このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示しています<em>アフリカツメガエル</em>未受精卵に核移植に続いて精子の核への導入遺伝子の導入による。
アフリカツメガエルのゲノム中にクローニングされた遺伝子産物の安定的な統合は、胚発生の後期段階で遺伝子を発現すること、およびエンハンサーおよびプロモーターは、胚内で遺伝子発現を調節する方法を定義するために、式の時間と場所を制御する必要がある。ここに示したプロトコルを効率的にトランスジェニックアフリカツメガエルの胚を生産するために使用することができます。 1:このトランスジェネシスの手法は、三つの部分を含む。精子の核は、成人Xから分離されています精子形質膜をpermeabilizesリゾレシチンで処理してツメガエル精巣、。 2。卵抽出液を低速遠心分離、抽出物は細胞周期の間期へと進行させるためにカルシウムを加え、そして相間の細胞質を分離するため、高速遠心分離によって調製される。 3。核移植:核とエキスは、導入遺伝子及び制限酵素を少量として導入される直鎖状プラスミドDNAと結合されています。短い反応中に、卵抽出物は部分的に精子クロマチンをdecondensesと制限酵素は、ゲノムへの導入遺伝子の組換えを促進する染色体切断を生成します。処理された精子の核は、未受精卵に移植されています。導入遺伝子の統合は、通常、結果として得られる胚のキメラではないというような最初の胚の切断の前に発生します。これらの胚は、プロモーターと遺伝子機能の解析のためのトランスジェニック胚の効率的かつ迅速な世代を可能にする、次の世代に繁殖することを必要とせずに解析することができます。成人X.この手順に起因するツメガエルはまた生殖細胞を通じて導入遺伝子を伝播し、複数の目的のためのトランスジェニック動物の行を生成するために使用することができます。
各トランスジェニックコンストラクトがテストするために、我々は一般的に500から1000の卵に細胞核を移植し、このスケールで、我々は、産卵のために誘導する方法多くの女性に応じて、一日あたり10種類の構成要素にまで発現するトランスジェニック胚を生成することができます。これらの移植のうち、卵を切断の約3分の1と、これらの切断胚の60〜80%は、通常、原腸形成を進めます。?…
The authors have nothing to disclose.
私たちの仕事のための資金は、NIH、ダイムの月、およびアメリカの癌協会によって提供されます。
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)