Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utvikling av multiplekse sanntids RT-qPCR-analyser for påvisning av SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi presenterer to sondebaserte interne ett-trinns RT-qPCR-sett for vanlige luftveisvirus. Den første analysen er for SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 og H3N2) og influensa B. Den andre er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analysene kan med hell implementeres i ethvert spesialisert laboratorium.

Abstract

Det alvorlige akutte luftveissyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som forårsaker Coronavirus sykdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mot allmennhetens helse. Under influensasesonger kan spredning av SARS-CoV-2 og andre respiratoriske virus forårsake en populasjonsomfattende byrde av luftveissykdom som er vanskelig å håndtere. For det må respiratoriske virus SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåkes nøye i de kommende høst- og vintersesongene, spesielt når det gjelder SARS-CoV-2, influensa A og influensa B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som følsomme populasjoner, overføringsmåte og kliniske syndromer. Uten målspesifikke analyser kan det være utfordrende å skille mellom tilfeller av disse virusene på grunn av deres likheter. Følgelig vil en sensitiv og målrettet multipleksanalyse som lett kan skille mellom disse virale målene, være nyttig for helsepersonell. I denne studien utviklet vi en sanntids revers transkriptase-PCR-basert analyse ved hjelp av et internt utviklet R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier av deres syntetiske RNA kan vi med hell identifisere SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV-mål samtidig med 100% spesifisitet. Denne analysen er funnet å være nøyaktig, pålitelig, enkel, sensitiv og spesifikk. Den utviklede metoden kan brukes som en optimalisert SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analyse på sykehus, medisinske sentre og diagnostiske laboratorier, samt til forskningsformål.

Introduction

Pandemien av den pågående koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) er forårsaket av det nye koronaviruset kjent som alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grunn av SAR-CoV-2s sterke smittsomhet og kapasitet for rask overføring, oppsto COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte seg raskt over hele verden. Dette førte til slutt til starten av respiratoriske nødtegn og til og med død 2,3,4. COVID-19 har blitt erklært en pandemi i mer enn 213 land, og forventer en bratt økning i antall bekreftede tilfeller, som det fremgår av papirene publisert av forskjellige forskningsstudier 3,5. COVID-19 overføres primært av små luftveisdråper som infiserte individer slipper ut i miljøet og deretter blir utsatt for sårbare individer gjennom innånding eller nær kontakt med forurensede overflater. Når disse dråpene kommer i kontakt med slimhinnen i øynene, munnen eller nesen, kan en person bli smittet6. Statistikk utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) viser at det har vært mer enn 76 millioner bekreftede tilfeller av pandemien over hele verden, med svimlende 7 millioner dødsfall7. Dermed klassifiserte FN pandemien forårsaket av COVID-19-sykdommen som en katastrofe på grunn av dens direkte innvirkning på livene til milliarder av mennesker over hele verden og hadde vidtrekkende økonomiske, miljømessige og sosiale effekter.

Folkehelseinitiativer, inkludert grundig testing, tidlig oppdagelse, kontaktsporing og isolering av tilfeller, har alle vist seg å være avgjørende for å holde denne pandemien under kontroll 8,9,10,11. Vintermånedene vil øke sirkulasjonen av andre luftveisvirus som influensa A og B med COVID-19-lignende symptomer, noe som gjør det vanskelig å identifisere, spore opp og isolere COVID-19-tilfeller tidlig. Hvert år starter influensa A- og B-utbruddet sent på høsten eller begynnelsen av januar med en forutsigbar sesongmessighet12. Tallrike epidemiologiske trekk deles av SARS-CoV-2 og influensavirus. Dessuten deler likheter i de mottakelige populasjonene som inkluderer barn, eldre, immunkompromitterte og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, hjerte- og nyresvikt eller diabetes12,13. Disse virusene deler ikke bare sårbare befolkninger, men også overføringsruter for kontakt og luftveisdråper14. Det forventes at pasienter sannsynligvis kan få mer enn ett av disse respiratoriske virusene når influensasesongen nærmer seg14. For det må screeningen av SARS-CoV-2 og influensavirusene gjøres på symptomatiske pasienter før de isoleres. Å kjøre separate tester for de tre virusene (SARS-CoV-2, influensa A og influensa B) er ikke mulig på grunn av den globale mangelen på ressurser for nukleinsyreekstraksjon og diagnostikk. For å skjerme dem alle i en reaksjon, må en metode eller test utvikles.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV er et familiemedlem av humant koronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolatene kom fra en innlagt pasient i Saudi-Arabia som døde i september 2012 på grunn av akutte luftveisproblemer15. Det er bevis som tyder på at en fremtredende reservoarvert for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist at virus fra infiserte dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan infisere mennesker16,17. Mennesker smittet med dette viruset kan spre det til andre gjennom nær kontakt18. Per 26. januar 2018 hadde det vært 2143 laboratoriebekreftede tilfeller av MERS-CoV-infeksjon, inkludert 750 dødsfall globalt19. De mest typiske MERS-CoV-symptomene er hoste, feber og kortpustethet. MERS-CoV-infeksjoner har også blitt rapportert å vise lungebetennelse, diaré og gastrointestinale sykdomssymptomer20. For tiden er ingen kommersiell vaksine eller spesifikk behandling for MERS-CoV tilgjengelig. Derfor er rask og presis diagnose avgjørende for å forhindre de utbredte MERS-CoV-utbruddene og skille MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sykdom.

Til dags dato har mange tilnærminger blitt foreslått for å oppdage disse virusene som multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserte biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-testing i en pott 32, DNA-aptamer33, loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP)19,34 osv. Hver av de nevnte metodene har unike fordeler og ulemper når det gjelder følsomhet og spesifisitet. Blant disse metodene er nukleinsyreforsterkningsbasert test: multiplex qRT-PCR, den vanligste og anses å være gullstandarden for diagnostisering av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV.

I denne studien designet og vurderte vi ulike primerkombinasjoner og prober for effektiv, nøyaktig og samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved bruk av standard vri syntetiske virale RNAer. De multipleksede analysene utviklet for enten MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO). Disse genene koder generelt for proteiner og komplekser som bidrar til dannelsen av et replikasjons-/transkripsjonskompleks (RTC)35, slik som regionen innenfor den åpne leserammen 1a (ORF1a) som brukes til MERS-CoV-analyse. I tillegg er strukturelle proteiner kodet av gener som brukes i diagnostiske analyser som oppstrøms region av konvoluttgen (upE) og nukleokapsidgen (N) som brukes til MERS-CoV og SARS-Cov-2 analyser, henholdsvis35,36. Vi brukte internt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for å etablere RT-qPCR for påvisning av virus37. Virusdeteksjon, følsomhet, spesifisitet og dynamisk område for vårt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett og primersett ble testet og evaluert ved hjelp av 10 ganger serielle fortynninger av standard vri syntetiske RNA-er. Den laveste praktiske deteksjonsgrensen var ca. 10 transkripsjonskopier per reaksjon. Som et resultat kan det interne R3T ett-trinns RT-qPCR-settet og primer-/sondesettene med hell brukes og implementeres for rutinemessig samtidig diagnose av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taq-polymeraseuttrykk og rensing

  1. Konstruer et plasmid med en spaltbar heksa-histidin-tag ved C-terminalen av enzymet.
  2. Transformer 50 ng av ekspresjonsvektoren til E. coli BL21-(DE3) stamme etter standardprotokollen38.
  3. Inokuler de transformerte cellene i fire 6 L kolber som hver inneholder 2 L 2YT mediebuljong ved 37 ° C med risting ved 170 o / min til OD 600 på 0,8 eller cellenummer 6,4 x 108 er nådd.
  4. Indusere Taq-polymeraseuttrykk med 0,5 mM isopropyl-β-d-tiogalaktopyranosid (IPTG) og inkuberes videre ved 16 °C i 18 timer med risting.
  5. Høst cellene ved å spinne dem ned ved 4 °C ved 7808 x g i 10 minutter. Resuspender pelletsene i 200 ml av en iskald Taq-polymeraselysbuffer (tabell 1) i 5 ml/g cellepellet.
  6. Inkuber cellene med lysozym (2 mg/ml lysisbuffer) og proteasehemmere i 45 minutter og send deretter lysatet gjennom en celleforstyrrelse ved 30 kPsi og sentrifuge ved 22 040 x g i 30 minutter ved 4 °C for å skille cellerestene.
  7. Varm supernatanten i 15 minutter ved 85 °C. Spinn ned ved 95 834 x g i 1 time ved 4 °C. Samle supernatanten og filtrer den på is med 0,45 μm filter.
  8. Utfør proteinrensing ved hjelp av Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) ved først å sende prøven gjennom en Ni-NTA HP 5 ml kolonne ved 4 ml / min strømningshastighet ved bruk av Taq-polymerasebuffer A (tabell 2; Figur 1A).
  9. Vask med 10 kolonnevolum (CV) Taq-polymerasebuffer A og 4 % Taq-polymerasebuffer B (tabell 2). Eluer det bundne proteinet med en lineær gradient ved bruk av Taq-polymerasebuffer B over 20 CV i en 100 ml flaske.
  10. Før eluenten i 100 ml flasken gjennom en kationbytter 5 ml kolonne ved 4 ml/min ved bruk av Taq-polymerasebuffer C (tabell 2; Figur 1A).
  11. Vask med 20 CV 100% Taq polymerasebuffer C og 5% Taq polymerase buffer D (tabell 2).
  12. Elute med en lineær gradient ved bruk av Taq-polymerasebuffer D (tabell 2) fra 5% til 100%.
  13. Kontroller de eluerte fraksjonene ved å utføre SDS-PAGE gelelektroforese 39 etterfulgt av gelfarging 40 som tidligere beskrevet. Ta kort tid 10 μL av hver fraksjon og tilsett et likt volum på 2x SDS lastestoff. Denaturer prøven ved 90oC i 10 minutter. Legg prøvene på 10% SDS-PAGE gel og kjør gelen i 25 min ved 200 V. Beis gelen med Coomassie Brilliant Blue og fjern deretter flekken.
  14. Samle alle fraksjonene som inneholder renset Taq-polymerase og dialyser mot lagringsbuffer av taq-polymerase (tabell 3) ved 4 °C. Forbered kort 2 l av lagringsbufferen og senk dialysekassetten i bufferen i 2 minutter for å hydrere. Injiser de oppsamlede fraksjonene med en nål inn i dialysekassetten og la den stå over natten i dialysebufferen ved 200 o / min på omrøreren.
  15. Etter dialyse måles proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer, lager 10 μL alikoter, snap fryser i flytende nitrogen og lagrer ved -80 °C.
    MERK: Filtrer alle buffere for rensing ved hjelp av et 0,45 μm filter før du legger dem inn i FPLC-systemet.

2. MMLV-RT-uttrykk i insektcelleekspresjonssystem og rensing

  1. Bacmid DNA-generering og isolasjon
    1. Klon sekvensen av MMLV-RT med en C-terminal spaltbar TEV-8xHis-Strep-tag som tidligere beskrevet41.
    2. Bland 100 ng av ekspresjonsvektoren i 50 μL DH10Bac-celler og bland forsiktig ved å banke på røret.
    3. Inkuber cellene på is i 15 minutter. Varmesjokk cellene i 1 minutt ved 42 °C.
    4. Overfør umiddelbart på is og tilsett 400 μL S.O.C medium. Inkuber ved 37 °C med risting i 4 timer.
    5. Plate 10 μL og 15 μL av blandingen på LB Agar-plater som inneholder tre antibiotika; 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyklin og 7 μg/ml gentamicin sammen med 40 μg/ml IPTG og 100 μg/ml X-Gal for blåhvitt utvalg.
    6. Inkuber platene ved 37 °C i 48 timer. Velg flere hvite kolonier og en blå koloni som en kontroll, og strek dem på ferske LB-agarplater som inneholder antibiotika ovenfor. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
    7. Etter å ha bekreftet den hvite fenotypen, velg et par kolonier og inokuler dem i 10 ml LB-medier inneholdende 50 μg / ml Kanamycin, 10 μg / ml tetracyklin og 7 μg / ml gentamicin i 50 ml rør.
    8. Inkuber kulturen ved 37 °C med risting ved 170 o / min over natten. Pellet ned cellene ved å spinne dem ned ved 22 040 x g i 10 minutter.
    9. Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 250 mikro liter resuspensjonsoppløsning fra miniprep-settet (denne oppløsningen må håndteres i samsvar med produsentens instruksjoner), og overfør deretter oppløsningen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    10. Tilsett 250 μL lysisoppløsning, bland forsiktig og inkuber i 3 minutter. Tilsett 350 μL nøytraliserende løsning, inverter 2x-3x og sentrifuge ved 22 040 x g i 10 minutter.
    11. Overfør supernatanten til et nytt rør og tilsett et likt volum iskald isopropanol og inkuber i 30 minutter ved -20 °C.
    12. Pellet ned det utfelte DNA-et ved å spinne ved 22 040 x g i 10 minutter. Kast supernatanten og vask pelleten med 700 μL 70% iskald etanol, 2x.
    13. Fjern supernatanten med en pipette uten å berøre pelleten. La pelletsluften tørke i avtrekksviften for laminær luftstrøm i 5–10 minutter eller til det ikke ses væske i slangen. Løs opp pelleten i 100 μL EB-buffer.
  2. Bacmid transfeksjon og virusforsterkning
    1. P1 virus forberedelse
      1. I en 6-brønns vevskulturplate, frø ~ 9 x 105 celler / brønn i 2 ml insektcellekulturmedium.
      2. Inkuber platen i ~ 30 min ved romtemperatur for å la cellene feste seg.
      3. Forbered Bacmid / Fugene blanding som følger: bland 1 μg Bacmid DNA og 300 μL insektceller media i ett rør. I et annet rør blandes 8 μL transfeksjonsreagens og 300 μL insektceller media. Bland begge blandingene med forsiktig pipettering og la stå i ~ 30 min ved romtemperatur for at bacmid / transfeksjonsreagenskomplekset skal dannes.
      4. Tilsett bacmidkompleksblanding (~ 210 μL) til hver brønn dråpevis og forsegl platen med en gjennomsiktig film.
      5. Inkuber platen ved 27 °C i 3-4 dager.
      6. Ta mediet som inneholder viruset, tilsett FBS (endelig konsentrasjon 2%), filtrer med 0,45 μm filter og lagre ved 4 °C i mørket som P1-viruslager.
    2. P2 virus forberedelse
      1. Transfekt 50 ml insektceller ved 2 x 106 celler/ml med 3 ml P1-virus i en dyrkingskolbe.
      2. Inkuber ved 27 ° C med risting ved 100 o / min i 4-6 dager til prosentandelen døde celler når 25% -30%.
      3. Sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter og samle supernatanten som inneholder viruset.
      4. Tilsett FBS til en endelig konsentrasjon på 2%, filtrer gjennom 0,45 μm filter og aliquot 1 ml hver og lagre ved -80 °C som P2-viruslager.
    3. P3 virus forberedelse
      1. Transfekt 100 ml insektceller ved 2 x 106 celler/ml med 2 ml P2-virus i en dyrkingskolbe.
      2. Inkuber ved 27 °C med risting ved 100 o / min i 3-4 dager til prosentandelen døde celler når 15% -20%.
      3. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 minutter og samle supernatanten som inneholder viruset.
      4. Legg FBS til en endelig konsentrasjon på 2%. Filtrer gjennom et 0,45 μm filter. Den kan oppbevares i mørket ved 4 °C i 1 måned.
  3. Ekspresjon og rensing av MMLV-RT i insektceller
    1. Tilsett 5 ml P3-virus til friske insektceller med en tetthet på 2 x 106 celler / ml (700 ml / 2L kolbe) totalt 6 kolber.
    2. Høst cellene etter 55-60 timer etter transfeksjon ved å spinne ved 7808 x g i 10 minutter.
    3. Resuspender cellepellets i 200 ml MMLV-RT lysisbuffer (tabell 4). Før lysatet gjennom en celleforstyrrende ved 15 kPsi og sentrifuge ved 22 040 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Overfør supernatanten til nye rør og sentrifugerer igjen ved 95 834 x g ved 4 °C i 1 time. Samle supernatanten og filtrer den på is ved hjelp av et 0,45 μm filter.
    5. Start proteinrensing ved hjelp av FPLC ved først å sende prøven gjennom Ni-NTA Excel 5 ml kolonne (figur 1B) ved 4 ml/min strømningshastighet ved hjelp av MMLV-RT-buffer A (tabell 5).
    6. Vask kolonnen med 10 CV MMLV-RT buffer A og 4% MMLV-RT buffer B (tabell 5) og eluer proteinet med den lineære gradienten av MMLV-RT buffer B over 20 CV i en 100 ml flaske.
    7. Før den eluerte prøven gjennom Strep 5 ml kolonnen (figur 1B) likevektet med MMLV-RT buffer C (tabell 5).
    8. Vask kolonnen med 10 CV av 100% MMLV-RT buffer C og eluer proteinet med en lineær gradient med 20 CV buffer D (tabell 5).
    9. Kontroller de eluerte fraksjonene ved å utføre SDS-PAGE som gjort er trinn 1.13.-1.14. og samle fraksjonene som inneholder renset MMLV-RT som skal dialyseres mot MMLV-RT-lagringsbuffer (tabell 6) ved 4 °C.
    10. Mål proteinkonsentrasjonen med Nanodrop, aliquot, snap fryse i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.
      MERK: Filtrer alle buffere for rensing ved hjelp av et 0,45 μm filter før du legger dem inn i FPLC-systemet.

3. Klargjøring av interne multiplex R3T ett-trinns RT-qPCR-settkomponenter

  1. Forberedelse av bufferblanding
    1. Forbered 2x bufferen for RT-qPCR-reaksjonen som inneholder reagensene tidligere vist i37. Forbered alle reagensene i DNase/RNase-fritt vann og bufferblandingen lagret i en fryser på -20 °C.
  2. Primer og Probe Sett og primere blanding forberedelse
    MERK: Probene og primerne som brukes er oppført i tabell 7. Influensa- og SARS-CoV-2 multiplekset sett inneholder 3 sonder og 4 fremre og bakre primersett. Probene er merket i 5'-enden ved hjelp av reportere 6-karboksyfluorescein (FAM) for InfA, Texas Red-XN for SARS-CoV-2 (N-genet) og Yakima Yellow for InfB. MERS-CoV og SARS-CoV-2 multiplekset sett inneholder 3 sonder og 3 fremre og bakre primersett. Probene er også merket i 5'-endene ved hjelp av reportere Texas Red-XN for MERS-CoV (ORF1a-gen), VIC for MERS-CoV (UpE-genet) og 6-karboksyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (N-genet).
    1. Klargjør en primerblanding som inneholder alle primere og sonder oppført i tabell 7 med en endelig konsentrasjon på 6,7 μM for hver forover- og bakoverprimer og 1,25 μM for hver sonde i et 1,5 ml rør. Oppbevar primerblandingen i -20 °C fryseren. Bruk elueringsbuffer for å gjøre opp ønsket volum.
  3. Preparat av enzymblanding
    1. Klargjør Taq-polymerase (30 E/μL) og MMLV-RT (60 ng/μL) enzymblanding i Taq-polymeraselagringsbufferen som vist i tabell 3 for å utgjøre nødvendig volum. Utfør dette trinnet på is og oppbevar enzymblandingen ved -20 °C.
  4. RNA-mal
    1. Resuspendere syntetiske RNA av SARS-CoV-2, influensa A H1N1, influensa A H3N2, influensa B og MERS-CoV separat i 100 μL 1x Tris-EDTA buffer (10 mM Tri-Cl og 1 mM EDTA (pH 8.0) for å lage en bestand på 1 x 106 RNA-kopier/μL.
    2. Bland syntetiske RNA for RT-qPCR i følgende konfigurasjoner: 1) SARS-CoV-2, influensa A og influensa B ved å legge til 5 μL av hver virusbestand til 50 μL volum for å lage 1 x 105 RNA-kopier/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV ved å tilsette 5 μL av hver virusbestand til 50 μL volum for å lage 1 x 105 RNA-kopier/μL. Lag 10 ganger serielle fortynninger av hver syntetisk RNA-blanding fra 1 x 105 RNA-kopier/μL til 10 RNA-kopier/μL.
      MERK: Sørg for å bruke iskaldt DNase/RNase-fritt vann for å forberede seriefortynningen av malene.

4. Intern multiplekset SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ett-trinns RT-qPCR-test

MERK: Desinfiser arbeidsstasjonsoverflater og bruk en 96-brønns platemal for å planlegge PCR-plateoppsettet.

  1. Forberedelse av 96-brønnplate
    1. Tine 2x buffer og primerblanding. Hold enzymblanding på is.
    2. Til hver brønn tilsettes 10 μL 2x bufferblanding, 1,5 μL primerblanding, 1 μL enzymblanding, 6,5 μL DNase/RNase-fritt vann og 1 μL tilsvarende RNA-blanding som må testes. Det endelige volumet i hver brønn er 20 μL. Se den forberedte layouten for å få hjelp med dette trinnet.
      MERK: Det anbefales å lage en masterblanding basert på antall reaksjoner som inneholder alle reagensene unntatt RNA-prøven for å unngå pipetteringsskjevhet. I tillegg må du utføre reaksjonene i duplikat eller triplikat for å unngå tekniske feil.
    3. Forsegl platen med en selvklebende PCR-plateforsegling og sentrifuge kort i 1 min for å samle all væske i bunnen av platen. Forsikre deg om at hver brønn har samme væskevolum og er fri for bobler før du overfører prøvene til qPCR-maskinen.
      MERK: Alle PCR-reaksjonene må settes opp på is.
  2. PCR-program
    1. Åpne sanntids qPCR-maskinprogram og velg følgende eksperimentelle egenskaper:
      Blokktypen: Rask 96-brønn (0,1 ml)
      Eksperimentoppsett: Standardkurve
      Reagenser: TaqMan-reagenser
      Kjør egenskaper: Standard.
    2. Definer alle genmålene og deres reporterfargestoff som presentert i tabell 7. I tillegg definerer du prøvenavn for hver reaksjon som skal testes for enklere analyse av amplifikasjonskurvene.
    3. Tilordne mål og prøver til programmets plateoppsett basert på 96-brønnplaten.
    4. Sett følgende syklusprogram i PCR-instrumentet som følger:
      55 °C i 10 minutter
      40 sykluser: 94 °C i 1 min
      94 °C i 10 s
      68 °C i 10 s
      68 °C i 20 s; Her får du fluorescens.
    5. Overfør platen til qPCR-maskinen i sanntid og plasser den i holderen for å sikre riktig retning på platen og starte løpet.
    6. Velg filplasseringen for å lagre eksperimentelle data.
  3. Analyse av data
    1. Det er viktig å først undersøke forsterkningsplottene produsert av qPCR-programmet. Analyser deteksjonsgrensen for å vurdere minimum RNA-konsentrasjon som kan oppdages.
    2. Plott loggen til RNA-kopinummeret på x-aksen og den tilsvarende gjennomsnittlige Ct-verdien på y-aksen for å vurdere sensitiviteten til analysen. Hellingen og R2 indikerer reaksjonens pålitelighet og effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De siste årene har det vært betydelige fremskritt i den diagnostiske tilnærmingen for å oppdage vanlige luftveisvirus ved hjelp av PCR-tilnærminger 21,22,23,24,25. Til tross for disse fremskrittene har imidlertid den multipleksede tilnærmingen, som gjør det mulig å oppdage flere virus i en enkelt test, ikke blitt mye implementert, spesielt i RT-qPCR-plattformen. Denne metoden har blitt implementert ved hjelp av syntetiske RNA-virus og intern optimalisering av reaksjonskomponenter37. Spesifisiteten, sensitiviteten og reliabiliteten til den diagnostiske analysen ble vurdert til å være høy ved bruk av en grense for deteksjonsanalyse. Den presenterte tilnærmingen kan i stor grad forbedre effektiviteten og nøyaktigheten av respiratorisk virusdiagnose, redusere behovet for flere tester og minimere risikoen for feildiagnose som i43. Ytterligere forskning er nødvendig for å utforske denne tilnærmingens fordeler ved bruk av pasientprøver og oppmuntre til bruk i klinisk praksis.

Ekspresjon og rensing av histidinmerket Taq DNA-polymerase
Basert på den etablerte protokollen for Taq DNA-polymeraseekspresjon og rensing44, ble N-terminal histidinmerket Taq DNA-polymeraseplasmid konstruert under kontroll av en kaldsjokkpromotor for å lette ekspresjons- og renseprosessen som forklart ovenfor (figur 1A og figur 2A). Således, ved bare å endre IPTG-konsentrasjon og temperatur, kan uttrykksnivået til denne nye konstruksjonen enkelt kontrolleres. Inkubasjon av celler som inneholder Taq DNA-polymeraseplasmid ved 16 °C med 1 mM IPTG viste økt ekspresjon av His-Taq DNA-polymerase. I tillegg krevde den tidligere etablerte protokoll44 tidkrevende utfellingstrinn av polyetylenimin (PEI), som kan hoppes over med konstruksjonen som ble brukt her, da sluttproduktets renhet var upåvirket og sammenlignbar med kommersielt tilgjengelig Taq-polymerase (figur 2B). Den rensede Taq-polymerasen migrerte langsommere enn den kommersielle på grunn av tilstedeværelsen av linkerpeptidene mellom enzymet og histidinmerket ved N-terminalen. Taq DNA-polymerase ble produsert vellykket med 0,98 mg / l E. coli-kultur av rent protein.

Ekspresjon og rensing av dobbel His- og Strep-Tagged MMLV revers transkriptase
Baculovirusekspresjonssystemet ble brukt til å uttrykke MMLV-RT med en C-terminal dobbel He og Strep-tag i insektceller (Sf9) som beskrevet i figur 2A. En tidligere studie viste at den C-terminalt merkede MMLV-RT demonstrerer høyere aktivitet der både det N-terminalt merkede proteinet og det C-terminalt merkede proteinet ble syntetisert i silkeorm ved bruk av silkeorm-baculovirus-ekspresjonsvektorsystemet (silkeorm-BEVS)41. For å produsere et homogent MMLV-RT-protein ble de samme strategiene og protokollen benyttet som presentert i ovennevnte studie. Som et resultat ble forbedret ekspresjon og mer enn 95% rent protein oppnådd med et utbytte på 7,5 mg / l insektcellekultur som vist ved SDS-PAGE gelresultat (figur 2C).

Optimalisering og standardisering av multiplekset qRT-PCR
En optimalisert og utviklet intern multiplekset RT-qPCR-test ble satt sammen og produsert vellykket etter runder med buffer- og primerblandingsoptimalisering for å oppdage tre forskjellige vanlige respiratoriske virus samtidig (figur 3) 37. Det første settet ble designet for å målrette SARS-CoV-2 N-genet, influensa A H1N1 og H3N2, og influensa B-genet; og det andre settet er for SARS-CoV-2 N-genet, MERS ORF1a og upE-gener. Dermed kan begge settene lykkes og samtidig oppdage alle tre målene som arbeidsflyten som presenteres her (figur 3). Syntetiske RNA-prøver av hvert av virusene som ble brukt i denne protokollen ble forsterket, noe som indikerer muligheten for å bruke for eksempel et multiplekset sett for påvisning av vanlige respiratoriske virus. Sensitiviteten til denne diagnostiske testen ligner tidligere rapporterte resultater i pasientprøver. I tilfeller der pasienter viser influensalignende symptomer, har bruk av en multiplekset sanntids RT-qPCR vist sammenlignbare resultater med SARS-CoV-2, influensa A og influensa B multiplekset analyse45.

Følsomhet og grense for deteksjon av internt multiplekset RT-qPCR-sett mot vanlige respiratoriske virus
Effektiviteten til det interne multipleksede settet ble vurdert ved hjelp av to sett primerblanding og det tilsvarende syntetiske RNA for hvert sett som illustrert i den multipleksede RT-qPCR-arbeidsflyten (figur 3). Ved å bruke hver primerblanding med 10 ganger seriell fortynning av hver syntetiske RNA-blanding fra 10 til 105 eksemplarer/μL som mal, kan sensitiviteten, spesifisiteten og deteksjonsgrensen for begge de utviklede multipleksede RT-qPCR bestemmes ved hjelp av standardkurveanalyse. Dette gjøres i tre uavhengige replikater av hver test, for å bekrefte effektiviteten og konsistensen til det multipleksede RT-qPCR-settet. Som et resultat kan de to settene som er utviklet her, lykkes med å forsterke alle tre målgenene samtidig med så lave som 10 RNA-kopier/reaksjoner sett ved amplifikasjonskurven og deteksjonsgrensen (LoD) (figur 4 og figur 5). Stigningstallet og R2-verdiene for hver kurve ble brukt til å evaluere effektiviteten til individuelle analyser (figur 4 og figur 5). R2-verdiene ga et estimat av godheten til den lineære tilpasningen til datapunktene. I en effektiv qPCR-analyse bør R2 være svært nær eller større enn 0,90. Forsterkningseffektiviteten av influensa A-, influensa- B- og SARS-CoV-2- eller MERS-CoV- og SARS-CoV-2-titreringer var over 99 % for alle primersett (figur 4 og figur 5). I tillegg beviser de små feilfeltene reproduserbarheten til hvert multiplekset RT-qPCR-sett. Det er viktig å merke seg at begge multipleksede settene ikke viste noen primerdimerdannelse siden det ikke er noen forsterkning med den negative kontrollen (data ikke vist). Dermed forsterket utformingen av begge settene alle målgener vellykket med pålitelighet, spesifisitet og følsomhet.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over den multipleksede ett-trinns RT-qPCR-settsamlingen. Montering av settet starter med ekspresjon og rensing av enzymer som trengs, Taq DNA-polymerase og MMLV revers transkriptase. Begge enzymene måtte føres gjennom to kolonner som illustrert. For det andre, etter rensingen var optimaliseringen av reaksjonsbetingelsene og det termiske syklusprogrammet som resulterte i optimale forhold for det multipleksede testsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Plasmidkonstruksjonene og renseresultatene av His-Taq Pol og C-His/Strep MMLV-RT. (A) Skjematisk fremstilling av de rekombinante His-Taq Pol og C-His/Strep MMLV-RT ekspresjonsplasmidene. Forkortelser: CSPA-promotor - kaldsjokkprotein A-promotor; RBS - ribosom bindende sted; 6x Hans - Hans-tag med seks histidiner; TEE - translasjonsforbedrende element; Taq ORF - Taq Pol åpen leseramme; Polh - polyhedrin promotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT åpen leseramme; TEV - etse virus protease målretting nettsted; 8x Hans - Hans-tag med åtte histidiner; Strep - Strep-tag; polyA - SV40 sent polyadenyleringssignal. (B) SDS-PAGE analyse av His-Taq Pol uttrykt i BL21 (DE3) E. coli-celler og Taq-polymerase. (C) SDS-PAGE-analyse av renset C-His/Strep MMLV-RT uttrykt i Sf9-cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk diagram over de to optimaliserte, standardiserte og utviklede multipleksede ett-trinns RT-qPCR-settene sammen med reaksjonskomponentene. Hver enkelt multiplekset reaksjon består av dNTP, bufferblanding, enzymblanding, multiplekset primerblanding og den syntetiske RNA-malen som skal testes. (A) Influensa A/B, SARS-CoV-2-sett og (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Forsterkningskurvene og deteksjonsgrensen for influensa A/B og SARS-CoV2 multiplex ett-trinns RT-qPCR-sett. Forsterkningskurvene til den multipleksede RT-qPCR ble utført ved bruk av syntetisk RNA-blanding med 10 ganger serielle fortynninger (10 til 105 kopier/μL) med alle mål (A) influensa A, (C) influensa B og (E) SARS-CoV-2. Reaksjonene ble utført i triplikat, og viser en replikat som et eksempel. Påvisningsgrensen for (B) influensa A, (D) influensa B og (F) SARS-CoV-2 ble bestemt ved å plotte gjennomsnittet av tre replikerteCt-verdier mot loggkopinummeret. Bestemmelseskoeffisienten (R2) og ligningen for den lineære regresjonskurven ble beregnet og vist i hvert panel. Feilfeltene representerer standardavviket mellom tre replikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Forsterkningskurvene og deteksjonsgrensen for MERS ORF1a/upE og SARS-CoV2 multiplex ett-trinns RT-qPCR-sett. Forsterkningskurvene til den multipleksede RT-qPCR ble utført ved bruk av en syntetisk RNA-blanding med 10 ganger serielle fortynninger (10 til 105 kopier/μL) med alle mål (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE og (E) SARS-Cov-2. Reaksjonene ble utført i triplikat, og viser en replikat som et eksempel. Deteksjonsgrensen for (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE og (F) SARS-CoV-2 ble bestemt ved å plotte gjennomsnittet av tre replikerteCt-verdier mot loggkopinummeret. Bestemmelseskoeffisienten (R2) og ligningen for den lineære regresjonskurven ble beregnet og vist i hvert panel. Feilfeltene representerer standardavviket mellom tre replikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1 Listen over komponentene for Taq-polymerase lysebuffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Rensebuffere for Taq-polymerase. Listen over bufferkomponenter som trengs for to-kolonne rensing av Taq DNA polymerase. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Lagringsbuffer for Taq-polymerase. Listen over bufferkomponenter som kreves for å dialysere Taq DNA-polymerase etter rensing. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Listen over komponentene for MMLV-RT lysisbuffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: MMLV-RT rensebuffere. Listen over bufferkomponentene som trengs for to-kolonne rensing av MMLV-RT. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: MMLV-RT lagringsbuffer. Listen over bufferkomponenter som trengs for å dialysere MMLV-RT etter rensing. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Primere og sonder. Sekvensinformasjonen til primere og sonder som trengs for hver multiplekset primerblanding. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er en stor økonomisk byrde på helsevesenet over hele verden som følge av de høye infeksjons- og dødelighetsratene på grunn av spredningen av vanlige luftveisvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV-variantene 12,19,20. Motivert av ansvarsfølelsen for å lette denne byrden, innså vi behovet for en rask, presis og tilgjengelig diagnostisk analyse som RT-qPCR for å skille mellom disse vanlige virusene i en test. På grunn av den multipleksede naturen til qRT-PCR, er det mulig å diagnostisere og skille SARS-CoV-2 fra andre respiratoriske virus, som influensa A / B og MERS-CoV-virus. Til slutt kan bedre og mer presis behandling av pasienter oppnås ved bruk av den nåværende multipleksede analysen46. For å rekapitulere, beskriver denne studien realiseringen av en intern ett-trinns multiplex RT-qPCR-test som kan målrette mot to forskjellige kombinasjoner. Hver kombinasjon består av tre forskjellige luftveisvirus for å begrense spredningen av slike smittsomme virus og redusere den økonomiske byrden på helsevesenet.

Det nåværende multipleksede RT-qPCR-settet kan målrette mot to kombinasjoner av vanlige respiratoriske virus (SARS-CoV-2, influensa A / B) og (SARS-CoV-2, MERS UpE / ORF1a). Den beskrevne protokollen er enkel, grei å følge og mye billigere enn de kommersielt tilgjengelige ett-trinns RT-qPCR-settene. En annen fordel var de multipleksede egenskapene til settet som kan målrette mot flere virale genetiske mål ved å bruke forskjellige sonde- og primerkombinasjoner. Dermed muliggjør allsidigheten og enkelheten til settet enkel implementering i ressursbegrensede innstillinger. Settet er også egnet for omfattende testing som resulterer i nøyaktig og presis diagnose som kan bidra til å begrense spredning og co-infeksjon av flere luftveisvirus.

Foreløpige analyser ble utført for å sikre at alle målene ble forsterket vellykket og med høy troskap for å begrense dannelsen av ikke-spesifikke produkter. Først gikk vi gjennom flere runder med optimalisering for komponentene i bufferblandingen og deres respektive konsentrasjoner i bufferblandingen. For det andre optimaliserte vi primerne og deres tilsvarende konsentrasjoner i både primerblandingen og PCR-reaksjonen. For det tredje optimaliserte vi sammensetningen av enzymblandingen for å maksimere aktiviteten og minimere den hemmende effekten av MMLV-RT på aktiviteten til Taq-polymerase47. For det fjerde optimaliserte vi de termiske syklusforholdene under hensyntagen til begrensningene for termisk stabilitet for begge enzymene. Med de nevnte forbedringene var den optimaliserte versjonen av vårt multipleksede RT-qPCR-sett presentert her i stand til å oppdage ned til 10 RNA-kopier/reaksjoner med høy spesifisitet, følsomhet og reproduserbarhet.

Noen forholdsregler må vurderes for å sikre høy effektivitet og vellykket implementering av multipleks-RT-qPCR-analysen, for å forhindre hemmere og unngå pipetteringsfeil. Siden hvert anlegg er unikt i sitt oppsett og instrumentering, er det noen trinn som kan hjelpe når du bygger et slikt sett: Først må hansker brukes til enhver tid for å unngå tilstedeværelse av forurensning og PCR-hemmer. For det andre, sørg for å bruke aerosolbestandige filterspisser og bruk en kalibrert pipette. I tillegg må du sørge for å bruke PCR-grade vann. Bruken av ikke-malkontroll vil bidra til å verifisere tilstedeværelsen av forurensning. Det er viktig å merke seg at masterblandingen må klargjøres for alle replikater for å unngå mulig kontaminering og pipetteringsvariasjon. Andre feilsøkingstips må vurderes for å opprettholde sondekvaliteten, for eksempel å aliquoting lageret og unngå bruk av vann for å fortynne det. Det er viktig å følge produsentens anbefalinger om lagring og fortynning av primeren og sonden som brukes. Dermed vil disse enkle tipsene bidra til å opprettholde suksessen til multiplex RT-qPCR-analysen og sikre høy effektivitet.

Selv om de multipleksede RT-qPCR-analysene utviklet i denne undersøkelsen har vist gode resultater når de testes med de syntetiske virale RNA-ene, må effektiviteten i en reell klinisk setting fortsatt evalueres og valideres. Dessverre gjør mangelen på kliniske prøver det vanskelig å bestemme analysens spesifisiteter og følsomhet for virusene som inngår i denne undersøkelsen. Det er imidlertid verdt å nevne at LOD (deteksjonsgrense), som indikerer minimum antall kopier som kan detekteres i 100% av prøvene, ble etablert gjennom en statistisk bevist lineær regresjon. Dette gir potensial for klinisk diagnostikk og er et viktig funn i forskningen.

En intern multiplex ett-trinns RT-qPCR-analyse som er sondebasert ble vellykket utviklet og validert med høy effekt i denne studien. SARS-CoV-2 kan lett oppdages og skilles fra andre vanlige luftveisvirus som forklart ovenfor med høy effektivitet og pålitelighet i bare ett reagensrør. Dermed vil avhengigheten av denne multipleksede funksjonen bidra til å øke gjennomstrømningen av diagnosen og spare tid, kostnader og prøve sammenlignet med andre testmetoder og singleplex PCR. Alt i alt er muligheten for at luftveisvirus sirkulerer sammen høy, og denne multiplex ett-trinns RT-qPCR vil være svært fordelaktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 201 Taq-polymerase MMLV-RT proteinuttrykk COVID-19 SARS-CoV-2 influensa A/B MERS-CoV multiplex RT-qPCR
Utvikling av multiplekse sanntids RT-qPCR-analyser for påvisning av SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter