Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Yaygın solunum yolu virüsleri için iki prob tabanlı kurum içi tek adımlı RT-qPCR kiti sunuyoruz. İlk test SARS-CoV-2 (N), İnfluenza A (H1N1 ve H3N2) ve İnfluenza B içindir. İkincisi SARS-Cov-2 (N) ve MERS (UpE ve ORF1a) içindir. Bu testler herhangi bir özel laboratuvarda başarıyla uygulanabilir.

Abstract

Koronavirüs hastalığı 2019'a (COVID-19) neden olan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), genel halk sağlığı için ciddi bir tehdittir. Grip mevsimlerinde, SARS-CoV-2 ve diğer solunum yolu virüslerinin yayılması, yönetilmesi zor olan popülasyon çapında bir solunum yolu hastalığı yüküne neden olabilir. Bunun için, solunum yolu virüsleri SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B ve Orta Doğu solunum sendromu (MERS-CoV), özellikle duyarlı popülasyonlar, bulaşma şekli ve klinik sendromlar gibi benzer epidemiyolojik faktörleri paylaşan SARS-CoV-2, Influenza A ve Influenza B söz konusu olduğunda, önümüzdeki sonbahar ve kış mevsimlerinde dikkatle izlenmelidir. Hedefe özgü tahliller olmadan, benzerlikleri nedeniyle bu virüslerin vakaları arasında ayrım yapmak zor olabilir. Buna göre, bu viral hedefleri kolayca ayırt edebilen hassas ve hedefe yönelik bir multipleks tahlil, sağlık pratisyenleri için faydalı olacaktır. Bu çalışmada, SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin aynı anda tespiti için kurum içinde geliştirilen bir R3T tek adımlı RT-qPCR kitini kullanarak gerçek zamanlı bir ters transkriptaz-PCR tabanlı test geliştirdik. Sentetik RNA'larının en az 10 kopyasıyla, SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B ve MERS-CoV hedeflerini aynı anda %100 özgüllükle başarılı bir şekilde tanımlayabiliriz. Bu tahlilin doğru, güvenilir, basit, hassas ve spesifik olduğu bulunmuştur. Geliştirilen yöntem, hastanelerde, tıp merkezlerinde ve tanı laboratuvarlarında optimize edilmiş SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV tanı testi olarak kullanılabileceği gibi araştırma amaçlı da kullanılabilir.

Introduction

Devam eden koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)1 olarak bilinen yeni koronavirüs neden olur. SAR-CoV-2'nin güçlü bulaşıcılığı ve hızlı bulaşma kapasitesi nedeniyle, COVID-19 salgını Çin'in Wuhan Şehrinde ortaya çıktı ve tüm dünyaya hızla yayıldı. Bu sonunda solunum sıkıntısı belirtilerinin başlamasına ve hattaölüme yol açtı 2,3,4. COVID-19, 213'ten fazla ülkede pandemi ilan edildi ve farklı araştırma çalışmaları tarafından yayınlanan makalelerin kanıtladığı gibi, teyit edilen vakaların sayısında keskin bir artış bekleniyor 3,5. COVID-19, öncelikle enfekte bireylerin çevreye saldığı ve daha sonra soluma veya kontamine yüzeylerle yakın temas yoluyla savunmasız bireylere maruz kaldığı küçük solunum damlacıkları yoluyla bulaşır. Bu damlacıklar göz, ağız veya burun mukozası ile temas ettiğinde, bir kişi enfekte olabilir6. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yayınlanan istatistikler, dünya çapında 76 milyondan fazla doğrulanmış pandemi vakası olduğunu ve şaşırtıcı bir şekilde 7 milyon ölüm olduğunu göstermektedir7. Bu nedenle Birleşmiş Milletler, COVID-19 hastalığının neden olduğu pandemiyi, dünya çapında milyarlarca insanın yaşamı üzerindeki doğrudan etkisi ve geniş kapsamlı ekonomik, çevresel ve sosyal etkileri nedeniyle bir felaket olarak sınıflandırdı.

Kapsamlı testler, erken teşhis, temas takibi ve vaka izolasyonu dahil olmak üzere halk sağlığı girişimlerinin tümünün bu salgını kontrol altında tutmada çok önemli olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Kış ayları, COVID-19 benzeri semptomlarla birlikte İnfluenza A ve B gibi diğer solunum yolu virüslerinin dolaşımını artıracak ve COVID-19 vakalarını erkenden tespit etmeyi, izlemeyi ve izole etmeyi zorlaştıracaktır. Her yıl, İnfluenza A ve B salgını sonbaharın sonlarında veya Ocak ayının başlarında öngörülebilir bir mevsimsellik ile başlar12. SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüsleri tarafından çok sayıda epidemiyolojik özellik paylaşılmaktadır. Ayrıca, çocuklar, yaşlılar, bağışıklığı baskılanmış ve astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kalp ve böbrek yetmezliği veya diyabet gibi kronik komorbiditeleri olan bireyleri içeren duyarlı popülasyonlarda benzerliklerin paylaşılması12,13. Bu virüsler sadece savunmasız popülasyonları değil, aynı zamanda temas ve solunum damlacıklarının bulaşma yollarını da paylaşır14. Grip mevsimi yaklaşırken hastaların bu solunum yolu virüslerinden birden fazlasına yakalanabileceği tahmin edilmektedir14. Bunun için semptomatik hastalarda izole edilmeden önce SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüslerinin taranması yapılmalıdır. Üç virüs (SARS-CoV-2, Influenza A ve Influenza B) için ayrı testler yapmak, nükleik asit ekstraksiyonu ve teşhisi için küresel kaynak eksikliği nedeniyle mümkün değildir. Hepsini tek bir reaksiyonda taramak için bir yöntem veya test geliştirilmelidir.

Orta Doğu solunum sendromu (MERS)-CoV, insan koronavirüs (CoV) ailesinin bir üyesidir. İlk MERS-CoV virüsü izolatları, Eylül 2012'de akut solunum sorunları nedeniyle ölen Suudi Arabistan'da hastanede yatan bir hastadan geldi15. MERS-CoV için belirgin bir rezervuar konakçısının tek hörgüçlü develer olduğunu gösteren kanıtlar vardır. Enfekte tek hörgüçlü develerden gelen virüslerin zoonotik olduğu ve bu nedenle insanları enfekte edebileceği kanıtlanmıştır16,17. Bu virüsle enfekte olan insanlar, yakın temas yoluyla başkalarına yayabilir18. 26 Ocak 2018 itibariyle, dünya çapında 750 ölüm dahil olmak üzere laboratuvarca doğrulanmış2143 MERS-CoV enfeksiyonu vakası olmuştur 19. En tipik MERS-CoV semptomları öksürük, ateş ve nefes darlığıdır. MERS-CoV enfeksiyonlarının ayrıca pnömoni, ishal ve gastrointestinal hastalık semptomları sergilediği bildirilmiştir20. Şu anda, MERS-CoV için ticari bir aşı veya spesifik bir tedavi mevcut değildir. Bu nedenle, yaygın MERS-CoV salgınlarını önlemek ve MERS-CoV'yi SARS-CoV-2 hastalığından ayırt etmek için hızlı ve kesin tanı şarttır.

Bugüne kadar, bu virüsleri tespit etmek için multipleks RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 ve CRISPR/Cas329, yanal akış immünolojik testi30, kağıt tabanlı biyomoleküler sensörler31, bir kapta SHERLOCK testi 32, DNA aptamer33, döngü aracılı izotermal gibi birçok yaklaşım önerilmiştir amplifikasyon (LAMBA)19,34, vb. Yukarıda belirtilen yöntemlerin her birinin, duyarlılık ve özgüllük açısından benzersiz yararları ve sakıncaları vardır. Bu yöntemler arasında nükleik asit amplifikasyonuna dayalı test: multipleks qRT-PCR, en yaygın olanıdır ve SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve MERS-CoV tanısı için altın standart olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, standart bükümlü sentetik viral RNA'ları kullanarak SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin etkili, doğru ve eş zamanlı tespiti için çeşitli primer kombinasyonları ve probları tasarladık ve değerlendirdik. MERS-CoV veya SARS-CoV-2 hedef genleri için geliştirilen çoğullanmış testler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilmektedir. Bu genler genellikle bir replikasyon/transkripsiyon kompleksinin (RTC) oluşumuna katkıda bulunan proteinleri ve kompleksleri kodlar.35 MERS-CoV testi için kullanılan açık okuma çerçevesi 1a (ORF1a) içindeki bölge gibi. Ek olarak, yapısal proteinler, sırasıyla MERS-CoV ve SARS-Cov-2 testleri için kullanılan zarf geninin yukarı akış bölgesi (upE) ve nükleokapsid geni (N) gibi tanısal testlerde kullanılan genler tarafından kodlanır35,36. Virüslerin tespiti için RT-qPCR'yi oluşturmak için kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kitini kullandık37. R3T tek adımlı RT-qPCR kitimizin ve primer setlerimizin virüs tespiti, duyarlılığı, özgüllüğü ve dinamik aralığı, standart bükümlü sentetik RNA'ların 10 kat seri dilüsyonları kullanılarak test edildi ve değerlendirildi. En düşük pratik saptama sınırı, reaksiyon başına yaklaşık 10 transkript kopyasıydı. Sonuç olarak, kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kiti ve primer/prob setleri, SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin rutin eşzamanlı teşhisi için başarıyla kullanılabilir ve uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taq polimeraz ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Enzimin C-terminalinde katlanabilir bir heksa-histidin etiketine sahip bir plazmit oluşturun.
  2. Ekspresyon vektörünün 50 ng'sini standart protokol38'i izleyerek E. coli BL21-(DE3) suşuna dönüştürün.
  3. Dönüştürülmüş hücreleri, her biri 37 ° C'de 2 L 2YT ortam suyu içeren dört adet 6 L'lik şişede, 0.8'lik OD 600'e veya 6.4 x 108 hücre numarasına ulaşılana kadar 170 rpm'de çalkalayarak aşılayın.
  4. 0.5 mM izopropil-β-d-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile Taq polimeraz ekspresyonunu indükleyin ve ayrıca çalkalama ile 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe edin.
  5. Hücreleri 4 °C'de 7808 x g'da 10 dakika döndürerek hasat edin. Peletleri 200 mL buz gibi soğuk bir Taq polimeraz lizis tamponunda (Tablo 1) 5 mL / g hücre peletinde yeniden süspanse edin.
  6. Hücreleri lizozim (2 mg / mL lizis tamponu) ve proteaz inhibitörleri ile 45 dakika inkübe edin ve daha sonra lizatı 30 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve hücre kalıntılarını ayırmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'de santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı 85 °C'de 15 dakika ısıtın. 4 °C'de 1 saat boyunca 95.834 x g'da döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0.45 μm filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
  8. Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) kullanarak, numuneyi önce Taq polimeraz tamponu A kullanarak 4 mL/dak akış hızında bir Ni-NTA HP 5 mL kolonundan geçirerek protein saflaştırması gerçekleştirin (Tablo 2; Şekil 1A).
  9. 10 kolon hacmi (CV) Taq polimeraz tamponu A ve %4 Taq polimeraz tamponu B ile yıkayın (Tablo 2). 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde Taq polimeraz Tampon B kullanarak bağlı proteini doğrusal bir gradyan ile elute edin.
  10. 100 mL'lik şişedeki eluenti, Taq polimeraz tamponu C kullanarak 4 mL/dk'da 5 mL'lik bir katyon değişimi kolonundan geçirin (Tablo 2; Şekil 1A).
  11. 20 CV %100 Taq polimeraz tamponu C ve %5 Taq polimeraz tamponu D ile yıkayın (Tablo 2).
  12. %5'ten %100'e kadar başlayan Taq polimeraz tamponu D (Tablo 2) kullanarak doğrusal bir gradyan ile elute edin.
  13. SDS-PAGE jel elektroforezi 39 ve ardından daha önce tarif edildiği gibi jel boyama 40 gerçekleştirerek ayrıştırılmış fraksiyonları kontrol edin. Kısaca, her fraksiyondan 10 μL alın ve eşit hacimde 2x SDS yükleme boyası ekleyin. Numuneyi 90°C'de 10 dakika denatüre edin. Numuneleri %10 SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve jeli 200 V'ta 25 dakika çalıştırın.
  14. Saflaştırılmış Taq polimeraz içeren tüm fraksiyonları toplayın ve 4 °C'de taq polimeraz depolama tamponuna (Tablo 3) karşı diyalize edin. Kısaca, 2 L saklama tamponu hazırlayın ve diyaliz kasetini nemlendirmek için 2 dakika tampona daldırın. Toplanan fraksiyonları bir iğne kullanarak diyaliz kasetine enjekte edin ve bir gece diyaliz tamponunda karıştırıcıda 200 rpm'de bırakın.
  15. Diyalizden sonra, bir spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün, 10 μL'lik alikotlar yapın, sıvı nitrojende dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

2. Böcek hücresi ekspresyon sisteminde MMLV-RT ekspresyonu ve saflaştırma

  1. Bacmid DNA üretimi ve izolasyonu
    1. MMLV-RT dizisini, daha önce açıklandığı gibi bir C-terminali bölünebilir TEV-8xHis-Strep etiketiyle klonlayın41.
    2. 100 ng ekspresyon vektörünü 50 μL DH10Bac hücresine karıştırın ve tüpe vurarak hafifçe karıştırın.
    3. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 42 °C'de 1 dakika boyunca ısı şoku uygulayın.
    4. Hemen buz üzerine aktarın ve 400 μL SOC ortamı ekleyin. 37 °C'de çalkalayarak 4 saat inkübe edin.
    5. Plaka 10 μL ve 15 μL karışımın üç antibiyotik içeren LB Agar plakaları üzerinde; Mavi-beyaz seçim için 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin ile birlikte 40 μg/mL IPTG ve 100 μg/mL X-Gal.
    6. Plakaları 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Kontrol olarak birkaç beyaz koloni ve bir mavi koloni seçin ve bunları yukarıdaki antibiyotikleri içeren taze LB agar plakalarına yeniden çizin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    7. Beyaz fenotipi doğruladıktan sonra, birkaç koloni seçin ve bunları 50 mL tüplerde 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin içeren 10 mL LB ortamına aşılayın.
    8. Kültürü 37 ° C'de gece boyunca 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek peletleyin.
    9. Süpernatanı boşaltın ve peleti miniprep kitinden 250 μL yeniden süspansiyon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin (bu çözeltinin üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılması gerekir), ardından çözeltiyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    10. 250 μL lizis çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın ve 3 dakika inkübe edin. 350 μL nötralize edici çözelti ekleyin, 2x-3x ters çevirin ve 10 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
    11. Süpernatanı taze bir tüpe aktarın ve eşit hacimde buz gibi soğuk izopropanol ekleyin ve -20 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    12. Çökeltilmiş DNA'yı 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek aşağı doğru peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti 700 μL% 70 buz gibi etanol, 2x ile yıkayın.
    13. Süpernatanı pelete dokunmadan bir pipetle çıkarın. Pelet havasını laminer akış başlığında 5-10 dakika veya tüpte sıvı görülmeyene kadar kurumaya bırakın. Peleti 100 μL EB tamponunda çözün.
  2. Bacmid transfeksiyonu ve virüs amplifikasyonu
    1. P1 virüsü hazırlama
      1. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında, 2 mL böcek hücre kültürü ortamında ~ 9 x 105 hücre/kuyu tohumlayın.
      2. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında ~ 30 dakika inkübe edin.
      3. Bacmid/Fugene karışımını şu şekilde hazırlayın: 1 μg Bacmid DNA ve 300 μL böcek hücresi ortamını bir tüpte karıştırın. Başka bir tüpte, 8 μL transfeksiyon reaktifi ve 300 μL böcek hücresi ortamını karıştırın. Her iki karışımı da nazikçe pipetleyerek karıştırın ve bakmid/transfeksiyon reaktif kompleksinin oluşması için oda sıcaklığında ~30 dakika bekletin.
      4. Her bir kuyucuğa damla damla bakmid kompleks karışımı (~ 210 μL) ekleyin ve plakayı şeffaf bir filmle kapatın.
      5. Plakayı 27 °C'de 3-4 gün inkübe edin.
      6. Virüsü içeren besiyerini alın, FBS (son konsantrasyon %2) ekleyin, 0.45 μm filtre kullanarak süzün ve karanlıkta 4°C'de P1 virüs stoğu olarak saklayın.
    2. P2 virüsü hazırlama
      1. Bir kültür şişesinde 3 mL P1 virüsü ile 2 x 106 hücre / mL'de 50 mL böcek hücresini transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %25-30'a ulaşana kadar 4-6 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, 0.45 μm filtreden süzün ve her biri 1 mL alikot edin ve -80 ° C'de P2 virüs stoğu olarak saklayın.
    3. P3 virüsü hazırlama
      1. 100 mL böcek hücresini 2 x 106 hücre / mL'de 2 mL P2 virüsü ile bir kültür şişesinde transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %15-20'ye ulaşana kadar 3-4 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir son konsantrasyona ekleyin. 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. Karanlıkta 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
  3. Böcek hücrelerinde MMLV-RT'nin ekspresyonu ve saflaştırılması
    1. Taze böcek hücrelerine 2 x 106 hücre/mL (700 mL/2L şişe) yoğunlukta toplam 6 şişede 5 mL P3 virüsü ekleyin.
    2. Transfeksiyondan 55-60 saat sonra, 10 dakika boyunca 7808 x g'da döndürerek hücreleri hasat edin.
    3. Hücre peletlerini 200 mL MMLV-RT lizis tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 4). Lizatı 15 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve 1 saat boyunca 4 ° C'de 95.834 x g'de tekrar döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
    5. MMLV-RT tamponu A kullanarak numuneyi önce 4 mL/dk akış hızında Ni-NTA Excel 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirerek FPLC kullanarak protein saflaştırmasına başlayın (Tablo 5).
    6. Kolonu 10 CV MMLV-RT tamponu A ve %4 MMLV-RT tamponu B ile yıkayın (Tablo 5) ve proteini 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde MMLV-RT tamponu B'nin doğrusal gradyanı ile elüte edin.
    7. Ayrıştırılmış numuneyi MMLV-RT tamponu C ile dengelenmiş Strep 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirin (Tablo 5).
    8. Kolonu 10 CV% 100 MMLV-RT tamponu C ile yıkayın ve proteini 20 CV tampon D ile doğrusal bir gradyan ile elüte edin (Tablo 5).
    9. 1.13.-1.14 adımlarında olduğu gibi SDS-PAGE gerçekleştirerek ayrıştırılmış kesirleri kontrol edin. ve 4 ° C'de MMLV-RT depolama tamponuna (Tablo 6) karşı diyalize edilecek saflaştırılmış MMLV-RT içeren fraksiyonları toplayın.
    10. Nanodrop, alikot, sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

3. Kurum içi multipleks R3T tek adımlı RT-qPCR kit bileşenlerinin hazırlanması

  1. Tampon karışım hazırlama
    1. Daha önce 2'de gösterilen reaktifleri içeren RT-qPCR reaksiyonu için37x tamponu hazırlayın. Tüm reaktifleri DNase/RNase içermeyen suda ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklanan tampon karışımında hazırlayın.
  2. Astar ve Prob Setleri ve astarlar karışım hazırlama
    NOT: Kullanılan problar ve primerler Tablo 7'de listelenmiştir. Influenza ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 4 ileri ve geri primer seti içerir. Problar, InfA için 6-karboksifloresein (FAM), SARS-CoV-2 (N geni) için Texas Red-XN ve InfB için Yakima Yellow muhabirleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir. MERS-CoV ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 3 ileri ve geri primer seti içerir. Problar ayrıca MERS-CoV (ORF1a geni) için Texas Red-XN, MERS-CoV (UpE geni) için VIC ve 6-karboksifloresein (FAM) SARS-CoV-2 (N geni) raportörleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir.
    1. Tablo 7'de listelenen tüm primerleri ve probları içeren, her bir ileri ve geri primer için 6.7 μM nihai konsantrasyona sahip bir primer karışımı hazırlayın ve 1.5 mL'lik bir tüpte her prob için 1.25 μM. Astar karışımını -20 °C dondurucuda saklayın. Gerekli hacmi oluşturmak için elüsyon tamponu kullanın.
  3. Enzim karışımı hazırlama
    1. Gerekli hacmi oluşturmak için Taq polimeraz (30 U/μL) ve MMLV-RT (60 ng/μL) enzim karışımını Tablo 3'te gösterildiği gibi Taq polimeraz depolama tamponunda hazırlayın. Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin ve enzim karışımını -20 °C'de saklayın.
  4. RNA şablonu
    1. SARS-CoV-2, İnfluenza A H1N1, İnfluenza A H3N2, İnfluenza B ve MERS-CoV'nin sentetik RNA'larını 100 μL 1x Tris-EDTA tamponunda (10 mM Tri-Cl ve 1 mM EDTA (pH 8.0) ayrı ayrı yeniden süspanse ederek 1 x 106 RNA kopyası/μL'lik bir stok yapın.
    2. RT-qPCR için sentetik RNA'ları aşağıdaki konfigürasyonlarda karıştırın: 1) SARS-CoV-2, İnfluenza A ve İnfluenza B, 1 x 105 RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV, 1 x 105 RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek. 1 x 105 RNA kopyası/μL ila 10 RNA kopyası/μL arasında değişen her bir sentetik RNA karışımının 10 kat seri dilüsyonunu yapın.
      NOT: Şablonların seri seyreltmesini hazırlamak için buz gibi soğuk DNase/RNase-Free su kullandığınızdan emin olun.

4. Kurum içi çoğullanmış SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV tek adımlı RT-qPCR testi

NOT: İş istasyonu yüzeylerini dezenfekte edin ve PCR plaka düzenini planlamak için 96 oyuklu bir plaka şablonu kullanın.

  1. 96 oyuklu plakanın hazırlanması
    1. 2x tampon ve astar karışımını çözün. Enzim karışımını buz üzerinde tutun.
    2. Her bir oyuğa 10 μL 2x tampon karışımı, 1.5 μL primer karışımı, 1 μL enzim karışımı, 6.5 μL DNaz/RNaz İçermeyen Su ve test edilmesi gereken 1 μL karşılık gelen RNA karışımı ekleyin. Her oyuktaki son hacim 20 μL'dir. Bu adımla ilgili yardım için lütfen hazırlanan düzene bakın.
      NOT: Pipetleme yanlılığını önlemek için RNA numunesi dışındaki tüm reaktifleri içeren reaksiyon sayısına göre bir ana karışım yapılması önerilir. Ek olarak, teknik hataları önlemek için reaksiyonları iki veya üç kopya halinde gerçekleştirin.
    3. Plakayı yapışkan bir PCR plaka contası ile kapatın ve plakanın altındaki tüm sıvıyı toplamak için 1 dakika kısa bir süre santrifüjleyin. Numuneleri qPCR makinesine aktarmadan önce her kuyucuğun aynı hacimde sıvıya sahip olduğundan ve kabarcık içermediğinden emin olun.
      NOT: Tüm PCR reaksiyonlarının buz üzerinde ayarlanması gerekir.
  2. PCR programı
    1. Gerçek zamanlı qPCR makine programını açın ve aşağıdaki deneysel özellikleri seçin:
      Blok tipi: Hızlı 96 kuyulu (0.1 mL)
      Deney düzeneği: Standart eğri
      Reaktifler: TaqMan reaktifleri
      Çalıştırma özellikleri: Standart.
    2. Tablo 7'de gösterildiği gibi tüm gen hedeflerini ve raportör boyalarını tanımlayın. Ek olarak, amplifikasyon eğrilerinin daha kolay analizi için test edilecek her reaksiyon için numune adlarını tanımlayın.
    3. 96 oyuklu plakaya dayalı olarak programın plaka düzenine hedefler ve numuneler atayın.
    4. PCR cihazında aşağıdaki döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın:
      esnasında 55 °C esnasında 10 dk
      40 döngü: 1 dakika boyunca 94 °C
      10 sn boyunca 94 °C
      esnasında 68 °C 10 sn
      20 saniye boyunca 68 °C; Burada floresan elde edin.
    5. Plakayı gerçek zamanlı qPCR makinesine aktarın ve plakanın doğru yönlendirilmesini sağlayarak tutucuya yerleştirin ve çalıştırmayı başlatın.
    6. Deneysel verileri kaydetmek için dosya konumunu seçin.
  3. Veri analizi
    1. Öncelikle qPCR programı tarafından üretilen amplifikasyon grafiklerinin incelenmesi esastır. Tespit edilebilecek minimum RNA konsantrasyonunu değerlendirmek için tespit sınırını analiz edin.
    2. Testin hassasiyetini değerlendirmek için x ekseninde RNA kopya sayısının günlüğünü ve y ekseninde karşılık gelen ortalama Ct değerini çizin. Eğim veR2 , reaksiyonun güvenilirliğini ve verimliliğini gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Son yıllarda, PCR yaklaşımları 21,22,23,24,25 kullanılarak yaygın solunum yolu virüslerini saptamaya yönelik tanı yaklaşımında önemli ilerlemeler olmuştur. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, tek bir testte birden fazla virüsün tespit edilmesini sağlayan çoğullama yaklaşımı, özellikle RT-qPCR platformunda yaygın olarak uygulanmamıştır. Bu yöntem, sentetik RNA virüsleri ve reaksiyon bileşenlerinin kurum içi optimizasyonu kullanılarak başarıyla uygulanmıştır37. Tanısal testin özgüllüğü, duyarlılığı ve güvenilirliği, bir saptama analizi sınırı kullanılarak yüksek olarak değerlendirildi. Sunulan yaklaşım, solunum virüsü teşhisinin etkinliğini ve doğruluğunu büyük ölçüde artırabilir, çoklu testlere olan ihtiyacı azaltabilir ve43'te olduğu gibi yanlış teşhis riskini en aza indirebilir. Hasta örneklerini kullanarak bu yaklaşımın faydalarını araştırmak ve klinik uygulamada benimsenmesini teşvik etmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Histidin etiketli Taq DNA polimerazın ekspresyonu ve saflaştırılması
Taq DNA polimeraz ekspresyonu ve saflaştırma44'ün yerleşik protokolüne dayanarak, N-terminal histidin etiketli Taq DNA polimeraz plazmidi, yukarıda açıklandığı gibi ekspresyonunu ve saflaştırma sürecini kolaylaştırmak için bir soğuk şok promotörü kontrolü altında oluşturulmuştur (Şekil 1A ve Şekil 2A). Böylece, sadece IPTG konsantrasyonunu ve sıcaklığını değiştirerek, bu yeni yapının ekspresyon seviyesi kolayca kontrol edilebilir. Taq DNA polimeraz plazmidini içeren hücrelerin 16 ° C'de 1 mM IPTG ile inkübasyonu, His-Taq DNA polimerazın gelişmiş ekspresyonunu gösterdi. Ek olarak, daha önce kurulan protokol44 , nihai ürün saflığı etkilenmediği ve ticari olarak temin edilebilen Taq polimeraz ile karşılaştırılabilir olduğu için burada kullanılan yapı ile atlanabilen, zaman alıcı polietilenimin (PEI) çökeltme adımlarını gerektiriyordu (Şekil 2B). Saflaştırılmış Taq polimeraz, N-terminalinde enzim ve histidin etiketi arasındaki bağlayıcı peptitlerin varlığından dolayı ticari olandan daha yavaş göç etti. Taq DNA polimeraz, saf proteinin 0.98 mg/L E. coli kültürü ile başarıyla üretildi.

Çift His- ve Strep-Etiketli MMLV ters transkriptazın ekspresyonu ve saflaştırılması
Bakulovirüs ekspresyon sistemi, Şekil 2A'da tarif edildiği gibi böcek hücrelerinde (Sf9) bir C-terminali çift His ve Strep-tag ile MMLV-RT'yi eksprese etmek için kullanıldı. Daha önceki bir çalışma, C-terminal etiketli MMLV-RT'nin, ipekböceği-bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (ipekböceği-BEVS) kullanılarak ipekböceklerinde hem N-terminal etiketli proteinin hem de C-terminal etiketli proteinin sentezlendiği daha yüksek aktivite gösterdiğini göstermiştir41. Homojen bir MMLV-RT proteini üretmek için, yukarıda belirtilen çalışmada sunulanla aynı stratejiler ve protokol kullanılmıştır. Sonuç olarak, SDS-PAGE jel sonucu ile gösterildiği gibi 7.5 mg / L böcek hücre kültürü verimi ile gelişmiş ekspresyon ve% 95'ten fazla saf protein elde edildi (Şekil 2C).

Çoğullanmış qRT-PCR'nin optimizasyonu ve standardizasyonu
Optimize edilmiş ve geliştirilmiş bir kurum içi çoğullanmış RT-qPCR testi, aynı anda üç farklı yaygın solunum yolu virüsünü tespit etmek için tampon ve primer karışımı optimizasyonu turlarından sonra başarıyla monte edildi ve üretildi (Şekil 3)37. İlk kit, SARS-CoV-2 N geni, İnfluenza A H1N1 ve H3N2 ve İnfluenza B genini hedeflemek için tasarlandı; ikinci kit ise SARS-CoV-2 N geni, MERS ORF1a ve upE genleri içindir. Böylece, her iki kit de burada sunulan iş akışı olarak üç hedefi de başarılı ve aynı anda tespit edebilir (Şekil 3). Bu protokolde kullanılan virüslerin her birinin sentetik RNA örnekleri, yaygın solunum yolu virüslerinin tespiti için çoğullanmış bir kit gibi kullanma olasılığını gösterecek şekilde çoğaltıldı. Bu tanı testinin duyarlılığı, hasta örneklerinde daha önce bildirilen sonuçlara benzer. Hastaların influenza benzeri semptomlar gösterdiği durumlarda, çoğullanmış gerçek zamanlı RT-qPCR kullanımı, SARS-CoV-2, influenza A ve influenza B çoğullanmış test45 ile karşılaştırılabilir sonuçlar göstermiştir.

Kurum içi çoğullanmış RT-qPCR kitinin yaygın solunum yolu virüslerine karşı duyarlılığı ve tespit limiti
Kurum içi çoğullanmış kitin etkinliği, çoğullanmış RT-qPCR iş akışında gösterildiği gibi iki set primer karışımı ve her kit için karşılık gelen sentetik RNA kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Şablon olarak 10 ila 105 kopya/μL arasında değişen her bir sentetik RNA karışımının 10 kat seri seyreltilmesi ile her bir primer karışımı kullanılarak, geliştirilen her iki çoğullanmış RT-qPCR'nin duyarlılığı, özgüllüğü ve tespit limiti standart eğri analizi kullanılarak belirlenebilir. Bu, çoğullanmış RT-qPCR kitinin etkinliğini ve tutarlılığını doğrulamak için her testin üç bağımsız kopyasında yapılır. Sonuç olarak, burada geliştirilen iki kit, amplifikasyon eğrisi ve tespit limiti (LoD) tarafından görüldüğü gibi 10 RNA kopyası/reaksiyonu kadar düşük bir oranda üç hedef genin tümünü aynı anda başarılı bir şekilde amplifiye edebilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Her bir eğrinin eğim ve R2 değerleri, bireysel tahlillerin verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). R2 değerleri, veri noktalarına doğrusal uyumun iyiliğinin bir tahminini sağladı. Etkili bir qPCR testinde,R2 0.90'a çok yakın veya daha büyük olmalıdır. İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2 veya MERS-CoV ve SARS-CoV-2 titrasyonlarının amplifikasyon verimlilikleri tüm primer setleri için %99'un üzerindeydi (Şekil 4 ve Şekil 5). Ek olarak, küçük hata çubukları, her çoğullanmış RT-qPCR kitinin tekrarlanabilirliğini kanıtlar. Negatif kontrol ile amplifikasyon olmadığı için (veriler gösterilmediğinden) her iki çoğullanmış kitin de herhangi bir primer dimer oluşumu göstermediğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, her iki kitin tasarımı, tüm hedef genleri güvenilirlik, özgüllük ve duyarlılıkla başarılı bir şekilde çoğalttı.

Figure 1
Şekil 1: Çoğullanmış tek adımlı RT-qPCR kit düzeneğine şematik genel bakış. Kitin montajı, ihtiyaç duyulan enzimlerin, Taq DNA polimeraz ve MMLV ters transkriptazın ekspresyonu ve saflaştırılması ile başlar. Her iki enzimin de gösterildiği gibi iki sütundan geçirilmesi gerekiyordu. İkinci olarak, saflaştırmayı takiben, reaksiyon koşullarının optimizasyonu ve çoğullanmış test kiti için en uygun koşullarla sonuçlanan termal döngü programı yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: His-Taq Pol ve C-His/Strep MMLV-RT'nin plazmit yapıları ve saflaştırma sonuçları. (A) Rekombinant His-Taq Pol ve C-His/Strep MMLV-RT ekspresyon plazmitlerinin şematik gösterimi. Kısaltmalar: CSPA promotörü - soğuk şok proteini A promotörü; RBS - ribozom bağlanma bölgesi; 6x His - Altı histidin ile O'nun etiketi; TEE - çeviri arttırıcı eleman; Taq ORF - Taq Pol açık okuma çerçevesi; Polh - polihedrin destekleyici; MMLV-RT ORF - MMLV-RT açık okuma çerçevesi; TEV - aşındırma virüsü proteaz hedefleme bölgesi; 8x His - Sekiz histidin ile His-tag; Strep - Strep etiketi; poliA - SV40 geç poliadenilasyon sinyali. (B) BL21 (DE3) E. coli hücreleri ve Taq polimerazda eksprese edilen His-Taq Pol'ün SDS-PAGE analizi. (C) Sf9 hücrelerinde eksprese edilen saflaştırılmış C-His/Strep MMLV-RT'nin SDS-PAGE analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Reaksiyon bileşenleri ile birlikte optimize edilmiş, standartlaştırılmış ve geliştirilmiş iki çoğullanmış tek adımlı RT-qPCR kitinin şematik diyagramı. Her bir çoğullanmış reaksiyon, dNTP'ler, tampon karışımı, enzim karışımı, çoğullanmış primer karışımı ve test edilecek sentetik RNA şablonundan oluşur. (A) İnfluenza A/B, SARS-CoV-2 kiti ve (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İnfluenza A/B ve SARS-CoV2 multipleks tek adımlı RT-qPCR kiti için amplifikasyon eğrileri ve tespit sınırı. Çoğullanmış RT-qPCR'nin amplifikasyon eğrileri, tüm hedefler (A) İnfluenza A, (C) İnfluenza B ve (E) SARS-CoV-2 ile 10 kat seri dilüsyonlu (10 ila 105 kopya / μL) sentetik RNA karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. Reaksiyonlar üç kopya halinde gerçekleştirildi ve örnek olarak bir kopya gösterildi. (B) İnfluenza A, (D) İnfluenza B ve (F) SARS-CoV-2 için tespit sınırı, günlük kopya numarasına karşı tekrarlananüç CT değerinin ortalaması çizilerek belirlendi. Belirleme katsayısı (R2) ve doğrusal regresyon eğrisinin denklemi hesaplandı ve her panelde gösterildi. Hata çubukları, üç kopya arasındaki standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: MERS ORF1a/upE ve SARS-CoV2 multipleks tek adımlı RT-qPCR kiti için amplifikasyon eğrileri ve tespit sınırı. Çoğullanmış RT-qPCR'nin amplifikasyon eğrileri, (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE ve (E) SARS-Cov-2 hedefleri ile 10 kat seri dilüsyonlu (10 ila 105 kopya / μL) sentetik bir RNA karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. Reaksiyonlar üç kopya halinde gerçekleştirildi ve örnek olarak bir kopya gösterildi. (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE ve (F) SARS-CoV-2 için tespit sınırı, günlük kopya numarasına karşı çoğaltılanüç CT değerinin ortalaması çizilerek belirlendi. Belirleme katsayısı (R2) ve doğrusal regresyon eğrisinin denklemi hesaplandı ve her panelde gösterildi. Hata çubukları, üç kopya arasındaki standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Taq polimeraz lizis tamponu için bileşenlerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Taq polimeraz saflaştırma tamponları. Taq DNA polimerazın iki sütunlu saflaştırılması için gerekli tampon bileşenlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Taq polimeraz depolama tamponu. Saflaştırmadan sonra Taq DNA polimerazı diyaliz etmek için gereken tampon bileşenlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: MMLV-RT lizis tamponu bileşenlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: MMLV-RT arıtma tamponları. MMLV-RT'nin iki sütunlu saflaştırılması için gerekli tampon bileşenlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6: MMLV-RT depolama arabelleği. Saflaştırmadan sonra MMLV-RT'yi diyaliz etmek için gereken tampon bileşenlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 7: Primerler ve prob bilgileri. Her bir multipleks primer karışımı için gerekli olan primerlerin ve probların sıra bilgisi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV varyantları gibi yaygın solunum yolu virüslerinin yayılmasına bağlı yüksek enfeksiyon ve ölüm oranlarından kaynaklanan dünya çapında sağlık sistemi üzerinde ağır bir ekonomik yük bulunmaktadır 12,19,20. Bu yükü hafifletmeye yönelik sorumluluk duygusuyla motive olarak, bu yaygın virüsleri tek bir testte ayırt etmek için RT-qPCR gibi hızlı, kesin ve erişilebilir bir tanı testine ihtiyaç olduğunu fark ettik. qRT-PCR'nin çoğullanmış doğası sayesinde, SARS-CoV-2'yi Influenza A/B ve MERS-CoV virüsleri gibi diğer solunum yolu virüslerinden teşhis etmek ve ayırt etmek mümkündür. Sonunda, mevcut çoğullanmış test46 kullanılarak hastaların daha iyi ve daha hassas tedavisi sağlanabilir. Özetlemek gerekirse, bu çalışma, iki farklı kombinasyonu hedefleyebilen kurum içi tek adımlı multipleks RT-qPCR testinin gerçekleştirilmesini açıklamaktadır. Her kombinasyon, bu tür bulaşıcı virüslerin yayılmasını sınırlamak ve sağlık sistemi üzerindeki ekonomik yükü azaltmak için üç farklı solunum yolu virüsünden oluşur.

Mevcut çoğullanmış RT-qPCR kiti, yaygın solunum yolu virüslerinin (SARS-CoV-2, Influenza A/B) ve (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a) iki kombinasyonunu hedefleyebilir. Açıklanan protokol kolay, takip edilmesi kolay ve piyasada bulunan tek adımlı RT-qPCR kitlerinden çok daha ucuzdur. Diğer bir avantaj, farklı prob ve primer kombinasyonları kullanarak birden fazla viral genetik hedefi hedefleyebilen kitin çoğullanmış özellikleriydi. Böylece, kitin çok yönlülüğü ve basitliği, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda doğrudan uygulama sağlar. Ayrıca kit, birden fazla solunum yolu virüsünün yayılmasını ve birlikte enfeksiyonunu sınırlamaya yardımcı olabilecek doğru ve kesin tanı ile sonuçlanan kapsamlı testler için uygundur.

Spesifik olmayan ürünlerin oluşumunu sınırlamak için tüm hedeflerin başarılı bir şekilde ve yüksek doğrulukla büyütülmesini sağlamak için ön testler yapıldı. İlk olarak, tampon karışımının bileşenleri ve tampon karışımındaki ilgili konsantrasyonları için birkaç optimizasyon turundan geçtik. İkinci olarak, hem primer karışımında hem de PCR reaksiyonunda primerleri ve bunlara karşılık gelen konsantrasyonları optimize ettik. Üçüncüsü, aktivitesini en üst düzeye çıkarmak ve MMLV-RT'nin Taq polimeraz47'nin aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisini en aza indirmek için enzim karışımının bileşimini optimize ettik. Dördüncüsü, her iki enzimin termal stabilitesi için sınırlamaları dikkate alarak termal döngü koşullarını optimize ettik. Yukarıda belirtilen iyileştirmeleri içeren, burada sunulan çoğullanmış RT-qPCR kitimizin optimize edilmiş versiyonu, yüksek özgüllük, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile 10'a kadar RNA kopyasını/reaksiyonunu tespit edebildi.

Multipleks RT-qPCR testinin yüksek verimliliğini ve başarılı bir şekilde uygulanmasını sağlamak, inhibitörleri önlemek ve pipetleme hatalarını önlemek için bazı önlemler dikkate alınmalıdır. Her tesis kurulumu ve enstrümantasyonu açısından benzersiz olduğundan, böyle bir kit oluştururken yardımcı olabilecek bazı adımlar şunlardır: ilk olarak, herhangi bir kontaminasyon ve PCR inhibitörünün varlığından kaçınmak için her zaman eldiven giyilmesi gerekir. İkinci olarak, aerosole dayanıklı filtre uçları kullandığınızdan ve kalibre edilmiş bir pipet kullandığınızdan emin olun. Ek olarak, PCR sınıfı su kullandığınızdan emin olun. Şablonsuz kontrolün kullanılması, herhangi bir kontaminasyonun varlığının doğrulanmasına yardımcı olacaktır. Olası kontaminasyonu ve pipetleme değişikliklerini önlemek için ana karışımın tüm kopyalar için hazırlanması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Prob kalitesini korumak için stoğu ayırma ve seyreltmek için su kullanımından kaçınma gibi diğer sorun giderme ipuçlarının dikkate alınması gerekir. Kullanılan astar ve probun saklanması ve seyreltilmesi konusunda üreticinin tavsiyelerine uymak önemlidir. Bu nedenle, bu basit ipuçları, multipleks RT-qPCR testinin başarısını korumaya ve yüksek verimliliğini sağlamaya yardımcı olacaktır.

Bu araştırmada geliştirilen çoğullanmış RT-qPCR testleri, sentetik viral RNA'larla test edildiğinde iyi sonuçlar vermiş olsa da, gerçek bir klinik ortamdaki etkinliğinin hala değerlendirilmesi ve doğrulanması gerekmektedir. Ne yazık ki, klinik örneklerin azlığı, bu araştırmaya dahil edilen virüsler için testin özgüllüklerini ve duyarlılığını belirlemeyi zorlaştırmaktadır. Bununla birlikte, örneklerin %100'ünde tespit edilebilecek minimum kopya sayısını gösteren LOD'nin (tespit sınırı) istatistiksel olarak kanıtlanmış bir doğrusal regresyon yoluyla oluşturulduğunu belirtmekte fayda var. Bu, klinik tanı için potansiyel sağlar ve araştırmanın önemli bir bulgusudur.

Bu çalışmada, prob tabanlı bir kurum içi multipleks tek adımlı RT-qPCR testi başarıyla geliştirilmiş ve yüksek etkinlikle doğrulanmıştır. SARS-CoV-2, tek bir test tüpünde yüksek verimlilik ve güvenilirlikle yukarıda açıklandığı gibi diğer yaygın solunum yolu virüslerinden kolayca tespit edilebilir ve ayırt edilebilir. Bu nedenle, bu çoğullanmış özelliğe bağımlılık, tanının verimini artırmaya yardımcı olacak ve diğer test yaklaşımlarına ve tek yönlü PCR'ye kıyasla zamandan, maliyetten ve numuneden tasarruf sağlayacaktır. Sonuç olarak, solunum yolu virüslerinin birlikte dolaşma olasılığı yüksektir ve bu multipleks tek adımlı RT-qPCR çok avantajlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından çekirdek finansman ve S.M.H.'ye Ulusal Dönem Büyük Mücadelesi (NTGC) yoluyla desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 201 Taq polimeraz MMLV-RT protein ekspresyonu COVID-19 SARS-CoV-2 İnfluenza A/B MERS-CoV multipleks RT-qPCR
SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter