Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.

Abstract

يشكل فيروس كورونا 2 المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) تهديدا خطيرا لصحة عامة الناس. خلال مواسم الأنفلونزا ، قد يتسبب انتشار SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في عبء أمراض الجهاز التنفسي على مستوى السكان يصعب إدارته. لذلك، ستحتاج فيروسات الجهاز التنفسي SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) إلى مراقبة دقيقة في فصلي الخريف والشتاء المقبلين، لا سيما في حالة SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B، التي تشترك في عوامل وبائية مماثلة مثل السكان المعرضين للإصابة وطريقة الانتقال والمتلازمات السريرية. بدون مقايسات محددة الهدف ، قد يكون من الصعب التمييز بين حالات هذه الفيروسات بسبب أوجه التشابه بينها. وفقا لذلك ، فإن مقايسة تعدد الإرسال الحساسة والمستهدفة التي يمكن أن تفرق بسهولة بين هذه الأهداف الفيروسية ستكون مفيدة لممارسي الرعاية الصحية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على النسخ العكسي في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة R3T بخطوة واحدة RT-qPCR المطورة داخليا للكشف المتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV. مع ما لا يقل عن 10 نسخ من الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكننا تحديد أهداف SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV بنجاح في وقت واحد بدقة 100٪. تم العثور على هذا الفحص ليكون دقيقا وموثوقا وبسيطا وحساسا ومحددا. يمكن استخدام الطريقة المطورة كاختبار تشخيصي محسن ل SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في المستشفيات والمراكز الطبية ومختبرات التشخيص وكذلك لأغراض البحث.

Introduction

تنجم جائحة مرض فيروس كورونا المستمر 2019 (COVID-19) عن فيروس كورونا الجديد المعروف باسم فيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) 1. نظرا للعدوى القوية ل SAR-CoV-2 وقدرتها على الانتقال السريع ، ظهر جائحة COVID-19 في مدينة ووهان ، الصين ، وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم. أدى هذا في النهاية إلى ظهور علامات الضائقة التنفسية وحتى الموت2،3،4. تم إعلان COVID-19 جائحة في أكثر من 213 دولة ، متوقعا زيادة حادة في عدد الحالات المؤكدة ، كما يتضح من الأوراق المنشورة في دراسات بحثية مختلفة 3,5. ينتقل COVID-19 بشكل أساسي عن طريق قطرات الجهاز التنفسي الصغيرة التي يطلقها الأفراد المصابون في البيئة ثم يتعرضون للأفراد الضعفاء من خلال الاستنشاق أو الاتصال الوثيق بالأسطح الملوثة. عندما تتلامس هذه القطرات مع الغشاء المخاطي للعينين أو الفم أو الأنف ، قد يصاب الشخصبالعدوى 6. تظهر الإحصاءات الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) أن هناك أكثر من 76 مليون حالة مؤكدة للوباء في جميع أنحاء العالم ، مع 7 ملايين حالة وفاةمذهلة 7. وهكذا، صنفت الأمم المتحدة الوباء الناجم عن مرض كوفيد-19 على أنه كارثة بسبب تأثيره المباشر على حياة مليارات الأشخاص حول العالم وكان له آثار اقتصادية وبيئية واجتماعية بعيدة المدى.

وقد ثبت أن مبادرات الصحة العمومية، بما في ذلك الاختبار الشامل، والكشف المبكر، وتتبع المخالطين، وعزل الحالات حاسمة في إبقاء هذا الوباء تحت السيطرة8،9،10،11. ستزيد أشهر الشتاء من تداول فيروسات الجهاز التنفسي الأخرى مثل الأنفلونزا A و B مع أعراض تشبه COVID-19 مما يجعل من الصعب تحديد حالات COVID-19 وتعقبها وعزلها في وقت مبكر. كل عام ، يبدأ تفشي الأنفلونزا A و B في أواخر الخريف أو أوائل يناير مع موسمية يمكن التنبؤ بها12. تشترك فيروسات SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا في العديد من السمات الوبائية. إلى جانب ذلك ، تقاسم أوجه التشابه في السكان المعرضين للإصابة والتي تشمل الأطفال وكبار السن ونقص المناعة والأفراد الذين يعانون من أمراض مصاحبة مزمنة مثل الربو أو مرض الانسداد الرئوي المزمن أو الفشل القلبي والكلوي أو مرض السكري12,13. ولا تشترك هذه الفيروسات في الفئات السكانية الضعيفة فحسب، بل تشترك أيضا في طرق انتقال الاتصال والرذاذ التنفسي14. من المتوقع أن يصاب المرضى على الأرجح بأكثر من واحد من فيروسات الجهاز التنفسي هذه مع اقتراب موسم الأنفلونزا14. لذلك ، يجب إجراء فحص SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا على المرضى الذين تظهر عليهم الأعراض قبل عزلهم. لا يمكن إجراء اختبارات منفصلة للفيروسات الثلاثة (SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B) بسبب النقص العالمي في الموارد اللازمة لاستخراج الحمض النووي وتشخيصه. من أجل فحصها جميعا في تفاعل واحد ، يجب تطوير طريقة أو اختبار.

متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) -CoV هي أحد أفراد عائلة فيروس كورونا البشري (CoV). وجاءت أولى حالات عزل فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية من مريض أدخل المستشفى في المملكة العربية السعودية وتوفي في أيلول/ سبتمبر 2012 بسبب مشاكل تنفسيةحادة15. وهناك بينات تشير إلى أن الجمال العربية هي موطن المستودع البارز لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. لقد ثبت أن الفيروسات من الجمال العربية المصابة هي حيوانية المنشأ وبالتالي يمكن أن تصيب البشر16,17. يمكن للبشر المصابين بهذا الفيروس أن ينشروه للآخرين من خلال الاتصال الوثيق18. وحتى 26 كانون الثاني/يناير 2018، كانت هناك 2143 حالة مؤكدة مختبريا للإصابة بعدوى فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية، بما في ذلك 750 حالة وفاة على مستوىالعالم 19 حالة. والأعراض الأكثر شيوعا للإصابة بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية هي السعال والحمى وضيق التنفس. كما أبلغ عن ظهور أعراض الالتهاب الرئوي والإسهال وأمراض الجهاز الهضمي20 عدوى بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولا يتوفر حاليا لقاح تجاري أو علاج محدد لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولذلك، فإن التشخيص الفوري والدقيق ضروري للوقاية من فاشيات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية على نطاق واسع والتمييز بين فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ومرض كورونا-سارس-2.

حتى الآن ، تم اقتراح العديد من الأساليب للكشف عن هذه الفيروسات مثل تعدد الإرسال RT-PCR21،22،23،24،25 ، CRISPR / Cas1226،27 ، CRISPR / Cas928 ، و CRISPR / Cas329 ، المقايسة المناعية للتدفق الجانبي30 ، المستشعرات الجزيئية الحيويةالورقية 31 ، اختبار شيرلوك في وعاء واحد32 ، أبتامير الحمض النووي33 ، متساوي الحرارة بوساطة الحلقة التضخيم (LAMP) 19،34 ، إلخ. كل طريقة من الطرق المذكورة أعلاه لها مزايا وعيوب فريدة من حيث الحساسية والخصوصية. من بين هذه الطرق ، الاختبار القائم على تضخيم الحمض النووي: متعدد الإرسال qRT-PCR ، هو الأكثر شيوعا ويعتبر المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV.

في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم وتقييم مجموعات وتحقيقات أولية مختلفة للكشف الفعال والدقيق والمتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي الاصطناعي الملتوي القياسي. وتوصي منظمة الصحة العالمية بإجراء المقايسات المتعددة الإرسال التي وضعت إما للجينات المستهدفة لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية أو لفيروس كورونا-سارس-2. وتشفر هذه الجينات عموما البروتينات والمعقدات التي تسهم في تكوين مركب النسخ المتماثل/النسخ (RTC)35 مثل المنطقة داخل إطار القراءة المفتوح 1a (ORF1a) المستخدم في مقايسة فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تشفير البروتينات الهيكلية بواسطة الجينات المستخدمة في المقايسات التشخيصية مثل منطقة المنبع لجين المغلف (upE) وجين nucleocapsid (N) اللذين يستخدمان في مقايسات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية و SARS-Cov-2 ، على التوالي35,36. استخدمنا مجموعة R3T الداخلية ذات الخطوة الواحدة RT-qPCR لإنشاء RT-qPCR للكشف عن الفيروسات37. تم اختبار وتقييم الكشف عن الفيروسات والحساسية والنوعية والنطاق الديناميكي لمجموعة R3T RT-qPCR ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي باستخدام التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف للحمض النووي الريبي الاصطناعي الملتوي القياسي. كان أدنى حد للكشف العملي حوالي 10 نسخ نسخ لكل تفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن استخدام مجموعة R3T RT-qPCR الداخلية ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي/المسبار وتنفيذها بنجاح من أجل التشخيص المتزامن الروتيني لفيروس كورونا-سارس-2 والأنفلونزا A والأنفلونزا B وفيروس كورونا-سارس-2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تق البلمرة التعبير والتنقية

  1. بناء البلازميد مع علامة سداسية الهستيدين قابلة للانقسام في المحطة C للإنزيم.
  2. قم بتحويل 50 نانوغرام من متجه التعبير إلى سلالة E. coli BL21- (DE3) باتباع البروتوكول القياسي38.
  3. قم بتلقيح الخلايا المحولة في أربع قوارير سعة 6 لتر تحتوي كل منها على 2 لتر من مرق الوسائط 2YT عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى OD 600 من 0.8 أو رقم الخلية 6.4 × 108 .
  4. تحفيز تعبير Taq polymerase مع 0.5 mM من الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع الرج.
  5. احصد الخلايا عن طريق تدويرها عند 4 درجات مئوية عند 7808 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الكريات في 200 مل من محلول تحلل بوليميراز Taq البارد (الجدول 1) في 5 مل / جم من حبيبات الخلية.
  6. احتضان الخلايا بالليزوزيم (2 مجم / مل من محلول التحلل) ومثبطات الأنزيم البروتيني لمدة 45 دقيقة ثم مرر الليزات عبر معطل خلوي عند 30 كيلو رطل / بوصة مربعة وأجهزة طرد مركزي عند 22040 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل حطام الخلية.
  7. سخني المادة الطافية لمدة 15 دقيقة على حرارة 85 درجة مئوية. قم بالدوران لأسفل عند 95,834 × g لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وقم بترشيحها على الجليد باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر.
  8. إجراء تنقية البروتين باستخدام كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع (FPLC) عن طريق تمرير العينة أولا عبر عمود Ni-NTA HP 5 مل بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة باستخدام مخزن Taq polymerase المؤقت A (الجدول 2 ؛ الجدول 2 ؛ الشكل 1 أ).
  9. اغسل ب 10 أحجام أعمدة (CV) من المخزن المؤقت Taq polymerase A و 4٪ من Taq polymerase buffer B (الجدول 2). قم بسحب البروتين المرتبط بتدرج خطي باستخدام Taq polymerase Buffer B أكثر من 20 CV في زجاجة سعة 100 مل.
  10. مرر المحلول في زجاجة سعة 100 مل من خلال عمود تبادل كاتيوني سعة 5 مل عند 4 مل / دقيقة باستخدام المخزن المؤقت Taq polymerase C (الجدول 2 ؛ الشكل 1 أ).
  11. يغسل مع 20 CV من 100٪ Taq polymerase buffer C و 5٪ Taq polymerase buffer D (الجدول 2).
  12. Elute مع تدرج خطي باستخدام Taq polymerase buffer D (الجدول 2) بدءا من 5٪ إلى 100٪.
  13. تحقق من الكسور المستخلصة عن طريق إجراء SDS-PAGE هلام الكهربائي 39 متبوعا بتلطيخ الهلام 40 كما هو موضح سابقا. باختصار ، خذ 10 ميكرولتر من كل كسر وأضف حجما متساويا من صبغة تحميل SDS 2x. قم بتشويه العينة عند 90درجةمئوية لمدة 10 دقائق. قم بتحميل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ وقم بتشغيل الجل لمدة 25 دقيقة عند 200 فولت ، قم بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Brilliant Blue ثم قم بإزالة البقع.
  14. اجمع كل الأجزاء التي تحتوي على Taq polymerase المنقى والدياليز مقابل مخزن تخزين Taq polymerase (الجدول 3) عند 4 درجات مئوية. باختصار ، قم بإعداد 2 لتر من المخزن المؤقت للتخزين واغمر كاسيت غسيل الكلى في المخزن المؤقت لمدة دقيقتين لترطيبه. قم بحقن الكسور التي تم جمعها باستخدام إبرة في كاسيت غسيل الكلى واتركها طوال الليل في محلول غسيل الكلى عند 200 دورة في الدقيقة على جهاز التقمام.
  15. بعد غسيل الكلى ، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وقم بعمل حصص 10 ميكرولتر ، وقم بالتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بتصفية جميع المخازن المؤقتة للتنقية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر قبل تحميلها في نظام FPLC.

2. تعبير MMLV-RT في نظام تعبير خلايا الحشرات وتنقيتها

  1. توليد الحمض النووي Bacmid وعزله
    1. استنساخ تسلسل MMLV-RT باستخدام علامة TEV-8xHis-Strep القابلة للانقسام C-terminus كما هو موضح سابقا41.
    2. امزج 100 نانوغرام من متجه التعبير في 50 ميكرولتر من خلايا DH10Bac واخلطها برفق عن طريق النقر على الأنبوب.
    3. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. صدمة حرارية للخلايا لمدة 1 دقيقة عند 42 درجة مئوية.
    4. نقل على الفور على الجليد وإضافة 400 ميكرولتر من وسط S.O.C. احتضان في 37 درجة مئوية مع رج لمدة 4 ساعات.
    5. لوحة 10 ميكرولتر و 15 ميكرولتر من الخليط على ألواح LB Agar تحتوي على ثلاثة مضادات حيوية ؛ 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين و 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين جنبا إلى جنب مع 40 ميكروغرام / مل IPTG و 100 ميكروغرام / مل X-Gal لاختيار الأزرق والأبيض.
    6. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اختر العديد من المستعمرات البيضاء ومستعمرة زرقاء واحدة كعنصر تحكم ، وأعد وضعها على ألواح أجار LB جديدة تحتوي على المضادات الحيوية المذكورة أعلاه. احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    7. بعد التأكد من النمط الظاهري الأبيض ، اختر مستعمرتين وقم بتلقيحهما في 10 مل من وسائط LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين ، و 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين في أنابيب 50 مل.
    8. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 170 دورة في الدقيقة طوال الليل. قم بتكوير الخلايا عن طريق تدويرها لأسفل عند 22,040 × جم لمدة 10 دقائق.
    9. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق من مجموعة miniprep (يجب التعامل مع هذا الحل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) ، ثم نقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    10. أضف 250 ميكرولتر من محلول التحلل ، واخلطه برفق واحتضانه لمدة 3 دقائق. أضف 350 ميكرولتر من محلول التحييد ، واقلب 2x-3x وأجهزة الطرد المركزي عند 22040 × جم لمدة 10 دقائق.
    11. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وأضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول المثلج البارد واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
    12. قم بتكوير الحمض النووي المترسب عن طريق الدوران عند 22040 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 700 ميكرولتر من 70٪ إيثانول بارد ، 2x.
    13. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دون لمس الحبيبات. اترك هواء الحبيبات يجف في غطاء التدفق الصفحي لمدة 5-10 دقائق أو حتى لا يرى سائل في الأنبوب. قم بإذابة الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB.
  2. نقل Bacmid وتضخيم الفيروس
    1. إعداد فيروس P1
      1. في لوحة زراعة الأنسجة 6 آبار ، البذور ~ 9 × 105 خلايا / بئر في 2 مل من وسط زراعة خلايا الحشرات.
      2. احتضان اللوحة لمدة ~ 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا بالتعلق.
      3. تحضير مزيج Bacmid / Fugene على النحو التالي: خلط 1 ميكروغرام من الحمض النووي Bacmid و 300 ميكرولتر من وسائط خلايا الحشرات في أنبوب واحد. في أنبوب آخر ، امزج 8 ميكرولتر من كاشف النقل و 300 ميكرولتر من وسائط خلايا الحشرات. امزج كلا الخليطين عن طريق سحب لطيف واتركه لمدة ~ 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يتشكل مركب كاشف البكميد / النقل.
      4. أضف مزيجا معقدا من bacmid (~ 210 ميكرولتر) إلى كل بئر قطرة وأغلق اللوحة بغشاء شفاف.
      5. احتضان اللوحة على حرارة 27 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
      6. خذ الوسط الذي يحتوي على الفيروس ، وأضف FBS (التركيز النهائي 2٪) ، وقم بالتصفية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية في الظلام كمخزون فيروس P1.
    2. إعداد فيروس P2
      1. نقل 50 مل من خلايا الحشرات عند 2 × 106 خلايا / مل مع 3 مل من فيروس P1 في دورق استزراع.
      2. احتضان عند 27 درجة مئوية مع الهز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 4-6 أيام حتى تصل نسبة الخلايا الميتة إلى 25٪ -30٪.
      3. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 10 دقائق وجمع الطافية التي تحتوي على الفيروس.
      4. أضف FBS إلى تركيز نهائي قدره 2٪ ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر و aliquot 1 مل لكل منهما وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية كمخزون فيروسات P2.
    3. إعداد فيروس P3
      1. نقل 100 مل من خلايا الحشرات عند 2 × 106 خلايا / مل مع 2 مل من فيروس P2 في دورق استزراع.
      2. احتضان عند 27 درجة مئوية مع الهز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 3-4 أيام حتى تصل نسبة الخلايا الميتة إلى 15٪ -20٪.
      3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 10 دقائق وجمع الطافي الذي يحتوي على الفيروس.
      4. أضف FBS إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. يمكن تخزينه في الظلام عند 4 °C لمدة 1 شهر.
  3. التعبير وتنقية MMLV-RT في خلايا الحشرات
    1. أضف 5 مل من فيروس P3 إلى خلايا الحشرات الطازجة بكثافة 2 × 106 خلايا / مل (700 مل / 2 لتر دورق) في إجمالي 6 قوارير.
    2. احصد الخلايا بعد 55-60 ساعة من ما بعد النقل عن طريق الدوران عند 7808 × جم لمدة 10 دقائق.
    3. أعد تعليق كريات الخلية في 200 مل من المخزن المؤقت للتحلل MMLV-RT (الجدول 4). مرر المحللة من خلال معطل الخلية عند 15 كيلو رطل / بوصة مربعة وأجهزة الطرد المركزي عند 22040 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    4. انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة وقم بتدويرها مرة أخرى عند 95,834 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اجمع المادة الطافية وقم بترشيحها على الجليد باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر.
    5. ابدأ تنقية البروتين باستخدام FPLC عن طريق تمرير العينة أولا عبر عمود Ni-NTA Excel 5 mL (الشكل 1B) بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة باستخدام المخزن المؤقت MMLV-RT A (الجدول 5).
    6. اغسل العمود ب 10 CV من المخزن المؤقت MMLV-RT A و 4٪ من المخزن المؤقت MMLV-RT B (الجدول 5) وقم بإزالة البروتين بالتدرج الخطي للمخزن المؤقت MMLV-RT B على 20 CV في زجاجة سعة 100 مل.
    7. مرر العينة المستخلصة عبر عمود Strep 5 mL (الشكل 1B) المتوازن مع المخزن المؤقت MMLV-RT C (الجدول 5).
    8. اغسل العمود ب 10 CV من المخزن المؤقت C MMLV-RT بنسبة 100٪ وقم بإزالة البروتين بتدرج خطي مع 20 CV من المخزن المؤقت D (الجدول 5).
    9. تحقق من الكسور المتعلمة عن طريق تنفيذ SDS-PAGE كما هو الحال في الخطوات 1.13.-1.14. وجمع الكسور التي تحتوي على MMLV-RT المنقى ليتم تحليلها ضد المخزن المؤقت لتخزين MMLV-RT (الجدول 6) عند 4 درجات مئوية.
    10. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام Nanodrop ، القسمة ، التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: قم بتصفية جميع المخازن المؤقتة للتنقية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر قبل تحميلها في نظام FPLC.

3. إعداد مكونات مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال R3T بخطوة واحدة

  1. إعداد مزيج العازلة
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت 2x لتفاعل RT-qPCR الذي يحتوي على الكواشف الموضحة سابقا في37. قم بإعداد جميع الكواشف في الماء الخالي من DNase / RNase والمزيج العازل المخزن في مجمد -20 درجة مئوية.
  2. مجموعات التمهيدي والمسبار وإعداد خليط الاشعال
    ملاحظة: يتم سرد المجسات والبادئات المستخدمة في الجدول 7. تحتوي مجموعة الإرسال المتعددة Influenza و SARS-CoV-2 على 3 مجسات و 4 مجموعات أولية أمامية وخلفية. يتم تصنيف المجسات في نهايات 5 ′ باستخدام المراسلين 6-carboxyfluorescein (FAM) ل InfA ، تكساس Red-XN ل SARS-CoV-2 (جين N) و Yakima Yellow ل InfB. وتحتوي المجموعة المتعددة الإرسال MERS-CoV وSARS-CoV-2 على 3 مجسات و3 مجموعات أولية أمامية وخلفية. يتم تصنيف المجسات أيضا في نهايات 5 باستخدام مراسلي Texas Red-XN ل MERS-CoV (جين ORF1a) ، VIC ل MERS-CoV (جين UpE) و 6-carboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (جين N).
    1. قم بإعداد مزيج تمهيدي يحتوي على جميع البادئات والمجسات المدرجة في الجدول 7 بتركيز نهائي يبلغ 6.7 ميكرومتر لكل برايمر أمامي وخلفي و 1.25 ميكرومتر لكل مسبار في أنبوب سعة 1.5 مل. قم بتخزين مزيج البرايمر في الفريزر على حرارة -20 درجة مئوية. استخدم المخزن المؤقت للشطف لتعويض الحجم المطلوب.
  3. إعداد مزيج الانزيم
    1. تحضير مزيج إنزيم Taq polymerase (30 U / μL) و MMLV-RT (60 نانوغرام / ميكرولتر) في مخزن تخزين Taq polymerase كما هو موضح في الجدول 3 لتعويض الحجم المطلوب. نفذ هذه الخطوة على الثلج وقم بتخزين مزيج الإنزيم عند -20 درجة مئوية.
  4. قالب الحمض النووي الريبي
    1. إعادة تعليق الحمض النووي الريبي الاصطناعي ل SARS-CoV-2 و Influenza A H1N1 و Influenza A H3N2 و Influenza B و MERS-CoV بشكل منفصل في 100 ميكرولتر من 1x Tris-EDTA buffer (10 mM Tri-Cl و 1 mM EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لعمل مخزون من 1 × 106 نسخ RNA / ميكرولتر.
    2. خلط الحمض النووي الريبي الاصطناعي ل RT-qPCR في التكوينات التالية: 1) SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من كل مخزون فيروس إلى حجم 50 ميكرولتر لعمل 1 × 105 نسخ RNA / ميكرولتر ؛ 2) SARS-CoV-2 ، MERS-CoV عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من كل مخزون فيروس إلى حجم 50 ميكرولتر لعمل 1 × 105 نسخ RNA / ميكرولتر. قم بعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لكل خليط من الحمض النووي الريبي الاصطناعي تتراوح من 1 × 105 نسخ RNA / ميكرولتر إلى 10 نسخ RNA / ميكرولتر.
      ملاحظة: تأكد من استخدام الماء الخالي من DNase / RNase المثلج البارد لتحضير التخفيف التسلسلي للقوالب.

4. اختبار RT-qPCR بخطوة واحدة لفيروس SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B و SARS-CoV-2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية بخطوة واحدة RT-qPCR

ملاحظة: قم بتطهير أسطح محطة العمل واستخدم قالب لوحة 96 بئرا لتخطيط تخطيط لوحة PCR.

  1. تحضير صفيحة 96 بئرا
    1. ذوبان الجليد 2x العازلة ومزيج التمهيدي. الحفاظ على مزيج الانزيم على الجليد.
    2. لكل بئر ، أضف 10 ميكرولتر من مزيج المخزن المؤقت 2x ، و 1.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ، و 1 ميكرولتر من مزيج الإنزيم ، و 6.5 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase ، و 1 ميكرولتر من خليط الحمض النووي الريبي المقابل الذي يحتاج إلى اختبار. الحجم النهائي في كل بئر هو 20 ميكرولتر. يرجى الرجوع إلى التخطيط المعد للمساعدة في هذه الخطوة.
      ملاحظة: يوصى بعمل مزيج رئيسي بناء على عدد التفاعلات التي تحتوي على جميع الكواشف باستثناء عينة الحمض النووي الريبي لتجنب تحيز الماصة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء التفاعلات في نسختين أو ثلاث نسخ لتجنب الأخطاء الفنية.
    3. ختم اللوحة مع ختم لوحة PCR لاصقة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 1 دقيقة لجمع كل السوائل في الجزء السفلي من اللوحة. تأكد من أن كل بئر لها نفس حجم السائل وخالية من الفقاعات قبل نقل العينات إلى جهاز qPCR.
      ملاحظة: يجب إعداد جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد.
  2. برنامج PCR
    1. افتح برنامج آلة qPCR في الوقت الفعلي واختر الخصائص التجريبية التالية:
      نوع الكتلة: سريع 96 بئر (0.1 مل)
      إعداد التجربة: منحنى قياسي
      الكواشف: كواشف TaqMan
      تشغيل الخصائص: قياسي.
    2. حدد جميع الأهداف الجينية وصبغة مراسلها كما هو موضح في الجدول 7. بالإضافة إلى ذلك ، حدد أسماء العينات لكل تفاعل ليتم اختباره لتسهيل تحليل منحنيات التضخيم.
    3. قم بتعيين الأهداف والعينات لتخطيط لوحة البرنامج بناء على لوحة 96 بئرا.
    4. اضبط برنامج الدورة التالي في أداة PCR على النحو التالي:
      55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
      40 دورة: 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
      94 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      68 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      68 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ هنا الحصول على مضان.
    5. انقل اللوحة إلى آلة qPCR في الوقت الفعلي وضعها في الحامل لضمان الاتجاه الصحيح للوحة وبدء التشغيل.
    6. اختر موقع الملف لحفظ البيانات التجريبية.
  3. تحليل البيانات
    1. من الضروري أولا فحص مخططات التضخيم التي ينتجها برنامج qPCR. تحليل حد الكشف لتقييم الحد الأدنى لتركيز الحمض النووي الريبي الذي يمكن اكتشافه.
    2. ارسم سجل رقم نسخة الحمض النووي الريبي على المحور السيني ومتوسط قيمة Ct المقابلة على المحور ص لتقييم حساسية الفحص. يشير المنحدر و R2 إلى موثوقية وكفاءة التفاعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدم كبير في النهج التشخيصي للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة باستخدام نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل21،22،23،24،25. ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه التطورات، فإن النهج المتعدد الإرسال، الذي يسمح باكتشاف فيروسات متعددة في اختبار واحد، لم يتم تنفيذه على نطاق واسع، لا سيما في منصة RT-qPCR. تم تنفيذ هذه الطريقة بنجاح باستخدام فيروسات الحمض النووي الريبي الاصطناعية والتحسين الداخلي لمكونات التفاعل37. تم تقييم خصوصية وحساسية وموثوقية الفحص التشخيصي على أنها عالية ، من خلال استخدام حد تحليل الكشف. يمكن للنهج المقدم أن يحسن بشكل كبير من كفاءة ودقة تشخيص فيروسات الجهاز التنفسي ، مما يقلل من الحاجة إلى اختبارات متعددة ويقلل من مخاطر التشخيص الخاطئ كما هو الحال في43. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لاستكشاف فوائد هذا النهج باستخدام عينات المرضى وتشجيع اعتماده في الممارسة السريرية.

التعبير عن وتنقية بوليميراز Taq DNA الموسوم بالهيستيدين
استنادا إلى البروتوكول المعمول به لتعبير وتنقية Taq DNApolymerase 44 ، تم بناء بلازميد Taq DNA polymerase الموسوم بالهيستيدين N-terminal تحت سيطرة محفز للصدمة الباردة لتسهيل عملية التعبير والتنقية كما هو موضح أعلاه (الشكلان 1A والشكل 2A). وبالتالي ، بمجرد تغيير تركيز IPTG ودرجة الحرارة ، يمكن التحكم في مستوى التعبير عن هذا البناء الجديد بسهولة. أظهرت حضانة الخلايا التي تحتوي على بلازميد Taq DNA polymerase عند 16 درجة مئوية مع 1 mM IPTG تعبيرا محسنا عن بوليميراز الحمض النووي His-Taq. بالإضافة إلى ذلك ، تطلب البروتوكول44 الذي تم إنشاؤه سابقا خطوات ترسيب البولي إيثيلين (PEI) المستهلكة للوقت ، والتي يمكن تخطيها مع البنية المستخدمة هنا لأن نقاء المنتج النهائي لم يتأثر ويمكن مقارنته ب Taq polymerase المتاح تجاريا (الشكل 2B). هاجر Taq polymerase المنقى بشكل أبطأ من التجاري بسبب وجود الببتيدات الرابط بين الإنزيم وعلامة الهستيدين في N-terminus. تم إنتاج Taq DNA polymerase بنجاح مع 0.98 مجم / لتر من مزرعة الإشريكية القولونية من البروتين النقي.

التعبير عن وتنقية النسخ العكسي MMLV المزدوج الموسوم ب His- and Strep
تم استخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي للتعبير عن MMLV-RT مع علامة C مزدوجة هي و Strep-tag في خلايا الحشرات (Sf9) كما هو موضح في الشكل 2A. أظهرت دراسة سابقة أن MMLV-RT الموسوم ب C يظهر نشاطا أعلى حيث تم تصنيع كل من البروتين الموسوم N-terminally والبروتين الموسوم C في ديدان القز باستخدام نظام ناقل تعبير دودة القز والفيروس البقعي (دودة القز-BEVS)41. لإنتاج بروتين MMLV-RT متجانس ، تم استخدام نفس الاستراتيجيات والبروتوكول كما هو موضح في الدراسة المذكورة أعلاه. نتيجة لذلك ، تم تحقيق تعبير محسن وأكثر من 95٪ بروتين نقي مع عائد 7.5 مجم / لتر من زراعة خلايا الحشرات كما هو موضح في نتيجة هلام SDS-PAGE (الشكل 2C).

تحسين وتوحيد qRT-PCR متعدد الإرسال
تم تجميع اختبار RT-qPCR متعدد الإرسال محسن ومتطور داخليا وإنتاجه بنجاح بعد جولات من تحسين مزيج المخزن المؤقت والتمهيدي للكشف عن ثلاثة فيروسات تنفسية شائعة مختلفة في وقت واحد (الشكل 3)37. تم تصميم المجموعة الأولى لاستهداف جين SARS-CoV-2 N ، وجين الأنفلونزا A H1N1 و H3N2 ، وجين الأنفلونزا B. والمجموعة الثانية مخصصة لجين SARS-CoV-2 N وجينات MERS ORF1a و upE. وبالتالي ، يمكن لكلتا المجموعتين اكتشاف الأهداف الثلاثة بنجاح وفي وقت واحد مثل سير العمل المعروض هنا (الشكل 3). تم تضخيم عينات الحمض النووي الريبي الاصطناعية لكل من الفيروسات المستخدمة في هذا البروتوكول مما يشير إلى إمكانية استخدام مثل مجموعة متعددة الإرسال للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. تتشابه حساسية هذا الاختبار التشخيصي مع النتائج المبلغ عنها سابقا في عينات المرضى. في الحالات التي يظهر فيها المرضى أعراضا شبيهة بأعراض الأنفلونزا ، أظهر استخدام RT-qPCR متعدد الإرسال في الوقت الفعلي نتائج مماثلة مع اختبار SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا Bالمضاعف 45.

حساسية وحدود الكشف عن مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال الداخلية تجاه فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة
تم تقييم فعالية المجموعة متعددة الإرسال الداخلية باستخدام مجموعتين من مزيج التمهيدي والحمض النووي الريبي الاصطناعي المقابل لكل مجموعة كما هو موضح في سير عمل RT-qPCR متعدد الإرسال (الشكل 3). باستخدام كل مزيج تمهيدي مع تخفيف تسلسلي 10 أضعاف لكل مزيج RNA اصطناعي يتراوح من 10 إلى 105 نسخ / ميكرولتر كقالب ، يمكن تحديد الحساسية والنوعية وحد الكشف عن كل من RT-qPCR متعدد الإرسال المطور باستخدام تحليل المنحنى القياسي. يتم ذلك في ثلاث نسخ متماثلة مستقلة لكل اختبار ، لتأكيد فعالية واتساق مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال. نتيجة لذلك ، يمكن للمجموعتين اللتين تم تطويرهما هنا تضخيم جميع الجينات المستهدفة الثلاثة بنجاح في وقت واحد مع ما يصل إلى 10 نسخ / تفاعل RNA كما يتضح من منحنى التضخيم وحد الكشف (LoD) (الشكل 4 والشكل 5). تم استخدام قيم الميل و R2 لكل منحنى لتقييم كفاءة المقايسات الفردية (الشكل 4 والشكل 5). قدمت قيم R2 تقديرا لجودة الملاءمة الخطية لنقاط البيانات. في مقايسة qPCR الفعالة ، يجب أن يكون R2 قريبا جدا من 0.90 أو أكبر منه. وكانت كفاءة التضخيم في معايرات الأنفلونزا A والإنفلونزا B وSARS-CoV-2 أو فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية وفيروس كورونا-سارس-2 أعلى من 99٪ لجميع مجموعات التمهيدي (الشكل 4 والشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، تثبت أشرطة الخطأ الصغيرة قابلية استنساخ كل مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال. من المهم ملاحظة أن كلتا المجموعتين المتعددتين لم تظهرا أي تكوين ديمر أولي نظرا لعدم وجود تضخيم مع التحكم السلبي (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، فإن تصميم كلتا المجموعتين أدى إلى تضخيم جميع الجينات المستهدفة بنجاح مع الموثوقية والنوعية والحساسية.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على مجموعة مجموعة RT-qPCR متعددة الخطوات ذات الخطوة الواحدة. يبدأ تجميع المجموعة بالتعبير عن الإنزيمات اللازمة وتنقيتها ، Taq DNA polymerase و MMLV النسخ العكسي. يجب تمرير كلا الإنزيمين عبر عمودين كما هو موضح. ثانيا ، بعد التنقية ، تم تحسين ظروف التفاعل وبرنامج الدورة الحرارية مما أدى إلى الظروف المثلى لمجموعة الاختبار المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تركيبات البلازميد ونتائج تنقية His-Taq Pol و C-His/Strep MMLV-RT. (أ) التمثيل التخطيطي لبلازميدات التعبير His-Taq Pol المؤتلف وبلازميدات التعبير C-His/Strep MMLV-RT. الاختصارات: مروج CSPA - بروتين الصدمة الباردة A المروج ؛ RBS - موقع ربط الريبوسوم ؛ 6x له - علامته مع ستة هيستيدين ؛ TEE - عنصر تعزيز متعدية ؛ Taq ORF - إطار قراءة مفتوح Taq Pol ؛ Polh - مروج متعدد السطوح ؛ MMLV-RT ORF - MMLV-RT إطار قراءة مفتوح ؛ TEV - موقع استهداف الأنزيم البروتيني لفيروس الحفر ؛ 8x له - علامته مع ثمانية هستيدين ؛ بكتيريا - علامة جردية. بوليا أ - SV40 إشارة بولي أدينيل متأخرة. (B) تحليل SDS-PAGE ل His-Taq Pol معبرا عنه في خلايا الإشريكية القولونية BL21 (DE3) وبوليميراز Taq. (C) تحليل SDS-PAGE ل C-His/Strep MMLV-RT المنقى المعبر عنه في خلايا Sf9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي لمجموعتي RT-qPCR المحسنة والمعيارية والمطورة بخطوة واحدة جنبا إلى جنب مع مكونات التفاعل. يتكون كل تفاعل متعدد الإرسال من dNTPs ، ومزيج المخزن المؤقت ، ومزيج الإنزيم ، ومزيج التمهيدي متعدد الإرسال ، وقالب الحمض النووي الريبي الاصطناعي المراد اختباره. (أ) الأنفلونزا A / B ، مجموعة SARS-CoV-2 و (ب) MERS ORF1a / UPE ، SARS-CoV-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: منحنيات التضخيم وحد الكشف عن مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال من نوع A / B و SARS-CoV2 . أجريت منحنيات التضخيم ل RT-qPCR متعدد الإرسال باستخدام خليط الحمض النووي الريبي الاصطناعي مع تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف (10 إلى10 5 نسخ / ميكرولتر) مع جميع الأهداف (أ) الأنفلونزا A و (C) الأنفلونزا B و (E) SARS-CoV-2. تم إجراء التفاعلات في ثلاث نسخ ، مع إظهار نسخة واحدة كمثال. تم تحديد حد الكشف عن (B) الأنفلونزا A و (D) الأنفلونزا B و (F) SARS-CoV-2 من خلال رسم متوسطثلاث قيم C t مكررة مقابل رقم نسخة السجل. تم حساب معامل التحديد (R2) ومعادلة منحنى الانحدار الخطي وإظهارها في كل لوحة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بين ثلاثة نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: منحنيات التضخيم وحد الكشف عن مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال بخطوة واحدة لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ORF1a / upE و SARS-CoV2. تم إجراء منحنيات التضخيم ل RT-qPCR متعدد الإرسال باستخدام خليط RNA اصطناعي مع تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف (10 إلى 105 نسخ / ميكرولتر) مع جميع الأهداف (A) MERS ORF1a و (C) MERS upE و (E) SARS-Cov-2. تم إجراء التفاعلات في ثلاث نسخ ، مع إظهار نسخة واحدة كمثال. تم تحديد حد الكشف عن (B) MERS ORF1a و (D) MERS upE و (F) SARS-CoV-2 من خلال رسم متوسطثلاث قيم C t مكررة مقابل رقم نسخة السجل. تم حساب معامل التحديد (R2) ومعادلة منحنى الانحدار الخطي وإظهارها في كل لوحة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بين ثلاثة نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة مكونات المخزن المؤقت لتحلل بوليميراز تاك. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مخازن تنقية Taq polymerase. قائمة المكونات العازلة اللازمة لتنقية بوليميراز Taq DNA ثنائي العمودين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: المخزن المؤقت لتخزين Taq polymerase. قائمة المكونات العازلة المطلوبة لغسيل بوليميراز الحمض النووي Taq بعد التنقية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: قائمة مكونات المخزن المؤقت للتحلل MMLV-RT. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: مخازن تنقية MMLV-RT. قائمة مكونات المخزن المؤقت اللازمة لتنقية العمود المزدوج ل MMLV-RT. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: المخزن المؤقت للتخزين MMLV-RT. قائمة المكونات العازلة اللازمة لغسيل الكلى MMLV-RT بعد التنقية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 7: معلومات البادئات والمجسات. معلومات تسلسل البادئات والمجسات اللازمة لكل مزيج التمهيدي متعدد الإرسال. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك عبء اقتصادي ثقيل على نظام الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ناتج عن ارتفاع معدلات العدوى والوفيات بسبب انتشار فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة مثل SARS-CoV-2 و Influenza A / B ومتغيرات MERS-CoV12،19،20. بدافع من الشعور بالمسؤولية تجاه تخفيف هذا العبء ، أدركنا الحاجة إلى اختبار تشخيصي سريع ودقيق ويمكن الوصول إليه مثل RT-qPCR للتمييز بين هذه الفيروسات الشائعة في اختبار واحد. وبفضل الطبيعة المتعددة لتفاعل البوليميراز المتسلسل qRT-PCR، من الممكن تشخيص وتمييز فيروس كورونا-سارس-2 عن فيروسات الجهاز التنفسي الأخرى، مثل فيروسات الأنفلونزا A/B وفيروسات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. في النهاية ، يمكن تحقيق علاج أفضل وأكثر دقة للمرضى باستخدام الفحص المتعدد الحالي46. للتلخيص ، تصف هذه الدراسة تحقيق اختبار RT-qPCR متعدد الإرسال بخطوة واحدة يمكن أن يستهدف مجموعتين مختلفتين. تتكون كل مجموعة من ثلاثة فيروسات تنفسية مختلفة للحد من انتشار هذه الفيروسات المعدية وتقليل العبء الاقتصادي على نظام الرعاية الصحية.

يمكن أن تستهدف مجموعة RT-qPCR المتعددة الحالية مجموعتين من فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة (SARS-CoV-2 ، الأنفلونزا A / B) و (SARS-CoV-2 ، MERS UpE / ORF1a). البروتوكول الموصوف سهل ومباشر للمتابعة وأرخص بكثير من مجموعات RT-qPCR ذات الخطوة الواحدة المتوفرة تجاريا. ميزة أخرى كانت الخصائص المتعددة للمجموعة التي يمكن أن تستهدف أهدافا جينية فيروسية متعددة من خلال استخدام مجموعات مختلفة من المسبار والتمهيدي. وبالتالي ، فإن تعدد استخدامات وبساطة المجموعة يتيح التنفيذ المباشر في الإعدادات المحدودة الموارد. كما أن المجموعة مناسبة لإجراء اختبارات مكثفة تؤدي إلى تشخيص دقيق ودقيق يمكن أن يساعد في الحد من انتشار فيروسات الجهاز التنفسي المتعددة والعدوى المشتركة لها.

تم إجراء المقايسات الأولية لضمان تضخيم جميع الأهداف بنجاح وبدقة عالية للحد من تكوين منتجات غير محددة. أولا ، مررنا بعدة جولات من التحسين لمكونات المزيج العازل وتركيزات كل منها في المزيج العازل. ثانيا ، قمنا بتحسين البادئات وتركيزاتها المقابلة في كل من مزيج التمهيدي وتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. ثالثا ، قمنا بتحسين تركيبة مزيج الإنزيم لزيادة نشاطه وتقليل التأثير المثبط ل MMLV-RT على نشاط Taq polymerase47. رابعا ، قمنا بتحسين ظروف الدورة الحرارية مع مراعاة قيود الاستقرار الحراري لكلا الإنزيمين. من خلال دمج التحسينات المذكورة أعلاه ، تمكنت النسخة المحسنة من مجموعة RT-qPCR متعددة الإرسال المعروضة هنا من اكتشاف ما يصل إلى 10 نسخ / تفاعلات RNA بدقة عالية وحساسية وقابلية استنساخ.

يجب مراعاة بعض الاحتياطات لضمان الكفاءة العالية والتنفيذ الناجح لمقايسة RT-qPCR متعددة الإرسال ، لمنع المثبطات وتجنب أخطاء السحب. نظرا لأن كل منشأة فريدة من نوعها في إعدادها وأجهزتها ، فإليك بعض الخطوات التي قد تساعد أثناء بناء مثل هذه المجموعة: أولا ، يجب ارتداء القفازات في جميع الأوقات لتجنب وجود أي تلوث ومثبط تفاعل البوليميراز المتسلسل. ثانيا ، تأكد من استخدام أطراف مرشح مقاومة للهباء الجوي واستخدام ماصة معايرة. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من استخدام مياه PCR. سيساعد استخدام التحكم بدون قالب في التحقق من وجود أي تلوث. من المهم ملاحظة أن المزيج الرئيسي يحتاج إلى التحضير لجميع النسخ المكررة لتجنب التلوث المحتمل واختلاف السحب. يجب مراعاة نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأخرى للحفاظ على جودة المسبار مثل تسعير المخزون وتجنب استخدام الماء لتخفيفه. من المهم اتباع توصيات الشركة المصنعة بشأن تخزين وتخفيف التمهيدي والتحقيق المستخدم. وبالتالي ، ستساعد هذه النصائح البسيطة في الحفاظ على نجاح مقايسة RT-qPCR متعددة الإرسال وضمان كفاءتها العالية.

على الرغم من أن فحوصات RT-qPCR متعددة الإرسال التي تم تطويرها في هذا البحث قد أظهرت نتائج جيدة عند اختبارها باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي الاصطناعي ، إلا أن فعاليتها في بيئة سريرية حقيقية لا تزال بحاجة إلى التقييم والتحقق من صحتها. لسوء الحظ ، فإن ندرة العينات السريرية تجعل من الصعب تحديد خصائص الفحص وحساسيته للفيروسات المدرجة في هذا التحقيق. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن LOD (حد الكشف) ، والذي يشير إلى الحد الأدنى لعدد النسخ التي يمكن اكتشافها في 100٪ من العينات ، تم إنشاؤه من خلال الانحدار الخطي المثبت إحصائيا. هذا يوفر إمكانية للتشخيص السريري وهو نتيجة مهمة للبحث.

تم تطوير مقايسة RT-qPCR متعددة الإرسال بخطوة واحدة وقائمة على المسبار بنجاح والتحقق من صحتها بفعالية عالية في هذه الدراسة. يمكن اكتشاف SARS-CoV-2 بسهولة وتمييزه عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة الأخرى كما هو موضح أعلاه بكفاءة وموثوقية عالية في أنبوب اختبار واحد فقط. وبالتالي ، فإن الاعتماد على هذه الميزة متعددة الإرسال سيساعد في زيادة إنتاجية التشخيص وتوفير الوقت والتكلفة والعينة مقارنة بأساليب الاختبار الأخرى و PCR الفردي. بشكل عام ، فإن احتمال انتشار فيروسات الجهاز التنفسي معا مرتفع وسيكون RT-qPCR متعدد الخطوات بخطوة واحدة مفيدا للغاية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية من خلال التمويل الأساسي والتحدي الوطني الكبير (NTGC) ل SMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 201 ، Taq polymerase ، MMLV-RT ، تعبير البروتين ، COVID-19 ، SARS-CoV-2 ، الأنفلونزا A / B ، فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ، تعدد الإرسال RT-qPCR
تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter