda transgenik embriyoların erken bölünmelere artırılmalıdır 18-21 daha sıcak olmamalıdır.
   3. Çözülme ve günün transplantasyon için SDB oda sıcaklığında dondurulmuş alikot (sperm seyreltme tamponu) gelmesini, buz üzerinde yüksek hızda yer özü ve çözülme, ve 100 mM MgCl ₂ solüsyon hazırlanır.
   4. Inci çıke agaroz enjeksiyon yemekleri ve MMR / Ficoll solüsyonu ile doldurun, ve kurmak ve akışını dengelemek için infüzyon pompası önceden çalıştırın.
   5. Dişi kurbağa döşeme ve yumurta yüksek kaliteli olduğunu kontrol edin. Optimal, yumurta (de jellying sonra şekil tutun) bir firma korteks olmalıdır.
3. Transgenesis reaksiyon kadar ayarlayın:
   1. Çok hafifçe kırpılmış bir pipet kullanarak çekirdekleri stok karıştırın ve bir 1.5mL Eppendorf tüp birleştirmek:
      4μl çekirdekleri (~ 4-8X10 ⁵ çekirdekleri)
      2μl lineerleştirilmiş plazmid (100ng/μl)
      Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   2. inkübasyon devam ediyor, 4.5μl H ₂ O restriksiyon enzimi 0.5μl sulandırmak ve SDB 18μl, MgCl ₂ 2μl ve yüksek hızda özü 2μl seyreltilmiş enzim 1μl eklemek. Çekirdekleri plazmid reaksiyon bu karışıma ekleyin. Çekirdeklerin şişmeye 10 dakika daha inkübe edin.
   3. Bu İnkübasyon sırasında, sistein çözüm 2-3 kurbağalar ve de-jöle yumurta sıkın. (5X) 1XMMR ile iyice yıkayın ve 0,2 X MMR +4% Ficoll içeren her agaroz iyi çanak 400-500 dejellied yumurta aktarmak için geniş bir delik pipet kullanın. Bu genellikle, yaklaşık 10 dakika, böylece bir kez yumurta yemekleri genellikle sulandırmak için hazır reaksiyon hazırlanan sürer.
   4. Adım başladıktan sonra yaklaşık 15-20 dakika hafifçe kırpılmış bir ucu ile reaksiyonu (çekirdekleri / özü / DNA) karıştırın ve oda sıcaklığında yaklaşık 5μl 150 ila ul SDB ekleyin. Seyreltilmiş karışımı konsantre karışımı bırakıldığında sürece nakli kapasitesini korumak, oysa bu çekirdeklerin 1hr hakkında. Istikrarlı.
4. Iğne Yük: çok geniş bir orifis pipet ucu ile hafifçe yukarıda hazırlanan seyreltilmiş reaksiyon karıştırın, daha sonra çekirdekleri tüp hızla çözecek, hemen iğne yük. Backload iğne için kırpılır 200μl pipet ucu ucuna ince Tygon boru parçası koyun. Pipet çözüm çizin, sonra tüp iğne takın ve çözüm yerçekimi tarafından iğne girmesine izin veya hafifçe pipet Medyumu.
5. Boru, pompa ve çekirdeklerin transplantasyon başlamak için iğne takın. Enjeksiyonlar zarar vermesini önlemek için yumurta plazma membranı yaklaşık hızlı, sığ ve dik olmalıdır. Akış önerilen (10nl/sec) oranı, yumurta ~ 0.5 saniye boyunca iğne tutun. 20-30 dakika içinde 1-2 yemekleri transplantasyon tamamlamak gerekir.

Embriyolar 4-8 hücreli aşamasında ulaşana kadar enjeksiyonundan sonra, 16-20 ° C de bulaşıkları ayrılmak. Yarma embriyolar 0.2XMMR +4% Ficoll taze bir büyük çanak (bir ucu bir yumurta yaklaşık olarak aynı çapta bir cam Pasteur pipeti ile) aktarmak olmayan yarma komşuları uzak sıralayın. Küçük gruplar (10-15 / 6 plaka iyi embriyolar) ve kültür (yok Ficoll) 0.2XMMR erken geliştirilmesi yoluyla 100 mg / ml gentamisin içine yarma embriyolar bölün. Herhangi bir ölüyor embriyoların derhal kaldırılır ve değiştirilen medya gibi gerekli olan embriyolar gastrulasyon sırasında kontrol edilmelidir.

Sorun Giderme:

1. İğne bloke: iğne çözüm akış transplantasyon sırasında açık olmalıdır. Iğne görünür partikül madde tarafından bloke olursa, iğne değiştirmek veya forseps ile ucu kırpma ve iğne yoluyla çözüm iterek enkaz kaldırmak için çalışın.
2. Yarma yok yumurta elde edilmektedir: sperm çekirdekleri ve enjeksiyon hacmi dilüsyonları uygun ve iğne nakli sırasında bloke değildi olduğunu kontrol edin. Enjeksiyon hacmi çok yüksek ise, yumurta yerine renksiz pigmentasyon veya hasar tutunmaya değil, aynı zamanda ve.
3. Birçok embriyolar gastrulasyon sırasında öldü. Çeşitli faktörler, embriyonun hayatta kalma artırabilirsiniz:
   1. hazırlanması sırasında çekirdek ve enzimatik reaksiyonu ile ilgilenir. Decondensed çekirdekleri kırılgan olduğu ve yukarıdaki zaman çizelgesini kullanarak nakledilen olması gerekir. Buz üzerine koymayın.
   2. Enzim reaksiyon ve nükleer transfer sırasında sperm çekirdekleri tarafından sürekli kromozom hasarı transgenesis frekans ve embriyoların normal gelişimini etkiler. Çekirdeklerindeki kromozom hasarı transgenesis verimliliğini artırır, ancak hayatta kalma / normal gelişimini olumsuz etkiler. Restriksiyon enzimi azaltılması veya enzim inkübasyon sırasında atlayarak normal gelişim hızını artırabilirsiniz ama transgenesis veya embriyo genomunun içine plazmit kopya sayısı sıklığını azaltabilir.
   3. Gastrula embriyolar sayesinde geç blastula değişimi veya hücre ölümünü belirtileri göstermesi durumunda transplantasyonlar için kullanılan bir reaktif yumurtaları için toksik olduğunu da mümkündür. Buna ek olarak, eğer yumurtas sağlam bir korteks zorunda değilsiniz, onlar exogastrulation tabi ve normal post-gastrula embriyolar üretmek için başarısız.
4. Transgen ifade embriyoların sayısı azdır. Restriksiyon enzim miktarını artırın.

Transgenik Temsilcisi Embriyo Sonuçlar

Transgenik embriyolar nükleer transferleri kaynaklanan faiz organizatörü ifade görünür oluncaya kadar artırılması gerekmektedir. Yukarıdaki Şekil 1'de, bir kas aktin organizatörü Bu transgenik larva Somitlerin yeşil floresan protein ifade sürücüler.

Discussion

Her transgenik inşa test edilmesi için, biz genel olarak 500-1000 yumurta içine çekirdekleri nakli, bu ölçekte, yumurtalarını bırakmak için ne kadar çok sayıda kadın indüklenen bağlı olarak, günde 10 kadar farklı yapıları ifade transgenik embriyolar üretebilir. Bu transplantasyon ki, yumurta tutunmaya yaklaşık üçte birini ve bu yarma embriyoların% 60-80 normalde gastrulasyon üzerinden geçin. Bu embriyoların% 10-50 arasında kullanılan reaksiyon şartlarına bağlı olarak faiz transgen ifade eder. Bu nedenle, bir işçinin tek bir gün içinde çok sayıda farklı plazmid ifade transgenik embriyolar nüfusu oluşturmak için bir kez bu prosedürü laboratuvar kurulmuş olup, bu mümkün. Transgenlerin bir concatemer (5-35 kopyalarını) olarak genom entegre, bu yöntem, aynı zamanda, tek bir embriyo yüksek frekans ^(% 80-90) 4 genom içine birden fazla farklı transgen cointegrate kullanılabilir.

Burada açıklanan transgenesis yaklaşımı başarıyla, ilgi misexpress genler, gen regülasyonu çalışma ve ilgi hücreleri veya yapılar bir marker / floresan muhabiri ^{(örneğin, 4-7)} ifade embriyolar üretmek için kullanılır olmuştur . Transgenlerin germline ⁸ yayılır edilmiştir. Son olarak, prosedürü burada Xenopus laevis kullanmak için göstermiş olmasına rağmen, aynı zamanda ilgili diploid türleri, Xenopus tropicalis ⁹ kullanım için adapte edilmiştir.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)