Summary
我们推出了两种基于探针的内部一步法RT-qPCR试剂盒，用于常见呼吸道病毒。第一种检测是针对 SARS-CoV-2 （N）、甲型流感（H1N1 和 H3N2）和乙型流感。第二种是SARS-Cov-2（N）和MERS（UpE和ORF1a）。这些检测可以在任何专业实验室中成功实施。
Abstract
导致 2019 冠状病毒病 （COVID-19） 的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 对公众健康构成严重威胁。在流感季节，SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的传播可能导致全人群难以控制的呼吸道疾病负担。为此，在即将到来的秋冬季节，需要仔细监测呼吸道病毒SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和中东呼吸综合征（MERS-CoV），特别是在SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感的情况下，它们具有相似的流行病学因素，如易感人群、传播方式和临床综合征。如果没有靶标特异性检测，由于这些病毒的相似性，区分这些病毒的病例可能具有挑战性。因此，一种灵敏且有针对性的多重检测方法可以很容易地区分这些病毒靶标，这对医疗保健从业者很有用。在这项研究中，我们利用内部开发的 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒开发了一种基于实时逆转录酶 PCR 的检测方法，用于同时检测 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2、MERS-CoV。只需 10 个拷贝的合成 RNA，我们就可以以 100% 的特异性同时成功识别 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 MERS-CoV 靶标。该测定被发现是准确、可靠、简单、灵敏和特异性的。所开发的方法可用作医院、医疗中心和诊断实验室中优化的 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2、MERS-CoV 诊断检测以及研究目的。
Introduction
正在进行的 2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 的大流行是由称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2）1 的新型冠状病毒引起的。由于 SAR-CoV-2 具有很强的传染性和快速传播能力，COVID-19 大流行出现在中国武汉市，并迅速蔓延到世界各地。这最终导致呼吸窘迫体征的开始，甚至死亡2,3,4。COVID-19 已在超过 213 个国家/地区被宣布为大流行，预计确诊病例数量将急剧增加，不同研究发表的论文证明了这一点 3,5.COVID-19主要通过感染者释放到环境中的小呼吸道飞沫传播，然后通过吸入或密切接触受污染的表面暴露给脆弱个体。当这些飞沫接触到眼睛、嘴巴或鼻子的粘膜时，一个人可能会被感染6.世界卫生组织（WHO）公布的统计数据显示，全球新冠肺炎确诊病例已超过7600万例，死亡人数达到惊人的700万例7。因此，联合国将 COVID-19 疾病引起的大流行归类为灾难，因为它对全球数十亿人的生活产生直接影响，并产生深远的经济、环境和社会影响。
包括彻底检测、早期发现、接触者追踪和病例隔离在内的公共卫生举措都已被证明对控制这一大流行至关重要8,9,10,11。冬季将增加其他呼吸道病毒的传播，如甲型和乙型流感，并伴有类似 COVID-19 的症状，因此难以及早识别、追踪和隔离 COVID-19 实例。每年，甲型和乙型流感的爆发始于深秋或一月初，季节性可预测12.SARS-CoV-2 和流感病毒具有许多流行病学特征。此外，在易感人群中也有相似之处，包括儿童、老年人、免疫功能低下以及患有慢性合并症（如哮喘、慢性阻塞性肺病、心肾衰竭或糖尿病）的个体12,13。这些病毒不仅具有易感人群，而且具有接触途径和呼吸道飞沫的传播途径14。预计随着流感季节接近 14，患者可能会感染不止一种呼吸道病毒。为此，需要在隔离有症状的患者之前对 SARS-CoV-2 和流感病毒进行筛查。由于全球缺乏核酸提取和诊断资源，无法对三种病毒（SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感）进行单独检测。为了在一次反应中筛选它们，需要开发一种方法或测试。
中东呼吸综合征（MERS）-CoV是人类冠状病毒（CoV）家族的成员。第一批中东呼吸综合征冠状病毒分离株来自沙特阿拉伯的一名住院患者，该患者于2012年9月因急性呼吸道疾病死亡15。有证据表明，中东呼吸综合征冠状病毒的主要宿主是单峰骆驼。已经证明，来自受感染的单峰骆驼的病毒是人畜共患的，因此可以感染人类16,17。感染这种病毒的人可以通过密切接触将其传播给他人18.截至2018年1月26日，全球已有2143例中东呼吸综合征冠状病毒感染实验室确诊病例，包括750例死亡19。中东呼吸综合征冠状病毒最典型的症状是咳嗽、发烧和呼吸急促。据报告，中东呼吸综合征冠状病毒感染还表现出肺炎、腹泻和胃肠道疾病症状20。目前尚无针对中东呼吸综合征冠状病毒的商业疫苗或特定治疗方法。因此，及时和准确的诊断对于预防中东呼吸综合征冠状病毒大范围暴发和区分中东呼吸综合征冠状病毒与SARS-CoV-2疾病至关重要。
迄今为止，已经提出了许多方法来检测这些病毒，例如多重 RT-PCR21、22、23、24、25、CRISPR/Cas1226、27、CRISPR/Cas928 和 CRISPR/Cas329、侧向层免疫测定30、纸质生物分子传感器31、一锅 SHERLOCK 测试32、DNA 适配体33、环介导的等温放大（LAMP）19,34等上述每种方法在灵敏度和特异性方面都有独特的优点和缺点。在这些方法中，基于核酸扩增的检测：多重qRT-PCR是最常见的，被认为是诊断SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和MERS-CoV的金标准。
在这项研究中，我们设计并评估了各种引物组合和探针，以利用标准扭曲合成病毒 RNA 有效、准确和同时检测 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2、MERS-CoV。世界卫生组织 （WHO） 推荐针对 MERS-CoV 或 SARS-CoV-2 靶基因开发的多重检测方法。这些基因通常编码有助于形成复制/转录复合物 （RTC）35 的蛋白质和复合物，例如用于 MERS-CoV 检测的开放阅读框 1a （ORF1a） 内的区域。此外，结构蛋白由诊断测定中使用的基因编码，例如包膜基因 （upE） 和核衣壳基因 （N） 的上游区域，它们分别用于 MERS-CoV 和 SARS-Cov-2 测定35,36。我们使用内部的 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒建立了用于检测病毒的 RT-qPCR37。使用标准扭曲合成RNA的10倍连续稀释液测试和评估我们的R3T一步法RT-qPCR试剂盒和引物组的病毒检测、灵敏度、特异性和动态范围。最低实际检测限为每次反应约10个转录本拷贝。因此，内部 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒和引物/探针组可以成功用于 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2、MERS-CoV 的常规同时诊断。
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Protocol
1. Taq聚合酶的表达和纯化
- 在酶的C末端构建具有可切割的六组氨酸标签的质粒。
- 按照标准方案38将50ng表达载体转化为大肠杆菌BL21-（DE3）菌株。
- 将转化的细胞接种在四个6L烧瓶中，每个烧瓶在37°C下装有2L2YT培养基肉汤，以170rpm振荡，直到OD 600为0.8或细胞数6.4×108 。
- 用0.5mM异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导Taq聚合酶表达，并在16°C下进一步摇动孵育18小时。
- 通过在4°C下以7808× g 旋转10分钟来收获细胞。将沉淀重悬于200 mL冰冷的Taq聚合酶裂解缓冲液（表1）中，在5 mL / g细胞沉淀中。
- 将细胞与溶菌酶（2mg / mL裂解缓冲液）和蛋白酶抑制剂孵育45分钟，然后将裂解物通过30kPsi的细胞破坏物，并在4°C下以22,040× g 离心30分钟以分离细胞碎片。
- 在85°C下加热上清液15分钟。 在4°C下以95,834× g 旋转1小时。 收集上清液并使用0.45μm过滤器在冰上过滤。
- 使用快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 进行蛋白质纯化，首先使用 Taq 聚合酶缓冲液 A 将样品以 4 mL/min 的流速通过 Ni-NTA HP 5 mL 色谱柱（表 2;图1A）。
- 用 10 列体积 （CV） 的 Taq 聚合酶缓冲液 A 和 4% 的 Taq 聚合酶缓冲液 B 洗涤（表 2）。在 100 mL 瓶中使用 Taq 聚合酶缓冲液 B 超过 20 CV 以线性梯度洗脱结合蛋白。
- 使用 Taq 聚合酶缓冲液 C 将 100 mL 瓶中的洗脱液以 4 mL/min 的速度通过阳离子交换 5 mL 柱（表 2;图1A）。
- 用20CV的100%Taq聚合酶缓冲液C和5%Taq聚合酶缓冲液D洗涤（表2）。
- 使用Taq聚合酶缓冲液D（表2）从5%到100%的线性梯度洗脱。
- 如前所述，通过进行SDS-PAGE凝胶电泳 39 ，然后进行凝胶染 色40 来检查洗脱的级分。简而言之，取每个馏分 10 μL 并加入等体积的 2x SDS 上样染料。样品在90°C下变性10分钟。将样品加载到10%SDS-PAGE凝胶上，并在200V下运行凝胶25分钟，使用考马斯亮蓝染色凝胶，然后去染色。
- 收集含有纯化的Taq聚合酶的所有馏分，并在4°C下对taq聚合酶储存缓冲液（表3）进行透析。 简而言之，准备2L储存缓冲液，并将透析盒浸入缓冲液中2分钟以水合。使用针头将收集的馏分注入透析盒中，并在搅拌器上以200rpm的速度将其置于透析缓冲液中过夜。
- 透析后，使用分光光度计测量蛋白质浓度，制备10μL等分试样，在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
注意：在将所有缓冲液加载到FPLC系统之前，使用0.45μm过滤器过滤所有缓冲液进行纯化。
2. MMLV-RT在昆虫细胞表达系统中的表达及纯化
- 杆啶DNA的生成和分离
- 如前所述，使用 C 末端可切割的 TEV-8xHis-Strep 标签克隆 MMLV-RT 序列41。
- 将 100 ng 表达载体混合到 50 μL DH10Bac 细胞中，并通过敲击试管轻轻混合。
- 将细胞在冰上孵育15分钟。在42°C下对细胞进行热休克1分钟。
- 立即转移到冰上并加入 400 μL SOC 培养基。在37°C振荡孵育4小时。
- 将 10 μL 和 15 μL 混合物放在含有三种抗生素的 LB 琼脂平板上;50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素和 7 μg/mL 庆大霉素以及 40 μg/mL IPTG 和 100 μg/mL X-Gal 用于蓝白选择。
- 将板在37°C孵育48小时。挑选几个白色菌落和一个蓝色菌落作为对照，并在含有上述抗生素的新鲜LB琼脂平板上重新划线。将板在37°C孵育过夜。
- 确认白色表型后，挑选几个菌落，并将它们接种到含有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素和 7 μg/mL 庆大霉素的 10 mL LB 培养基中，装在 50 mL 试管中。
- 将培养物在37°C下以170rpm振荡孵育过夜。通过以 22,040 x g 旋转细胞 10 分钟来沉淀细胞。
- 倒出上清液，并将沉淀重悬于来自小型制备试剂盒的 250 μL 重悬溶液中（该溶液需要按照制造商的说明处理），然后将溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 加入 250 μL 裂解液，轻轻混合并孵育 3 分钟。加入 350 μL 中和溶液，倒置 2x-3x，并以 22,040 x g 离心 10 分钟。
- 将上清液转移到新鲜管中，加入等体积的冰冷异丙醇，并在-20°C下孵育30分钟。
- 通过以 22,040 x g 旋转 10 分钟来沉淀沉淀的 DNA。弃去上清液，用700μL70%冰冷乙醇洗涤沉淀，2x。
- 用移液管取出上清液，不要接触沉淀。让颗粒在层流罩中空气干燥 5-10 分钟或直到管中看不到液体。将沉淀溶解在 100 μL EB 缓冲液中。
- 杆啶转染和病毒扩增
- P1病毒制备
- 在 6 孔组织培养板中，将 ~ 9 x 105 个细胞/孔接种在 2 mL 昆虫细胞培养基中。
- 在室温下孵育板~30分钟，以使细胞附着。
- 按如下方式制备 Bacmid/Fugene 混合物：将 1 μg Bacmid DNA 和 300 μL 昆虫细胞培养基混合在一个试管中。在另一个试管中，混合 8 μL 转染试剂和 300 μL 昆虫细胞培养基。通过轻轻移液混合两种混合物，并在室温下静置~30分钟，以形成杆嘧胺/转染试剂复合物。
- 向每个孔中滴加杆窜复合物混合物（~210μL），并用透明薄膜密封板。
- 将板在27°C孵育3-4天。
- 取含有病毒的培养基，加入FBS（终浓度2%），使用0.45μm过滤器过滤，并在4°C下避光储存，作为P1病毒原液。
- P2病毒制备
- 在培养瓶中以 2 x 106 个细胞/mL 的速度转染 50 mL 昆虫细胞和 3 mL P1 病毒。
- 在27°C下以100rpm振荡孵育4-6天，直到死细胞百分比达到25%-30%。
- 以300× g 离心10分钟，收集含有病毒的上清液。
- 加入FBS至终浓度为2%，通过0.45μm过滤器过滤，各等分试样1mL，并作为P2病毒原液储存在-80°C下。
- P3病毒制备
- 在培养瓶中以 2 x 106 个细胞/mL 的速度将 100 mL 昆虫细胞与 2 mL P2 病毒一起转染。
- 在27°C下以100rpm振荡孵育3-4天，直到死细胞的百分比达到15%-20%。
- 将细胞以300× g 离心10分钟，并收集含有病毒的上清液。
- 加入FBS至终浓度为2%。通过0.45μm过滤器过滤。可在4°C避光保存1个月。
- P1病毒制备
- MMLV-RT在昆虫细胞中的表达和纯化
- 将 5 mL P3 病毒以 2 x 106 个细胞/mL（700 mL/2L 烧瓶）的密度加入新鲜昆虫细胞中，共 6 个烧瓶。
- 转染后55-60小时后，以7808×g旋转10分钟收获细胞。
- 将细胞沉淀重悬于200mL MMLV-RT裂解缓冲液中（表4）。将裂解物通过15kPsi的细胞干扰物，并在4°C下以22,040× g 离心30分钟。
- 将上清液转移到新管中，并在4°C下以95,834× g 再次旋转1小时。收集上清液并使用0.45μm过滤器在冰上过滤。
- 首先使用MMLV-RT缓冲液A以4 mL/min的流速将样品通过Ni-NTA Excel 5 mL色谱柱（图1B），开始使用FPLC进行蛋白质纯化（表5）。
- 用 10 CV 的 MMLV-RT 缓冲液 A 和 4% 的 MMLV-RT 缓冲液 B 洗涤色谱柱（表 5），并在 100 mL 瓶中以 20 CV 以上的 MMLV-RT 缓冲液 B 的线性梯度洗脱蛋白质。
- 将洗脱的样品通过用MMLV-RT缓冲液C平衡的Strep 5 mL色谱柱（图1B）（表5）。
- 用10CV的100%MMLV-RT缓冲液C洗涤色谱柱，并用20CV的缓冲液D以线性梯度洗脱蛋白质（表5）。
- 按照步骤1.13.-1.14执行SDS-PAGE检查洗脱的馏分。并收集含有纯化的MMLV-RT的馏分，以便在4°C下根据MMLV-RT储存缓冲液（表6）进行透析。
- 使用Nanodrop，等分试样，在液氮中快速冷冻并储存在-80°C下测量蛋白质浓度。
注意：在将所有缓冲液加载到FPLC系统之前，使用0.45μm过滤器过滤所有缓冲液进行纯化。
3. 内部多重R3T一步法RT-qPCR试剂盒组分的制备
- 缓冲液混合物制备
- 为RT-qPCR反应准备2x缓冲液，该缓冲液含有先前在37中显示的试剂。在无DNase / RNase的水中制备所有试剂，并将缓冲液混合物储存在-20°C冰箱中。
- 引物和探针套件以及引物混合物制备
注意：使用的探针和引物列在 表7中。流感和 SARS-CoV-2 多重试剂盒包含 3 个探针和 4 个正向和反向引物组。探针在 5' 末端使用报告基因 6-羧基荧光素 （FAM） 标记 InfA，Texas Red-XN 标记 SARS-CoV-2（N 基因）和 Yakima Yellow 标记 InfB。MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 多重试剂盒包含 3 个探针和 3 个正向和反向引物组。探针还使用报告基因Texas Red-XN标记MERS-CoV（ORF1a基因），VIC标记MERS-CoV（UpE基因）和6-羧基荧光素（FAM）SARS-CoV-2（N基因）。- 在 1.5 mL 试管中制备包含 表 7 中列出的所有引物和探针的引物混合物，每个正向和反向引物的终浓度为 6.7 μM，每个探针的终浓度为 1.25 μM。将引物混合物储存在-20°C冰箱中。使用洗脱缓冲液补足所需体积。
- 酶混合物制备
- 如 表3 所示，在Taq聚合酶储存缓冲液中制备Taq聚合酶（30U / μL）和MMLV-RT（60ng / μL）酶混合物，以弥补所需的体积。在冰上执行此步骤，并将酶混合物储存在-20°C。
- RNA模板
- 将SARS-CoV-2、甲型H1N1流感、甲型H3N2流感、乙型流感和MERS-CoV的合成RNA分别重悬于100μL 1x Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tri-Cl和1 mM EDTA（pH 8.0）中，制成1 x 106 RNA拷贝/μL的储备液。
- 以以下配置混合用于 RT-qPCR 的合成 RNA：1） SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感，将每种病毒原液的 5 μL 加入 50 μL 体积，制成 1 x 105 个 RNA 拷贝/μL;2） SARS-CoV-2、MERS-CoV，将每种病毒原液的 5 μL 加入 50 μL 体积，制成 1 x 105 个 RNA 拷贝/μL。 对每种合成 RNA 混合物进行 10 倍连续稀释，范围从 1 x 105 个 RNA 拷贝/μL 到 10 个 RNA 拷贝/μL。
注意：确保使用冰冷的 DNase/RNase-Free 水来准备模板的连续稀释液。
4. 内部多重 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感和 SARS-CoV-2、MERS-CoV 一步法 RT-qPCR 检测
注意：对工作站表面进行消毒，并使用96孔板模板来规划PCR板布局。
- 96孔板的制备
- 解冻 2x 缓冲液和引物混合物。将酶混合物放在冰上。
- 向每个孔中加入 10 μL 2x 缓冲液混合物、1.5 μL 引物混合物、1 μL 酶混合物、6.5 μL DNase/RNase-free 水和 1 μL 需要测试的相应 RNA 混合物。每个孔的最终体积为 20 μL。请参阅准备好的布局以获取有关此步骤的帮助。
注意：建议根据包含除RNA样品以外的所有试剂的反应数量进行预混液，以避免移液偏差。此外，一式两份或一式三份地进行反应，以避免技术错误。 - 用粘性PCR板密封板密封板，并短暂离心1分钟以收集板底部的所有液体。在将样品转移到qPCR机器之前，确保每个孔具有相同体积的液体并且没有气泡。
注意：所有PCR反应都需要在冰上设置。
- PCR程序
- 打开real-time qPCR机器程序，选择以下实验特性：
模块类型：快速 96 孔 （0.1 mL）
实验设置：标准曲线
试剂：TaqMan 试剂
运行属性：标准。 - 定义所有基因靶标及其报告染料，如 表7所示。此外，为要测试的每个反应定义样品名称，以便于分析扩增曲线。
- 根据 96 孔板将靶标和样品分配给程序的板布局。
- 在PCR仪器中设置以下循环程序，如下所示：
55°C10分钟
40 次循环：94 °C 持续 1 分钟
94°C10秒
68°C10秒
68°C20秒;这里获取荧光。 - 将板转移到实时qPCR机器中，并将其放入支架中，确保板的方向正确，然后开始运行。
- 选择文件位置以保存实验数据。
- 打开real-time qPCR机器程序，选择以下实验特性：
- 数据分析
- 首先检查qPCR程序产生的扩增图至关重要。分析检测限以评估可检测的最小RNA浓度。
- 在x轴上绘制RNA拷贝数的对数，在y轴上绘制相应的平均Ct值，以评估测定的灵敏度。斜率和 R2 表示反应的可靠性和效率。
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Representative Results
近年来，使用PCR方法检测常见呼吸道病毒的诊断方法取得了重大进展21,22,23,24,25。然而，尽管取得了这些进步，但允许在一次测试中检测多种病毒的多重方法尚未得到广泛实施，特别是在RT-qPCR平台中。该方法已使用合成RNA病毒和反应组分的内部优化成功实现37。通过使用检测限分析，诊断测定的特异性、灵敏度和可靠性被评估为高。所提出的方法可以大大提高呼吸道病毒诊断的效率和准确性，减少对多次检测的需求，并将误诊的风险降至最低，如43所示。需要进一步的研究来探索这种方法使用患者样本的好处，并鼓励其在临床实践中采用。
组氨酸标记的Taq DNA聚合酶的表达和纯化
基于Taq DNA聚合酶表达和纯化的既定方案44，在冷休克启动子的控制下构建N末端组氨酸标记的Taq DNA聚合酶质粒，以简化其表达和纯化过程，如上所述（图1A和图2A）。因此，只需改变IPTG浓度和温度，就可以轻松控制这种新结构体的表达水平。含有Taq DNA聚合酶质粒的细胞在16°C下与1mM IPTG一起孵育，结果显示His-Taq DNA聚合酶的表达增强。 此外，早期建立的方案44需要耗时的聚乙烯亚胺（PEI）沉淀步骤，由于最终产物纯度不受影响，并且与市售的Taq聚合酶相当，因此可以使用此处使用的构建体跳过该步骤（图2B）。 纯化的 Taq 聚合酶迁移速度比商业聚合酶慢，因为 N 末端的酶和组氨酸标签之间存在连接肽。用0.98 mg/L纯蛋白大肠杆菌培养物成功生产Taq DNA聚合酶。
His和Strep标记MMLV双逆转录酶的表达和纯化
如图2A所述，杆状病毒表达系统用于在昆虫细胞（Sf9）中表达具有C端双His和链球菌标签的MMLV-RT。先前的一项研究表明，当使用蚕-杆状病毒表达载体系统（蚕-BEVS）41在蚕中合成N-末端标记的蛋白质和C-末端标记的蛋白质时，C端标记的MMLV-RT表现出更高的活性。为了产生均匀的MMLV-RT蛋白，使用了与上述研究中相同的策略和方案。结果，如SDS-PAGE凝胶结果所示，昆虫细胞培养物的产量为7.5mg / L，实现了增强的表达和超过95%的纯蛋白质（图2C）。
多重qRT-PCR的优化和标准化
经过多轮缓冲液和引物混合物优化后，成功组装和生产了优化和开发的内部多重RT-qPCR检测，可同时检测三种不同的常见呼吸道病毒（图3）37。第一个试剂盒旨在靶向SARS-CoV-2 N基因、甲型H1N1和H3N2流感以及乙型流感基因;第二个试剂盒用于 SARS-CoV-2 N 基因、MERS ORF1a 和 upE 基因。因此，两种试剂盒都可以成功同时检测所有三个靶标，如图3所示。扩增了该协议中使用的每种病毒的合成RNA样品，表明可以使用诸如多重试剂盒来检测常见呼吸道病毒的可能性。该诊断测试的灵敏度与先前报告的患者样本结果相似。在患者出现流感样症状的情况下，使用多重实时 RT-qPCR 显示出与 SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感多重检测45 相当的结果。
内部多重RT-qPCR试剂盒对常见呼吸道病毒的灵敏度和检测限
使用两组引物混合物和每个试剂盒的相应合成RNA评估内部多重试剂盒的有效性，如多重RT-qPCR工作流程所示（图3）。使用每种引物混合物，每种合成RNA混合物的10倍连续稀释度（范围为10至105拷贝/ μL）为模板，可以使用标准曲线分析确定两种开发的多重RT-qPCR的灵敏度，特异性和检测限。这是在每次测试的三个独立重复中完成的，以确认多重RT-qPCR试剂盒的有效性和一致性。因此，这里开发的两种试剂盒可以成功地同时扩增所有三个靶基因，从扩增曲线和检测限（LoD）可以看出，RNA拷贝/反应低至10个（图4和图5）。每条曲线的斜率和R2值用于评估单个测定的效率（图4和图5）。R2 值提供了对数据点线性拟合优度的估计值。在高效的qPCR测定中，R2应非常接近或大于0.90。甲型流感、乙型流感和SARS-CoV-2或MERS-CoV和SARS-CoV-2滴定的扩增效率均高于99%（图4和图5）。此外，小误差线证明了每个多重RT-qPCR试剂盒的可重复性。需要注意的是，两种多重试剂盒均未显示任何引物二聚体形成，因为阴性对照没有扩增（数据未显示）。因此，两种试剂盒的设计都成功地扩增了所有靶基因，具有可靠性、特异性和灵敏度。
图1：多重一步法RT-qPCR试剂盒组装示意图。 试剂盒的组装从所需酶（Taq DNA 聚合酶和 MMLV 逆转录酶）的表达和纯化开始。如图所示，两种酶都需要通过两根色谱柱。其次，纯化之后是反应条件和热循环程序的优化，从而为多路复用测试套件提供了最佳条件。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：His-Taq Pol 和 C-His/Strep MMLV-RT 的质粒构建体和纯化结果。 （A） 重组 His-Taq Pol 和 C-His/Strep MMLV-RT 表达质粒的示意图。简称：CSPA启动子-冷休克蛋白A启动子;RBS - 核糖体结合位点;6x His - 含六种组氨酸的 His 标签;TEE - 翻译增强元件;Taq ORF - Taq Pol 开放式阅读框架;Polh - 多角体促进剂;MMLV-RT ORF - MMLV-RT开放式阅读架;TEV-蚀刻病毒蛋白酶靶向位点;8x His - 含有八种组氨酸的 His 标签;链球菌 - 链球菌标签;polyA - SV40晚期聚腺苷酸化信号。（B） BL21（DE3） 大肠杆菌 细胞和 Taq 聚合酶中表达的 His-Taq Pol 的 SDS-PAGE 分析。（C） Sf9 细胞中表达的纯化 C-His/Strep MMLV-RT 的 SDS-PAGE 分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：两种优化、标准化和开发的多重一步法 RT-qPCR 试剂盒及其反应组分的示意图。 每个单次多重反应由dNTP、缓冲液混合物、酶混合物、多重引物混合物和待测合成RNA模板组成。（a） 甲型/乙型流感、SARS-CoV-2 试剂盒和 （B） MERS ORF1a/upE、SARS-CoV-2。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：甲型/乙型流感和 SARS-CoV2 多重一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增曲线和检测限。使用合成RNA混合物进行多重RT-qPCR的扩增曲线，连续稀释度为10倍（10至10,5拷贝/μL），所有靶标（A）甲型流感，（C）乙型流感和（E）SARS-CoV-2。反应一式三份进行，以一次重复为例。（B） 甲型流感、（D） 乙型流感和 （F） SARS-CoV-2 的检测限是通过绘制三个重复的 Ct 值与对数拷贝数的平均值来确定的。计算决定系数 （R2） 和线性回归曲线方程并显示在每个面板中。误差线表示三个重复之间的标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图5：MERS ORF1a/upE和SARS-CoV2多重一步RT-qPCR试剂盒的扩增曲线和检测限。使用合成RNA混合物进行多重RT-qPCR的扩增曲线，该混合物具有10倍连续稀释液（10至10,5拷贝/μL），所有靶标（A）MERS ORF1a，（C）MERS upE和（E）SARS-Cov-2。反应一式三份进行，以一次重复为例。（B） MERS ORF1a、（D） MERS upE 和 （F） SARS-CoV-2 的检测限是通过绘制三个重复的 Ct 值与对数拷贝数的平均值来确定的。计算决定系数 （R2） 和线性回归曲线方程并显示在每个面板中。误差线表示三个重复之间的标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
表1： Taq聚合酶裂解缓冲液的组分列表。 请按此下载此表格。
表2：Taq聚合酶纯化缓冲液。 Taq DNA聚合酶两柱纯化所需的缓冲液组分列表。 请按此下载此表格。
表3：Taq聚合酶储存缓冲液。 纯化后透析Taq DNA聚合酶所需的缓冲液组分列表。 请按此下载此表格。
表4： MMLV-RT裂解缓冲液的组分列表。 请按此下载此表格。
表5：MMLV-RT纯化缓冲液。 MMLV-RT两柱纯化所需的缓冲液组分列表。 请按此下载此表格。
表 6：MMLV-RT 存储缓冲区。 纯化后透析 MMLV-RT 所需的缓冲液组分列表。 请按此下载此表格。
表 7：引物和探针信息。 每种多重引物混合物所需的引物和探针的序列信息。 请按此下载此表格。
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Discussion
由于SARS-CoV-2、甲型/乙型流感和中东呼吸综合征冠状病毒变异株等常见呼吸道病毒的传播，感染率和死亡率高，给全球医疗系统带来了沉重的经济负担12,19,20。出于减轻这种负担的责任感，我们意识到需要一种快速、精确和可及的诊断检测方法，例如 RT-qPCR，以在一次测试中区分这些常见病毒。由于qRT-PCR的多重特性，诊断和区分SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒（如甲型/乙型流感和中东呼吸综合征冠状病毒）是可行的。最终，使用目前的多重检测46可以实现对患者的更好和更精确的治疗。总而言之，本研究描述了一种内部一步法多重RT-qPCR检测的实现，该检测可以靶向两种不同的组合。每种组合都由三种不同的呼吸道病毒组成，以限制此类传染性病毒的传播并减轻医疗保健系统的经济负担。
目前的多重RT-qPCR试剂盒可以靶向两种常见呼吸道病毒（SARS-CoV-2、甲型/乙型流感）和（SARS-CoV-2、MERS UpE/ORF1a）的组合。所描述的方案简单易行，易于遵循，并且比市售的一步法RT-qPCR试剂盒便宜得多。另一个优点是该试剂盒的多重特性，可以通过利用不同的探针和引物组合来靶向多个病毒遗传靶标。因此，该套件的多功能性和简单性使得在资源有限的环境中能够直接实施。此外，该试剂盒适用于广泛的测试，从而实现准确和精确的诊断，有助于限制多种呼吸道病毒的传播和合并感染。
进行初步测定以确保所有靶标均成功扩增并具有高保真度，以限制非特异性产物的形成。首先，我们对缓冲液混合物的组分及其在缓冲液混合物中的各自浓度进行了几轮优化。其次，我们优化了引物混合物和PCR反应中的引物及其相应浓度。第三，我们优化了酶混合物的组成，以最大限度地提高其活性，并最大限度地降低MMLV-RT对Taq聚合酶47活性的抑制作用。第四，我们优化了热循环条件，同时考虑到两种酶的热稳定性的局限性。结合上述改进，我们这里介绍的多重RT-qPCR试剂盒的优化版本能够检测多达10个RNA拷贝/反应，具有高特异性、灵敏度和可重复性。
必须考虑一些预防措施，以确保多重RT-qPCR检测的高效和成功实施，以防止抑制剂并避免移液错误。由于每个设施的设置和仪器都是独一无二的，因此在构建此类试剂盒时，以下步骤可能会有所帮助：首先，需要始终佩戴手套，以避免任何污染和PCR抑制剂的存在。其次，确保使用防气溶胶过滤吸头并使用经过校准的移液器。此外，请确保使用PCR级水。使用无模板控制将有助于验证是否存在任何污染。需要注意的是，需要为所有重复准备预混液，以避免可能的污染和移液变化。为了保持探头质量，需要考虑其他故障排除技巧，例如对原液进行分装和避免使用水稀释。请务必遵循制造商关于储存和稀释所用底漆和探针的建议。因此，这些简单的技巧将有助于保持多重RT-qPCR检测的成功，并确保其高效率。
尽管本研究中开发的多重RT-qPCR检测在使用合成病毒RNA进行测试时显示出良好的结果，但其在实际临床环境中的有效性仍需评估和验证。不幸的是，临床标本的稀缺性使得很难确定该测定对本研究中包含的病毒的特异性和敏感性。然而，值得一提的是，LOD（检测限）表示在100%的样品中可以检测到的最小拷贝数，是通过统计学证明的线性回归建立的。这为临床诊断提供了潜力，是该研究的重要发现。
在这项研究中，成功开发了一种基于探针的内部多重一步法RT-qPCR检测方法，并进行了高效验证。如上所述，SARS-CoV-2 可以很容易地检测并与其他常见的呼吸道病毒区分开来，只需一个试管即可实现高效率和可靠性。因此，与其他检测方法和单重PCR相比，对这种多重功能的依赖将有助于提高诊断的通量，并节省时间、成本和样品。总而言之，呼吸道病毒一起传播的可能性很高，这种多重一步RT-qPCR将非常有利。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了阿卜杜拉国王科技大学（King Abdullah University of Science and Technology）通过核心资金和S.M.H.的国家学期大挑战（NTGC）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
| 6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
| Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
| Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Protein marker | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
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