트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Summary

이 비디오 프로토콜은 유전자 변형을 생성하는 방법을 보여줍니다

Abstract

Xenopus 게놈에 복제된 유전자 제품의 안정적인 통합은 배아 발달의 나중 단계에서 유전자를 표현하고, 그때와 발기인은 배아 내에서 유전자 발현을 조절하는 방법 정의, 표현의 시간과 장소를 제어하는 것이 필요합니다. 프로토콜 여기서 보여주는 효율적으로 유전자 변형 Xenopus laevis의 배아를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 1 :이 transgenesis 방식은 세 부분을 포함한다. 정자의 핵은 성인 X.으로부터 격리 아르 정자 플라즈마 막을 permeabilizes lysolecithin와 치료에 의해 ​​laevis의 testis. 2. 에그 추출물은 저속 원심 분리, 세포주기의 계면으로 진행하기 위해 추출을 일으킬뿐만 아니라 칼슘과 계면 cytosol를 분리하기 위해 고속 원심 분리에 의해 준비가되어 있습니다. 3. 핵 이식 : 핵 및 추출물은 transgene 및 제한 효소의 작은 금액으로 소개하는 선형 플라스미드 DNA와 결합하고 있습니다. 짧은 반응 동안, 달걀 추출물은 부분적으로 정자 염색질을 decondenses하고 제한 효소는 게놈에 transgene의 재조합을 촉진 염색체 휴식을 생성합니다. 취급 정자 핵은 다음 unfertilized 계란으로 이식하고 있습니다. transgene의 통합은 일반적으로 이전 결과 배아는 키메라하지 않는 등 처음 배아 절단을 발생합니다. 이 배아는 발기인 및 유전자 기능 분석을위한 유전자 변형 배아의 효과적이고 신속한 세대 수 있도록, 다음 세대 번식을 필요로하지 않고 분석할 수 있습니다. 성인 X. 이 절차로 인한 laevis 또한 germline 통해 transgene을 전파하고 여러 목적을 위해 유전자 변형 동물의 라인을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 transgenesis 접근 방식의 수정된 버전은 초기에 ^{1과 2에서} 설명한되었습니다.

A.의 정자 핵 준비

이 핵 준비 방법은 머레이 ^3에서 적응이지만, 그들이 정자 핵 이식과 계란의 후속 개발과 방해로 프로 테아제 억제제가 생략되었습니다. Aliquots는 -80 ° C에서 냉동하고 약 6 개월 동안 transplantations 사용할 수 있습니다.

모든 솔루션은 준비 사전 준비를 처음으로 얼음에 배치해야합니다.

1. 1-2 성인 남성이 X를 마취 최소한 20 분 Tricaine의 침수에 의해 laevis는 pithing 다음, testes를 제거합니다.
2. , 혈액, 혈관과 지방 시신을 제거 1XMMR를 포함하는 60mm 페트리 접시에 잠시 그​​들을 씻고, 그리고 지방 신체의 추가 조각을 제거하기 위해 종이 타월에 testes를 롤. 이것은 정자를 출시 등 소중히 testes를 안됩니다.
3. 눈에 띄는 덩어리가 없을 때까지 건조 60 mm 페트리 접시와 포셉와 더운 물에 담가서 부드럽게 testes에 testes를 전송합니다. 물에 담가서 부드럽게 함은 핵의 높은 수율을 얻을만큼 철저하게 가능한 수행하여야한다.
4. 더운 물에 담가서 부드럽게하고 부드럽게 위아래로 피펫하고, 2mLs 차가운 핵 준비 버퍼 (1X 주식에서 NPB) 추가합니다.
5. 약 4 물총 더운 물에 담가서 부드럽게은 15 ML 튜브 (예 : 팔콘 2059)에 수집, 퍼널에 대한 일종의 투박한 무명의 두께, NPB의 8mLs와 접시를 씻어 이것은 튜브에 수집, 일종의 투박한 무명을 통해 씻어 넣어. 장갑 낀 손이 튜브에 남은 액체를 수집하는 일종의 투박한 무명을 쥐어 짜기로.
6. 펠렛 10 분 위해 3000 RPM의 정자. 4 ° 적절한 튜브 어댑터 스윙 버킷 회전자 (Sorvall HB - 4 로터 또는 동급의 예 1천4백80g)에서 C. 가만히 따르다 뜨는,이 튜브에 추가할 8mL NPB와 resuspend 펠렛에 10 ML의 피펫과 위쪽 및 아래쪽 피펫, 위에 가만히 따르다 뜨는로 다시 스핀 다운. 스핀 동안 실내 온도에 NPB의 1mL를 평형.
7. 1 ML pipetteman 팁을 사용하여 1mL 실내 온도 NPB에 Resuspend 펠렛은, 갓 만들어진 10mg/mL lysolecithin의 50μl 추가 부드럽게 믹스, 5 분 알을 품다. 상온에서.
8. , lysolecithin 반응을 중지 부드럽게 혼합하고, 스윙 버킷 로터에서 3000 RPM 10 분 스핀 다운로 튜브 10 ML 추운 1XNPB 3%의 BSA를 추가합니다. 가만히 따르다의 뜨는. lysolecithin - 처리 펠렛은 약간 더 반투명 보일 것입니다 (이하 불투명 흰색)은 이전 lysolecithin 치료 한 것보다.
9. 가만히 따르다 뜨는 5 ML 차가운 NPB 0.3 % BSA에 resuspend 펠렛은 10 ML의 피펫과 함께 부드럽게 혼합 이상으로 3000rpm에서 10 분 스핀 다운.
10. 정자 저장 버퍼와 1.5 ML 튜브로 전송 500μl에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠릿. 이것은 지금 핵 재고입니다. 이 핵의 수율을 확인하는 동안 얼음에 보관하십시오.
11. 장소, 정자 희석 버퍼 (SDB), 원자력 주식과 1.5mL Eppendorf 튜브에 Hoechst 주식의 1:100 희석의 1μl 1 μl의 98 μl를 핵의 수율을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 단지 1 μl를 제거하기 전에 면도기 - 잘린 (또는 큰 오프닝) 피펫 팁을 사용하여 잘 핵 주식을 섞는다. 잘 희석 SDB / Hoechst / 핵 믹스와 모세관 작용에 의해 향상 노이 바 우어의 hemacytometer 상공 회의소에 흐름에 소량을 허용합니다. 복합 현미경 hemacytometer의 광장에서 핵을 계산합니다. 남자 한에서 당신은 1 - 2X10 ⁵ 셀 / μl의 undiluted 주식 농도에 대한 주식의 1:100 희석에 대한 최소한의 건의 100-200 (X10 ⁴ 셀 / ML)를 취득해야합니다. 당신의 주식이 덜 집중하면, 핵은 몇 시간 동안 정착 뜨는의 일부를 제거하고 재계산 보자. 4 핵 남겨 ° C 글리세롤 잘 cryopreservation에 대한 침투 수 있도록 숙박, 다음, 큰 구멍 피펫 팁 잘 핵 주식을 섞어 20μl aliquots를 준비하고, 액체 질소로 동결.

고속 추출의 B. 준비

이 방법은 머리 ^3에서 적응하고 추가 정자 핵의 붓기와 일부 염색질의 decondensation을 추진합니다 계면 cytosolic 추출물을 생산하고 있습니다. 추출은 -80 ° C에서 작은 aliquots에 냉동과 해동 사용하기 전에 수 있습니다.

1. HCG 주사, 주요 8-12 성인 여성 X.하기 전에 3-5일 지느러미 임파선 색에 PMSG 50 U를 주사하여 laevis. 추출 준비 전에 저녁 2리터의 1XMMR에 500 단위 HCG 및 장소 2 개구리 / 용기 각 개구리를 삽입. 계란 lysing 또는 활성화 한 개구리는 추출 준비를 손상 수 있기 때문에 배란을위한 쌍에 개구리를 분리하는 것이 좋습니다.
2. 다음날 아침, 준비하고 준비를 시작하기 전에 모든 솔루션을 진정. 부드럽게, 수동으로 각각의 개구리에서 큰 B에 달걀을 추방1X MMR을 포함 eakers. 각 컨테이너에서 달걀을 화면과 절차에서 mottling, lysing 또는 활성화의 흔적 (동물 반구에 착색의 수축에 의해 시각)로 달걀의 배치를 생략하면됩니다. 심지어 착색과 끊어지지 않는 계란을 수집합니다. 좋은 계란도 개구리 양동이에 1X MMR에서 수집한 수 있습니다. 계란의 총 볼륨 8-12 여성에서> 100 ML해야합니다.
3. 데 - 젤리 계란. 이렇게하려면, 가능한 한 많은 MMR을 제거 시스테인 솔루션의 작은 금액을 추가하고, 소용돌이 계란. 신선한 시스테인 솔루션 드 jellying 동안 여러 번 교체합니다. 데 - 젤리는 각 개별적으로 계란의 배치 및 파손 또는 달걀 활성화와 일괄 폐기하십시오. 계란의 나머지 부분을 결합합니다.
4. 단백 분해 효소 억제제와 계란에게 추출 버퍼 (XB)의 ~ 35 ML에 네 번, 그리고 CSF - XB의 25 ML에 두 번 씻으십시오.
5. 계란 팩 : 베크맨 ultraclear 튜브에 계란을 전송합니다. 계란 정착하도록 허용합니다. 가능한 CSF - XB만큼을 제거합니다. 4 ~ 60 초 1,000 RPM (150g)에 베크맨 SW 40 티 로터 (또는 유사한 로터)를 사용하여 계란 ° C.를 원심 분리기 포장 계란의 상단에서 여분의 솔루션을 제거합니다.
6. 달걀을 호감과 세포질 추출물을 생성하려면 : 4 10 분 10,000 RPM (1만6천g) ° C.에 달걀을 원심 분리기 계란은 세 층으로 분리한다 : 지방질 (위), 세포질 (가운데)과 난황 (아래). 세포질 레이어의 기지에있는 튜브를 통해 바늘을 삽입하여 18 게이지 바늘로 각각의 튜브에서 세포질 레이어를 수집합니다. 얼음에 신선한 ultraclear 베크맨 튜브에 세포질을 전송합니다.
7. 1X의 최종 농도에 격리 세포질로 프로 테아제 억제제를 추가합니다. 4 10 분 16,000g에서 세포질을 Recentrifuge ° C. 위에 설명된대로 명확히 세포질를 수집합니다. 0.75-1 ML의 세포질 / 개구리를 얻을 것으로 기대합니다.
8. 샘플 에너지 믹스의 추출 볼륨의 20분의 1 추가합니다. 베크맨 TL - 100 초원 심 분리기를위한 두꺼운 벽의 폴리 카보 네이트 튜브에 세포질을 전송합니다. 튜브 3 ML 각에 대한 보유 및 전체 최소 절반해야합니다.
9. 0.4 mm의 최종 농도 각 관 1 M CaCl _2를 추가합니다. 실온에서 15 분위한 튜브를 품어. 이것은 CSF를 inactivates 및 계면에 압축을 풉니다들을 못살게 굴지.
10. 튜브의 균형 4 1.5 H 위해 70,000 RPM (20만g)에 TLA - 100.3 로터를 사용하여 베크맨 TL - 100 초원 심 분리기 ° C. 그들을 원심 분리기 세포질은 위에서 아래로, 넷 레이어로 분류됩니다 : 지질, cytosol, 멤브레인 / mitochondria 및 글리코겐 / 리보솜.
11. 지질 층을 통해 튜브의 상단에 주사기를 삽입하여 각각의 튜브 (~ 1 ML 2-3 ML이 튜브에 로드된 경우)에서 cytosolic 레이어를 제거합니다. 새로운 튜브에 cytosolic 분수를 전송 4 20 분 70,000 RPM (20만그램) ° C.에서 샘플을 recentrifuge
12. 0.5 - ML 튜브에 25 μl aliquots에 뜨는 나누어지는. 사용하기 전까지 -80에서 액체 질소 및 저장 ° C에서 aliquots을 급속 냉동하다. 추출물이 효과적인지 여부를 확인하려면, 정자 핵을 추출에 incubated과 핵이 가시 실온에서뿐만 아니라 10 분 이내에 (진하게하고 길이) 팽창 여부를 확인하는 Hoechst 물들일 수 있습니다.

C.의 Transgenesis 반응과 핵 전송

중요 : 솔루션, 장비 및 개구리가 반응을 시작하기 전에 모든 준비가되어 있는지 확인합니다. 많은 구성 요소가> 30 분 동안 안정적으로 유지하지 않기 때문에 일단 시작, 당신은 아래에서 설명하는 대략적인 시간표를 사용하여 반응을 진행해야합니다. 정자의 핵 재고가 얼음에 보관하는 동안 transgenesis 반응은 (희석 및 농축 모두) 상온에서 보관해야합니다.

1. 프라임 여성 개구리. transgenesis 전에 저녁, 다음날 처음 갓 낳은 달걀을 얻기 위해 등의 임파선 색의 HCG 800 단위로 몇 가지 (3-5) 성인 여성의 개구리를 삽입.
2. transgenesis 절차의 하루, 준비 또는 온도 transgenesis에 필요한 솔루션을 가져다 :
   1. 갓 만들어진 시스테인 (1XMMR, pH8.0에서 2.5 %). 당신이 그날 사용할 수 수백 밀리리터가 필요합니다.
   2. 이식 요리와 유전자 변형 배아와 0.2XMMR 배아를 양육을위한 100 μg / ML gentamicin (Ficoll 제외)의 복구에 0.2XMMR 6퍼센트의 Ficoll. 솔루션 ° C 높은 온도 때문에 부정적인 transgenesis 및 배아 발달의 두 주파수에 영향을 미칠 ° C와 유전자 변형 배아가 16과 21 사이의 온도에서 초기 cleavages을 통해 제기되어야 18-21보다 따뜻한해서는 안됩니다.
   3. 해동과 하루 transplantations에 대한 SDB의 실내 온도 냉동 aliquots (정자 희석 버퍼)에 평형, 얼음 고속 추출하고 장소를 해동하고, 100mM MgCl ₂ 솔루션을 준비합니다.
   4. 일 나가E 아가로 오스 분사 요리와 MMR / Ficoll 솔루션을 작성하고, 설정하고 흐름을 안정화하기 위해 주입 펌프를 미리 실행합니다.
   5. 여성 개구리가 누워 있고 계란은 양질의 것을 확인하십시오. 최적 달걀 (드 jellying 후 형태를​​ 잡아) 회사 피질이 있어야합니다.
3. transgenesis 반응을 설정합니다 :
   1. 아주 부드럽게 (잘린 피펫 팁을 사용하여) 핵의 주식을 혼합하고 1.5mL Eppendorf 튜브에 결합 :
      4μl 핵 (~ 4 - 8X10 ⁵ 핵)
      2μl은 선형 플라스미드 (100ng/μl)
      실온에서 5 분 알을 품다.
   2. 부화가 진행되는 동안, 4.5μl H ₂ O의 제한 효소 0.5μl을 희석하고 SDB의 18μl, MgCl ₂ 2μl 및 고속 추출물의 2μl에 희석 효소 1μl를 추가합니다. 핵 - 플라스미드 반응이 혼합물을 추가합니다. 핵 팽창 10 분 더 품어.
   3. 이 부화하는 동안, 시스테인 용액에 2-3 개구리와 드 젤리에서 계란을 짠다. 1XMMR와 함께 (5 배) 잘 씻으십시오, 그리고 0.2X MMR 4%의 Ficoll을 포함하는 각각의 아가로 오스 잘 접시에 400-500 dejellied 달걀을 전송하는 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 이것은 보통 10 분 정도, 그래서 한 계란 요리는 일반적으로 희석 준비가 반응을 준비하고 있습니다 걸립니다.
   4. 약 15-20분 단계를 시작 후, 부드럽게 잘린 팁과 반응 (핵 / 추출 / DNA)를 혼합하고 실온에서 150 5μl에 대한 μl SDB를 추가합니다. 농축 혼합물에 남아있는 때 그들이 한 이식 용량을 유지하지 반해이 희석 혼합의 핵은 1 시간에 대해서.위한 안정됩니다.
4. 바늘로드 : 다양한 오리피스 피펫 팁 매우 부드럽게 위에서 준비한 희석 반응을 혼합 후 핵이 튜브에 빠르게 정착하므로 즉시 바늘을로드합니다. backload 바늘하려면, 잘린 200μl 피펫 팁의 끝 부분에 미세 Tygon 튜빙의 한 조각을 넣으십시오. 피펫 팁에 솔루션을 그려 후 바늘에 튜브를 장착하고 솔루션은 중력에 의해 바늘을 입력 허용하거나 부드럽게 피펫 플런저를 우울.
5. 튜빙을 펌프와 핵의 transplantations를 시작 바늘을 연결합니다. 주사 피해 일을 피하기 위해 계란의 플라즈마 막 약 수직 빠른 얕은하고 있어야합니다. 흐름 추천 (10nl/sec)의 속도로 ~ 0.5 초 동안 계란에서 바늘을 유지. 당신은 20~30분 이내 transplantations 1-2 요리를 완료해야합니다.

배아는 세포 4-8 단계에 도달하기 전까지 주사 후 16-20 ° C에서 요리를 두십시오. 0.2XMMR 4%의 Ficoll의 새로운 큰 접시에 (팁 달걀로 거의 동일한 직경을 가진 유리 파스퇴르 피펫)를 전송하여 거리에 자신의 비 - cleaving 이웃에서 cleaving 배아를 정렬하십시오. 작은 단체 (/ 물론 6 자 접시의 10-15 배아)과 0.2XMMR 문화 (NO Ficoll) 조기 개발을 통해 100 μg / ML의 gentamicin에 cleaving 배아를 분할. 모든 죽어가는 태아가 신속하게 제거하고 변경된 미디어가 필요에 따라 함께 태아도 gastrulation 동안 확인하​​여야한다.

문제 해결 :

1. 니들이 차단됩니다 바늘에서 솔루션 흐름 transplantations 동안 분명해야합니다. 바늘이 보이는 미립 물질에 의해 차단되면, 바늘을 변경하거나 포셉와 팁을 클리핑하고 바늘을 통해 솔루션을 추진하여 파편을 제거하려고합니다.
2. 아무 cleaving 계란도 얻을 수있다 : 정자의 핵 및 사출 량의 dilutions 적절하고 바늘이 이식하는 동안 차단되지 않았음을 확인하십시오. 사출 볼륨이 너무 높은 경우에는, 계란은 변색 착색이나 손상을 표시하는 대신 분열도하지 않을 수 있으며.
3. 많은 배아는 gastrulation 동안 죽어. 여러 가지 요인이 배아의 생존을 향상시킬 수 있습니다 :
   1. 준비하는 동안 핵 및 효소 반응과 함께 돌봐. Decondensed 핵이되기 쉽고 위의 시간표를 사용하여 이식해야합니다. 얼음에 그들을 올려 놓지 마십시오.
   2. 효소 반응과 핵 전송하는 동안 정자의 핵에 의해 지속적인 염색체 손상이 transgenesis의 빈도와 태아의 정상적인 발달을 모두 영향을 미칩니다. 핵에 염색체 손상 transgenesis의 효율성을 향상하지만, 부정적인 생존 / 정상 발달에 영향을 미칩니다. 감소 또는 효소 배양하는 동안 제한 효소를 생략하는 것은 정상적인 발전의 속도를 향상시킬 수 있지만 transgenesis 또는 배아의 게놈에 도입 플라스미드 사본 번호 빈도를 감소 수 있습니다.
   3. gastrula의 배아를 통해 후반 blastula이 변색 또는 세포 사망의 징후를 보여주면 그것은 transplantations에 사용되는 시약은 계란에 독성 것을 수도 있습니다. 또한, 경우 계란S는 회사의 피질이없는 그들은 exogastrulation를 받아야하고 정상 사후 gastrula의 배아를 생성하지 못할 수 있습니다.
4. transgene을 표현하는 배아의 수는 적습니다. 제한 효소의 양을 늘립니다.

대표 트렌스 제닉 엠브료 결과

관심의 발기인의 표현을 볼 때까지 핵 전송으로 인한 유전자 변형 배아가 제기되어야합니다. 위의 그림 1에서 근육 굴지업자는이 유전자 변형 올챙이의 somites에 녹색 형광 단백질의 표현을시킵니다.

Discussion

각 형질 구성을 테스트하기 위해서, 우리는 일반적으로 500-1000 계란으로 핵 이식,이 규모에서, 우리는 알을 낳기 위해 유도 얼마나 많은 암컷에 따라 하루에 10 가지 다른 구조까지 표현 형질 배아를 생성할 수 있습니다. 이러한 transplantations의 계란 클리브 중 하나에 대한 세 번째이 cleaving 배아의 60~80%가 정상적으로 gastrulation을 통해 진행합니다. 이 배아의 10-50% 사이에 사용하는 반응 조건에 따라하는 것이 관심의 transgene을 표현. 한 노동자가 하루에 여러 plasmids의 숫자를 표현하는 유전자 변형 배아의 인구를 만들 수 있도록 그러므로, 일단이 절차가 실험실에서 설립, 그것이 가능합니다. Transgenes가 concatemer (5-35 부)으로 게놈에 통합이 방법은 또한 높은 주파수 (80~90%) ^4에서 단일 배아의 게놈에 하나 이상의 다른 transgene을 cointegrate하는 데 사용할 수 있도록.

여기에 설명된 transgenesis 방식은 성공적으로 관심의 유전자를 misexpress하는 유전자 규정을 연구하고, 관심 셀 또는 구조에 마커 / 형광등 기자 (예를 들어, ^4-7)을 표현 배아를 생성하는 데 사용되었습니다. Transgenes은 germline ⁸ 전달되었습니다. 절차 여기서 Xenopus laevis와 함께 사용하기위한 증명 있지만 마지막으로, 그것은 또한 관련 diploid의 종, Xenopus tropicalis ⁹ 사용하기 위해 적응되었습니다.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)