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Biology

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B, और MERS-CoV का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम RT-qPCR परख का विकास

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

हम आम श्वसन वायरस के लिए दो जांच-आधारित इन-हाउस वन-स्टेप RT-qPCR किट पेश करते हैं। पहली परख SARS-CoV-2 (N), इन्फ्लुएंजा A (H1N1 और H3N2), और इन्फ्लुएंजा B के लिए है। दूसरा SARS-Cov-2 (N) और MERS (UpE और ORF1a) के लिए है। इन परखों को किसी भी विशेष प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।

Abstract

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) जो कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का कारण बनता है, आम जनता के स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। इन्फ्लूएंजा के मौसम के दौरान, SARS-CoV-2 और अन्य श्वसन वायरस के प्रसार से श्वसन रोग का जनसंख्या-व्यापी बोझ हो सकता है जिसे प्रबंधित करना मुश्किल है। उसके लिए, श्वसन वायरस SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS-CoV) को आगामी गिरावट और सर्दियों के मौसम में सावधानी से देखने की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा ए और इन्फ्लुएंजा बी के मामले में, जो अतिसंवेदनशील आबादी, संचरण के तरीके और नैदानिक सिंड्रोम जैसे समान महामारी विज्ञान कारकों को साझा करते हैं। लक्ष्य-विशिष्ट परख के बिना, इन वायरस के मामलों में उनकी समानता के कारण अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। तदनुसार, एक संवेदनशील और लक्षित मल्टीप्लेक्स परख जो आसानी से इन वायरल लक्ष्यों के बीच अंतर कर सकती है, स्वास्थ्य चिकित्सकों के लिए उपयोगी होगी। इस अध्ययन में, हमने SARS-CoV-3, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV का एक साथ पता लगाने के लिए इन-हाउस विकसित R2T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग करके एक रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-PCR-आधारित परख विकसित की। उनके सिंथेटिक आरएनए की कम से कम 10 प्रतियों के साथ, हम 100% विशिष्टता के साथ एक साथ SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और MERS-CoV लक्ष्यों की सफलतापूर्वक पहचान कर सकते हैं। यह परख सटीक, विश्वसनीय, सरल, संवेदनशील और विशिष्ट पाया जाता है। विकसित विधि का उपयोग अस्पतालों, चिकित्सा केंद्रों और नैदानिक प्रयोगशालाओं के साथ-साथ अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक अनुकूलित SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV नैदानिक परख के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

चल रहे कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) की महामारी गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2)1 के रूप में जानी जाने वाली नॉवल कोरोनावायरस के कारण होती है। SAR-CoV-2 की मजबूत संक्रामकता और तेजी से संचरण की क्षमता के कारण, COVID-19 महामारी वुहान शहर, चीन में उभरी और दुनिया भर में तेजी से फैल गई। यह अंततः श्वसन संकट के संकेतों और यहां तक कि मृत्यु 2,3,4 की शुरुआत का कारण बना। COVID-19 को 213 से अधिक देशों में एक महामारी घोषित किया गया है, पुष्टि किए गए मामलों की संख्या में भारी वृद्धि की उम्मीद है, जैसा कि विभिन्न शोध अध्ययनों 3,5 द्वारा प्रकाशित पत्रों से स्पष्ट है। COVID-19 मुख्य रूप से छोटी श्वसन बूंदों द्वारा प्रेषित होता है जो संक्रमित व्यक्ति पर्यावरण में छोड़ते हैं और फिर दूषित सतहों के साथ साँस लेने या निकट संपर्क के माध्यम से कमजोर व्यक्तियों के संपर्क में आते हैं। जब ये बूंदें आंखों, मुंह या नाक के म्यूकोसा के संपर्क में आती हैं, तो एक व्यक्ति संक्रमित हो सकताहै। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा जारी आंकड़े बताते हैं कि दुनिया भर में महामारी के 76 मिलियन से अधिक पुष्ट मामले सामने आए हैं, जिसमें 7 मिलियन मौतें हुईहैं। इस प्रकार, संयुक्त राष्ट्र ने COVID-19 रोग के कारण होने वाली महामारी को एक आपदा के रूप में वर्गीकृत किया क्योंकि इसका दुनिया भर के अरबों लोगों के जीवन पर सीधा प्रभाव पड़ा और इसके दूरगामी आर्थिक, पर्यावरणीय और सामाजिक प्रभाव पड़े।

पूरी तरह से परीक्षण, प्रारंभिक पहचान, संपर्क अनुरेखण और मामले के अलगाव सहित सार्वजनिक स्वास्थ्य पहलों को इस महामारी को नियंत्रण में रखने में महत्वपूर्ण दिखाया गयाहै 8,9,10,11. सर्दियों के महीनों में इन्फ्लुएंजा ए और बी जैसे अन्य श्वसन वायरस के प्रसार में वृद्धि होगी, जिसमें COVID-19 जैसे लक्षण होंगे, जिससे COVID-19 मामलों को पहचानना, ट्रैक करना और अलग करना मुश्किल हो जाएगा। हर साल, इन्फ्लुएंजा ए और बी का प्रकोप देर से गिरने या जनवरी की शुरुआत में अनुमानित मौसमी12 के साथ शुरू होता है। SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस द्वारा कई महामारी विज्ञान लक्षण साझा किए जाते हैं। इसके अलावा, अतिसंवेदनशील आबादी में समानताएं साझा करना जिसमें बच्चे, बुजुर्ग, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड और अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, कार्डियक और रीनल फेल्योर, या डायबिटीज12,13 जैसे क्रोनिक कॉमरेडिटी वाले व्यक्ति शामिल हैं। ये वायरस न केवल कमजोर आबादी को साझा करते हैं बल्कि संपर्क और श्वसन बूंदों के संचरण मार्गों को भी साझाकरते हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि फ्लू के मौसममें 14 के करीब पहुंचने पर रोगियों को इनमें से एक से अधिक श्वसन वायरस की संभावना हो सकती है। इसके लिए, SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस की जांच रोगसूचक रोगियों पर अलग-थलग करने से पहले की जानी चाहिए। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और निदान के लिए संसाधनों की वैश्विक कमी के कारण तीन वायरस (SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, और इन्फ्लुएंजा B) के लिए अलग-अलग परीक्षण चलाना संभव नहीं है। उन सभी को एक प्रतिक्रिया में स्क्रीन करने के लिए, एक विधि या परीक्षण विकसित करने की आवश्यकता है।

मिडिल ईस्ट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम (MERS)-CoV एक मानव कोरोनावायरस (CoV) परिवार का सदस्य है। पहला MERS-CoV वायरस आइसोलेट्स सऊदी अरब में एक अस्पताल में भर्ती मरीज से आया था, जिसकी सितंबर 2012 में तीव्र श्वसन समस्याओंके कारण मृत्यु हो गई थी। ऐसे सबूत हैं जो बताते हैं कि MERS-CoV के लिए एक प्रमुख जलाशय मेजबान ड्रोमेडरी ऊंट है। यह साबित हो गया है कि संक्रमित ड्रोमेडरी ऊंटों से वायरस जूनोटिक हैं और इस प्रकार मनुष्योंको 16,17 संक्रमित कर सकते हैं। इस वायरस से संक्रमित मनुष्य निकट संपर्क18 के माध्यम से दूसरों को यह फैल सकता है. 26जनवरी, 2018 तक, MERS-CoV संक्रमण के 2143 प्रयोगशाला-पुष्ट मामले सामने आए थे,जिनमें विश्व स्तर पर 750 मौतें शामिल थीं। सबसे विशिष्ट MERS-CoV लक्षण खांसी, बुखार और सांस की तकलीफ हैं। MERS-CoV संक्रमण भी निमोनिया, दस्त और जठरांत्र संबंधी बीमारीके लक्षण 20 प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया है. वर्तमान में, MERS-CoV के लिए कोई व्यावसायिक टीका या विशिष्ट उपचार उपलब्ध नहीं है। इसलिए, व्यापक MERS-CoV के प्रकोप को रोकने और MERS-CoV को SARS-CoV-2 रोग से अलग करने के लिए शीघ्र और सटीक निदान आवश्यक है।

आज तक, इन वायरस का पता लगाने के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं जैसे मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर 21,22,23,24,25, सीआरआईएसपीआर/सीएएस 1226,27, सीआरआईएसपीआर / कैस 928, और सीआरआईएसपीआर / कैस 329, पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे30, पेपर-आधारित बायोमोलेक्यूलर सेंसर31, एक पॉट32 में शेरलॉक परीक्षण, डीएनए एपटामर 33, लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (दीपक)19,34, आदि। उपरोक्त विधियों में से प्रत्येक में संवेदनशीलता और विशिष्टता के संदर्भ में अद्वितीय लाभ और कमियां हैं। इन विधियों में, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन-आधारित परीक्षण: मल्टीप्लेक्स qRT-PCR, सबसे आम है और इसे SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B और MERS-CoV के निदान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है।

इस अध्ययन में, हमने मानक ट्विस्ट सिंथेटिक वायरल आरएनए का उपयोग करके SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के प्रभावी, सटीक और एक साथ पता लगाने के लिए विभिन्न प्राइमर संयोजनों और जांचों का डिज़ाइन और मूल्यांकन किया। MERS-CoV या SARS-CoV-2 लक्ष्य जीन के लिए विकसित मल्टीप्लेक्स assays की सिफारिश विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) द्वारा की जाती है। ये जीन आम तौर पर प्रोटीन और कॉम्प्लेक्स को एन्कोड करते हैं जो प्रतिकृति/प्रतिलेखन परिसर (RTC)35 के निर्माण में योगदान करते हैं जैसे कि खुले रीडिंग फ्रेम 1a (ORF1a) के भीतर का क्षेत्र जिसका उपयोग MERS-CoV परख के लिए किया जाता है। इसके अलावा, संरचनात्मक प्रोटीन नैदानिक परख में उपयोग किए जाने वाले जीन द्वारा एन्कोड किए जाते हैं जैसे कि लिफाफा जीन (यूपीई) और न्यूक्लियोकैप्सिड जीन (एन) के अपस्ट्रीम क्षेत्र जो एमईआरएस-सीओवी और एसएआरएस-सीओवी -2 परख के लिए उपयोग किए जाते हैं, क्रमशः35,36। हमने वायरस37 का पता लगाने के लिए RT-qPCR स्थापित करने के लिए इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग किया। वायरस का पता लगाने, संवेदनशीलता, विशिष्टता, और हमारे R3T एक कदम RT-qPCR किट और प्राइमर सेट की गतिशील रेंज परीक्षण और मानक मोड़ सिंथेटिक RNAs के 10 गुना धारावाहिक dilutions का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया. सबसे कम व्यावहारिक पहचान सीमा प्रति प्रतिक्रिया लगभग 10 प्रतिलेख प्रतियां थी। नतीजतन, इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट और प्राइमर/प्रोब सेट को SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के नियमित एक साथ निदान के लिए सफलतापूर्वक उपयोग और कार्यान्वित किया जा सकता है।

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Protocol

1. Taq पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

  1. एंजाइम के सी-टर्मिनस पर एक दरार हेक्सा-हिस्टिडाइन टैग के साथ एक प्लाज्मिड का निर्माण करें।
  2. मानक प्रोटोकॉल38 के बाद ई कोलाई BL21- (DE3) तनाव में अभिव्यक्ति वेक्टर के 50 एनजी रूपांतरण.
  3. चार 6 एल बोतल में तब्दील कोशिकाओं को टीका लगाएं, जिनमें से प्रत्येक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2YT मीडिया शोरबा के 2 एल होते हैं, जब तक कि 0.8 के आयुध डिपो 600 या सेल नंबर 6.4 x 108 तक नहीं पहुंच जाता।
  4. आइसोप्रोपाइल-β-डी-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) के 0.5 मिमी के साथ टाक पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और झटकों के साथ 18 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर आगे सेते हैं।
  5. 10 मिनट के लिए 7808 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें नीचे कताई द्वारा कोशिकाओं फसल. सेल गोली के 5 एमएल / जी में एक बर्फ-ठंडा टाक पोलीमरेज़ लाइसिस बफर (तालिका 1) के 200 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  6. लाइसोजाइम (2 मिलीग्राम/एमएल लाइसिस बफर) और प्रोटीज अवरोधकों के साथ कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर सेल मलबे को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30 केपीएसआई और 22,040 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पर सेल विघटनकर्ता के माध्यम से लाइसेट पास करें।
  7. 85 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला गर्मी. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 95,834 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग बर्फ पर यह फिल्टर.
  8. फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) का उपयोग करके प्रोटीन शुद्धि करें पहले टीए-एनटीए एचपी 5 एमएल कॉलम के माध्यम से नमूना पास करके 4 एमएल/मिनट प्रवाह दर पर टाक पोलीमरेज़ बफर ए(तालिका 2; चित्रा 1 ए)।
  9. Taq पोलीमरेज़ बफर A के 10 कॉलम वॉल्यूम (CV) और Taq पोलीमरेज़ बफर B (तालिका 2) के 4% के साथ धोएं। 100 एमएल बोतल में 20 सीवी पर टाक पोलीमरेज़ बफर बी का उपयोग करके एक रैखिक ढाल के साथ बाध्य प्रोटीन को एल्यूट करें।
  10. टाक पोलीमरेज़ बफर सी (तालिका 2) का उपयोग करके 4 एमएल/मिनट पर एक कटियन एक्सचेंज 5 एमएल कॉलम के माध्यम से 100 एमएल बोतल में एलुएंट पास करें; चित्रा 1 ए)।
  11. 100% Taq पोलीमरेज़ बफर सी और 5% Taq पोलीमरेज़ बफर डी(तालिका 2)के 20 CV के साथ धोएं।
  12. Taq पोलीमरेज़ बफर डी (तालिका 2) का उपयोग करके 5% से 100% तक शुरू करके एक रैखिक ढाल के साथ एल्यूट करें।
  13. एसडीएस-पेज जेल वैद्युतकणसंचलन 39 के बाद जेल धुंधला 40 के रूप में पहले वर्णित प्रदर्शन करके eluted अंशों की जाँच करें. संक्षेप में, प्रत्येक अंश के 10 माइक्रोन लें और 2x एसडीएस लोडिंग डाई की बराबर मात्रा जोड़ें। 10 मिनट के लिए 90ओसी पर नमूना denature. नमूनों को 10% एसडीएस-पेज जेल पर लोड करें और 200 वी पर 25 मिन के लिए जेल चलाएं कूमासी ब्रिलियंट ब्लू का उपयोग करके जेल को दाग दें और फिर डी-स्टेन।
  14. शुद्ध Taq पोलीमरेज़ होते हैं कि सभी अंशों लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर taq पोलीमरेज़ भंडारण बफर(तालिका 3)के खिलाफ dialyze. संक्षेप में, भंडारण बफर के 2 एल तैयार करें और हाइड्रेट करने के लिए 2 मिनट के लिए बफर में डायलिसिस कैसेट को विसर्जित करें। डायलिसिस कैसेट में एक सुई का उपयोग कर एकत्रित अंशों इंजेक्ट और उत्तेजक पर 200 rpm पर डायलिसिस बफर में रात भर छोड़ दें.
  15. डायलिसिस के बाद, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें, 10 माइक्रोन एलिकोट बनाएं, तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: FPLC सिस्टम में लोड करने से पहले 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके शुद्धिकरण के लिए सभी बफ़र्स फ़िल्टर करें।

2. कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धिकरण में एमएमएलवी-आरटी अभिव्यक्ति

  1. बैकमिड डीएनए पीढ़ी और अलगाव
    1. MMLV-RT के अनुक्रम को C-टर्मिनस क्लीवेबल TEV-8xHis-Strep टैग के साथ क्लोन करें जैसा कि पहले41 वर्णित है।
    2. DH10Bac कोशिकाओं के 50 माइक्रोन में अभिव्यक्ति वेक्टर के 100 एनजी मिलाएं और ट्यूब को टैप करके धीरे मिलाएं।
    3. 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं. 42 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को हीट-शॉक करें।
    4. तुरंत बर्फ पर स्थानांतरण और S.O.C माध्यम के 400 माइक्रोन जोड़ें. 4 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. प्लेट 10 माइक्रोन और एलबी अगर प्लेटों पर मिश्रण के 15 माइक्रोन तीन एंटीबायोटिक दवाओं वाले; नीले-सफेद चयन के लिए 50 μg/mL Kanamycin, 10 μg/mL Tetracycline और 7 μg/mL Gentamicin के साथ 40 μg/mL IPTG और 100 μg/mL X-Gal।
    6. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। एक नियंत्रण के रूप में कई सफेद कालोनियों और एक नीली कॉलोनी उठाओ, और ऊपर एंटीबायोटिक दवाओं युक्त ताजा एलबी अगर प्लेटों पर उन्हें फिर से लकीर. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
    7. सफेद फेनोटाइप की पुष्टि करने के बाद, कुछ कॉलोनियों को चुनें और उन्हें 50 एमएल ट्यूबों में 50 माइक्रोग्राम / एमएल कनामाइसिन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन और 7 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन युक्त एलबी मीडिया के 10 एमएल में टीका लगाएं।
    8. रात भर 170 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 22,040 x ग्राम पर उन्हें नीचे कताई द्वारा कोशिकाओं नीचे गोली.
    9. सतह पर तैरनेवाला छानना और miniprep किट से resuspension समाधान के 250 माइक्रोन में गोली resuspended (इस समाधान निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाला जा करने की जरूरत है), तो एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण.
    10. lysis समाधान के 250 माइक्रोन जोड़ें, धीरे मिश्रण और 3 मिनट के लिए सेते हैं। बेअसर समाधान के 350 माइक्रोन जोड़ें, 10 मिनट के लिए 2x-3x और अपकेंद्रित्र को 22,040 x ग्राम पर पलटें।
    11. सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ-ठंडा आइसोप्रोपेनॉल की एक समान मात्रा जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. 10 मिनट के लिए 22,040 x ग्राम पर कताई द्वारा अवक्षेपित डीएनए नीचे गोली। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% बर्फ-ठंडा इथेनॉल, 2x के 700 माइक्रोन के साथ गोली धो लें।
    13. गोली को छूने के बिना एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें. 5-10 मिनट के लिए या जब तक कोई तरल ट्यूब में देखा जाता है लामिना का प्रवाह हुड में गोली हवा शुष्क करते हैं. ईबी बफर के 100 माइक्रोन में गोली भंग।
  2. Bacmid अभिकर्मक और वायरस प्रवर्धन
    1. P1 वायरस की तैयारी
      1. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में, बीज ~ 9 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से कीट सेल संस्कृति माध्यम के 2 एमएल में.
      2. कमरे के तापमान पर ~ 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं कोशिकाओं संलग्न करने की अनुमति देने के लिए.
      3. Bacmid/Fugene मिश्रण निम्नानुसार तैयार करें: एक ट्यूब में Bacmid डीएनए के 1 μg और कीट कोशिकाओं मीडिया के 300 μL मिलाएं। एक अन्य ट्यूब में, अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 माइक्रोन और कीट कोशिकाओं मीडिया के 300 माइक्रोन मिलाएं। कोमल pipetting द्वारा दोनों मिश्रण मिक्स और bacmid/अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर के रूप में करने के लिए कमरे के तापमान पर ~ 30 मिनट के लिए छोड़ दें.
      4. प्रत्येक अच्छी तरह से ड्रॉपवाइज में बेकमिड कॉम्प्लेक्स मिक्स (~ 210 माइक्रोन) जोड़ें और प्लेट को पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें।
      5. 3-4 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
      6. वायरस शामिल है जो माध्यम ले लो, FBS (अंतिम एकाग्रता 2%) जोड़ें, 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फिल्टर और पी 1 वायरस शेयर के रूप में अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
    2. P2 वायरस की तैयारी
      1. एक संवर्धन फ्लास्क में पी 1 वायरस के 3 एमएल के साथ 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर कीट कोशिकाओं के 50 एमएल को ट्रांसफेक्ट करें।
      2. मृत कोशिकाओं का प्रतिशत 25% -30% तक पहुँच जब तक 4-6 दिनों के लिए 100 rpm पर मिलाते हुए 27 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
      3. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और वायरस शामिल सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
      4. FBS को 2% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर और विभाज्य 1 एमएल प्रत्येक के माध्यम से फ़िल्टर करें और P2 वायरस स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. P3 वायरस की तैयारी
      1. एक संवर्धन फ्लास्क में पी 2 वायरस के 2 एमएल के साथ 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर कीट कोशिकाओं के 100 एमएल को ट्रांसफेक्ट करें।
      2. मृत कोशिकाओं का प्रतिशत 15% -20% तक पहुंचने तक 3-4 दिनों के लिए 100 आरपीएम पर झटकों के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      3. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और उस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें जिसमें वायरस होता है।
      4. FBS को 2% की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। इसे 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. कीट कोशिकाओं में MMLV-RT की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण
    1. कुल 6 फ्लास्क में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (700 एमएल/2एल फ्लास्क) के घनत्व पर ताजा कीट कोशिकाओं में पी 3 वायरस के 5 एमएल जोड़ें।
    2. 10 मिनट के लिए 7808 x ग्राम पर कताई द्वारा अभिकर्मक के 55-60 घंटे के बाद कोशिकाओं फसल.
    3. एमएमएलवी-आरटी लाइसिस बफर(तालिका 4)के 200 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। 15 kPsi पर एक सेल विघटनकारी के माध्यम से lysate पास और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 22,040 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
    4. सतह पर तैरनेवाला को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 95,834 x ग्राम पर फिर से स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग बर्फ पर यह फिल्टर.
    5. एमएमएलवी-आरटी बफर ए(तालिका 5)का उपयोग करके 4 एमएल/मिनट प्रवाह दर पर नी-एनटीए एक्सेल 5 एमएल कॉलम (चित्रा 1बी)के माध्यम से नमूना पास करके एफपीएलसी का उपयोग करके प्रोटीन शुद्धि शुरू करें।
    6. एमएमएलवी-आरटी बफर ए के 10 सीवी और एमएमएलवी-आरटी बफर बी (तालिका 5) के 4% के साथ कॉलम को धोएं और 100 एमएल बोतल में 20 सीवी पर एमएमएलवी-आरटी बफर बी के रैखिक ढाल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें।
    7. स्ट्रेप 5 एमएल कॉलम (चित्रा 1 बी) के माध्यम से एल्यूटेड नमूना पास करें जो एमएमएलवी-आरटी बफर सी(तालिका 5)के साथ संतुलित है।
    8. कॉलम को 100% एमएमएलवी-आरटी बफर सी के 10 सीवी के साथ धोएं और बफर डी(तालिका 5)के 20 सीवी के साथ रैखिक ढाल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें।
    9. एसडीएस-पेज प्रदर्शन करके एल्यूटेड अंशों की जांच करें जैसा कि चरण 1.13.-1.14 है। और उन अंशों को इकट्ठा करें जिनमें शुद्ध एमएमएलवी-आरटी होता है जिसे एमएमएलवी-आरटी स्टोरेज बफर (तालिका 6) के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर डायल किया जाता है।
    10. नैनोड्रॉप, विभाज्य का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें, तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: FPLC सिस्टम में लोड करने से पहले 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके शुद्धिकरण के लिए सभी बफ़र्स फ़िल्टर करें।

3. इन-हाउस मल्टीप्लेक्स R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट घटकों की तैयारी

  1. बफर मिक्स तैयारी
    1. RT-qPCR प्रतिक्रिया के लिए 2x बफर तैयार करें जिसमें पहले से दिखाए गए अभिकर्मक शामिल हैं37. DNase/RNase मुक्त पानी और बफर मिश्रण एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत में सभी अभिकर्मकों तैयार करें.
  2. प्राइमर और जांच सेट और प्राइमर मिश्रण तैयारी
    नोट: जांच और प्राइमरों का इस्तेमाल तालिका 7 में सूचीबद्ध हैं। इन्फ्लुएंजा और SARS-CoV-2 मल्टीप्लेक्स किट में 3 प्रोब और 4 फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सेट होते हैं। जांच को InfA के लिए संवाददाताओं 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (FAM), SARS-CoV-2 (N जीन) के लिए टेक्सास रेड-XN और InfB के लिए याकिमा येलो का उपयोग करके 5′ सिरों पर लेबल किया जाता है। MERS-CoV और SARS-CoV-2 मल्टीप्लेक्स किट में 3 प्रोब और 3 फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सेट होते हैं। MERS-CoV (ORF1a जीन) के लिए टेक्सास रेड-XN, MERS-CoV (UpE जीन) के लिए VIC और 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (FAM) SARS-CoV-2 (N जीन) का उपयोग करके 5′ सिरों पर जांच को भी लेबल किया जाता है।
    1. तालिका 7 में सूचीबद्ध सभी प्राइमरों और जांच से युक्त एक प्राइमर मिश्रण तैयार करें, जिसमें प्रत्येक आगे और रिवर्स प्राइमर के लिए 6.7 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता और 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक जांच के लिए 1.25 माइक्रोन हो। प्राइमर मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। आवश्यक मात्रा बनाने के लिए क्षालन बफर का प्रयोग करें।
  3. एंजाइम मिश्रण तैयारी
    1. आवश्यक मात्रा बनाने के लिए तालिका 3 में दिखाए गए अनुसार Taq पोलीमरेज़ स्टोरेज बफर में Taq पोलीमरेज़ (30 U/μL) और MMLV-RT (60 ng/μL) एंजाइम मिश्रण तैयार करें। बर्फ पर इस कदम को करें और एंजाइम मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. आरएनए टेम्पलेट
    1. SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A H1N1, इन्फ्लुएंजा A H3N2, इन्फ्लुएंजा B और MERS-CoV के सिंथेटिक RNAs को अलग-अलग 1x Tris-EDTA बफर (10 mM Tri-Cl और 1 mM EDTA (pH 8.0) के 100 μL में 1 x 106 RNA प्रतियों/μL का स्टॉक बनाने के लिए फिर से निलंबित करें।
    2. निम्नलिखित विन्यासों में RT-qPCR के लिए सिंथेटिक RNAs मिलाएं: 1) SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A और इन्फ्लुएंजा B प्रत्येक वायरस स्टॉक के 5 μL को 50 μL मात्रा में जोड़कर 1 x 105 RNA प्रतियां/μL बनाने के लिए; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV प्रत्येक वायरस स्टॉक के 5 μL को 50 μL मात्रा में जोड़कर 1 x 105 RNA प्रतियां/μL बनाने के लिए। प्रत्येक सिंथेटिक आरएनए मिश्रण के 10 गुना सीरियल डाइल्यूशन बनाएं 1 x 10आरएनए प्रतियां/μL से लेकर 10 RNA प्रतियां/μL तक।
      नोट: टेम्प्लेट के सीरियल कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए बर्फ-ठंडे DNase/RNase-मुक्त पानी का उपयोग करना सुनिश्चित करें।

4. इन-हाउस मल्टीप्लेक्स SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B और SARS-CoV-2, MERS-CoV वन-स्टेप RT-qPCR टेस्ट

नोट: वर्कस्टेशन सतहों कीटाणुरहित करें और पीसीआर प्लेट लेआउट की योजना बनाने के लिए 96-वेल प्लेट टेम्पलेट का उपयोग करें।

  1. 96-अच्छी तरह से प्लेट की तैयारी
    1. पिघलाएं 2x बफर और प्राइमर मिश्रण। बर्फ पर एंजाइम मिश्रण रखें।
    2. प्रत्येक कुएं में, 2x बफर मिश्रण के 10 माइक्रोन, प्राइमर मिश्रण के 1.5 माइक्रोन, एंजाइम मिश्रण के 1 माइक्रोन, डीएनएएस/आरएनएज-मुक्त पानी के 6.5 माइक्रोन और संबंधित आरएनए मिश्रण के 1 माइक्रोन जोड़ें जिन्हें परीक्षण करने की आवश्यकता है। प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा 20 माइक्रोन है। कृपया इस चरण में सहायता के लिए तैयार लेआउट देखें।
      नोट: यह पाइपिंग पूर्वाग्रह से बचने के लिए आरएनए नमूने को छोड़कर सभी अभिकर्मकों वाले प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर एक मास्टर मिश्रण बनाने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, तकनीकी त्रुटियों से बचने के लिए प्रतिक्रियाओं को डुप्लिकेट या ट्रिपल में करें।
    3. प्लेट के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए संक्षेप में एक चिपकने वाला पीसीआर प्लेट सील और अपकेंद्रित्र के साथ प्लेट को सील करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से तरल की एक ही मात्रा है और qPCR मशीन के लिए नमूने हस्तांतरण से पहले बुलबुले से मुक्त है.
      नोट: सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बर्फ पर स्थापित करने की आवश्यकता है।
  2. पीसीआर कार्यक्रम
    1. वास्तविक समय qPCR मशीन कार्यक्रम खोलें और निम्नलिखित प्रयोगात्मक गुण चुनें:
      ब्लॉक प्रकार: फास्ट 96-वेल (0.1 एमएल)
      प्रयोग सेटअप: मानक वक्र
      अभिकर्मकों: TaqMan अभिकर्मकों
      गुण चलाएँ: मानक।
    2. तालिका 7 में प्रस्तुत के रूप में सभी जीन लक्ष्य और उनके रिपोर्टर डाई को परिभाषित करें। इसके अलावा, प्रवर्धन घटता के आसान विश्लेषण के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए नमूना नाम परिभाषित.
    3. 96 अच्छी तरह से थाली के आधार पर कार्यक्रम की प्लेट लेआउट के लिए लक्ष्य और नमूने आवंटित.
    4. पीसीआर उपकरण में निम्न चक्र कार्यक्रम निम्नानुसार सेट करें:
      10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
      40 चक्र: 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
      10 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
      10 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस
      20 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; यहाँ प्रतिदीप्ति अधिग्रहण.
    5. थाली वास्तविक समय qPCR मशीन के लिए स्थानांतरण और थाली का सही अभिविन्यास सुनिश्चित करने और रन शुरू करने धारक में जगह है.
    6. प्रयोगात्मक डेटा को बचाने के लिए फ़ाइल स्थान चुनें.
  3. डेटा विश्लेषण
    1. पहले qPCR कार्यक्रम द्वारा उत्पादित प्रवर्धन भूखंडों की जांच करना आवश्यक है। पता लगाया जा सकता है कि न्यूनतम शाही सेना एकाग्रता का आकलन करने के लिए पता लगाने की सीमा का विश्लेषण.
    2. परख की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक्स-अक्ष पर आरएनए कॉपी नंबर और वाई-अक्ष पर संबंधित औसत सीटी मान का लॉग प्लॉट करें। ढलान और आर2 प्रतिक्रिया की विश्वसनीयता और दक्षता को इंगित करते हैं।

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Representative Results

हाल के वर्षों में, पीसीआर दृष्टिकोण 21,22,23,24,25का उपयोग करके सामान्य श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए नैदानिक दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। हालांकि, इन प्रगति के बावजूद, मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण, जो एक ही परीक्षण में कई वायरस का पता लगाने की अनुमति देता है, को व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है, खासकर आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म में। इस विधि को सिंथेटिक आरएनए वायरस और प्रतिक्रिया घटकों37 के घर में अनुकूलन का उपयोग सफलतापूर्वक लागू किया गया है. नैदानिक परख की विशिष्टता, संवेदनशीलता और विश्वसनीयता का पता लगाने के विश्लेषण की सीमा के उपयोग के माध्यम से उच्च होने का आकलन किया गया था। प्रस्तुत दृष्टिकोण श्वसन वायरस निदान की दक्षता और सटीकता में काफी सुधार कर सकता है, कई परीक्षणों की आवश्यकता को कम कर सकता है और43 में गलत निदान के जोखिम को कम कर सकता है। रोगी के नमूनों का उपयोग करके इस दृष्टिकोण के लाभों का पता लगाने और नैदानिक अभ्यास में इसे अपनाने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।

हिस्टिडाइन-टैग किए गए टाक डीएनए पोलीमरेज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि
टाक डीएनए पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति और शुद्धि44 के स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर, एन-टर्मिनल हिस्टिडाइन-टैग टाक डीएनए पोलीमरेज़ प्लास्मिड का निर्माण एक कोल्ड-शॉक प्रमोटर के नियंत्रण में किया गया था ताकि इसकी अभिव्यक्ति और शुद्धि प्रक्रिया को कम किया जा सके जैसा कि ऊपर बताया गया है (आंकड़े 1 ए और चित्रा 2ए)। इस प्रकार, केवल आईपीटीजी एकाग्रता और तापमान को बदलकर, इस उपन्यास निर्माण की अभिव्यक्ति के स्तर को आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है। 1 एमएम आईपीटीजी के साथ 16 डिग्री सेल्सियस पर टाक डीएनए पोलीमरेज़ प्लास्मिड युक्त कोशिकाओं की इनक्यूबेशन ने हिज-टाक डीएनए पोलीमरेज़ की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाई। इसके अलावा, पहले स्थापित प्रोटोकॉल44 समय लेने वाली पॉलीथीनइमाइन (पीईआई) वर्षा चरणों, जो अंतिम उत्पाद शुद्धता अप्रभावित था और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टाक पोलीमरेज(चित्रा 2बी)के बराबर था के रूप में यहां इस्तेमाल किया निर्माण के साथ छोड़ दिया जा सकता है.शुद्ध Taq पोलीमरेज़ एन-टर्मिनस पर एंजाइम और हिस्टिडाइन टैग के बीच लिंकर पेप्टाइड्स की उपस्थिति के कारण वाणिज्यिक की तुलना में धीमी गति से माइग्रेट हुआ। टाक डीएनए पोलीमरेज़ का उत्पादन शुद्ध प्रोटीन के 0.98 मिलीग्राम /

डबल हिज- और स्ट्रेप-टैग किए गए एमएमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण
बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग एमएमएलवी-आरटी को सी-टर्मिनल डबल हिज और स्ट्रेप-टैग के साथ कीट कोशिकाओं (एसएफ 9) में व्यक्त करने के लिए किया गया था जैसा कि चित्रा 2 ए में वर्णित है। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि सी-टर्मिनल टैग एमएमएलवी-आरटी उच्च गतिविधि को प्रदर्शित करता है जहां एन-टर्मिनली टैग प्रोटीन और सी-टर्मिनली टैग प्रोटीन दोनों को रेशमकीट-बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम (रेशमकीट-बीईवीएस)41का उपयोग करके रेशम के कीड़ों में संश्लेषित किया गया था। एक सजातीय एमएमएलवी-आरटी प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, उपर्युक्त अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में एक ही रणनीतियों और प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। नतीजतन, बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और 95% से अधिक शुद्ध प्रोटीन को 7.5 मिलीग्राम/एल कीट सेल संस्कृति की उपज के साथ प्राप्त किया गया था जैसा कि एसडीएस-पेज जेल परिणाम (चित्रा 2सी)द्वारा दिखाया गया है।

मल्टीप्लेक्स क्यूआरटी-पीसीआर का अनुकूलन और मानकीकरण
एक अनुकूलित और विकसित इन-हाउस मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर परीक्षण को इकट्ठा किया गया था और एक साथ तीन अलग-अलग सामान्य श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए बफर और प्राइमर मिक्स ऑप्टिमाइज़ेशन के दौर के बाद सफलतापूर्वक उत्पादित किया गया था (चित्र 3)37। पहली किट को SARS-CoV-2 N जीन, इन्फ्लुएंजा A H1N1 और H3N2, और इन्फ्लुएंजा B जीन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था; और दूसरी किट SARS-CoV-2 N जीन, MERS ORF1a और upE जीन के लिए है। इस प्रकार, दोनों किट सफलतापूर्वक और एक साथ यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो (चित्रा 3) के रूप में सभी तीन लक्ष्यों का पता लगा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वायरस में से प्रत्येक के सिंथेटिक आरएनए नमूने आम श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए एक मल्टीप्लेक्स किट के रूप में इस तरह के उपयोग की संभावना का संकेत प्रवर्धित थे. इस नैदानिक परीक्षण की संवेदनशीलता रोगी के नमूनों में पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों के समान है। ऐसे मामलों में जहां रोगी इन्फ्लूएंजा जैसे लक्षण प्रदर्शित करते हैं, मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम आरटी-क्यूपीसीआर के उपयोग ने SARS-CoV-2, इन्फ्लूएंजा ए और इन्फ्लूएंजा बी मल्टीप्लेक्स परख45 के साथ तुलनीय परिणाम दिखाए हैं।

आम श्वसन वायरस के प्रति इन-हाउस मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर किट का पता लगाने की संवेदनशीलता और सीमा
इन-हाउस मल्टीप्लेक्स किट की प्रभावशीलता का मूल्यांकन प्राइमर मिक्स के दो सेट और प्रत्येक किट के लिए संबंधित सिंथेटिक आरएनए का उपयोग करके किया गया था जैसा कि मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर वर्कफ़्लो (चित्रा 3)में दिखाया गया है। एक टेम्पलेट के रूप में 10 से 105 प्रतियों / μL से लेकर प्रत्येक सिंथेटिक आरएनए मिश्रण के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ प्रत्येक प्राइमर मिश्रण का उपयोग करना, संवेदनशीलता, विशिष्टता, और दोनों विकसित मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर का पता लगाने की सीमा मानक वक्र विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। यह मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर किट की प्रभावकारिता और स्थिरता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक परीक्षण के तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों में किया जाता है। नतीजतन, यहां विकसित दो किट प्रवर्धन वक्र और पता लगाने की सीमा (एलओडी) (चित्रा 4 और चित्रा 5) द्वारा देखे गए 10 आरएनए प्रतियों / प्रतिक्रिया के साथ सभी तीन लक्ष्य जीनों को सफलतापूर्वक बढ़ा सकते हैं। प्रत्येक वक्र के ढलान और आर2 मूल्यों का उपयोग व्यक्तिगत परख(चित्रा 4 और चित्रा 5)की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। आर2 मूल्यों ने डेटा बिंदुओं के लिए रैखिक फिट की अच्छाई का अनुमान प्रदान किया। एक कुशल qPCR परख में, R2 0.90 के बहुत करीब या उससे अधिक होना चाहिए। इन्फ्लुएंजा ए, इन्फ्लुएंजा बी और SARS-CoV-2 या MERS-CoV और SARS-CoV-2 अनुमापन की प्रवर्धन क्षमता सभी प्राइमर सेट (चित्र 4 और चित्र 5) के लिए 99% से ऊपर थी। इसके अलावा, छोटी त्रुटि पट्टियाँ प्रत्येक मल्टीप्लेक्स RT-qPCR किट की प्रजनन क्षमता साबित करती हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दोनों मल्टीप्लेक्स किट ने कोई प्राइमर डिमर गठन नहीं दिखाया क्योंकि नकारात्मक नियंत्रण (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ कोई प्रवर्धन नहीं है। इस प्रकार, दोनों किटों के डिजाइन ने विश्वसनीयता, विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ सभी लक्ष्य जीनों को सफलतापूर्वक बढ़ाया।

Figure 1
चित्रा 1: मल्टीप्लेक्स एक-चरण आरटी-क्यूपीसीआर किट असेंबली का योजनाबद्ध अवलोकन। किट की असेंबली आवश्यक एंजाइमों की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के साथ शुरू होती है, टाक डीएनए पोलीमरेज़ और एमएमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेज। दोनों एंजाइमों को सचित्र के रूप में दो स्तंभों के माध्यम से पारित करने की आवश्यकता थी। दूसरा, शुद्धिकरण के बाद प्रतिक्रिया की स्थिति और थर्मल साइकलिंग कार्यक्रम का अनुकूलन था जिसके परिणामस्वरूप मल्टीप्लेक्स परीक्षण किट के लिए इष्टतम स्थितियां थीं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्लास्मिड निर्माण और हिस-टाक पोल और सी-हिस/स्ट्रेप एमएमएलवी-आरटी के शुद्धिकरण परिणाम। (ए) पुनः संयोजक हिस-टैक पोल और सी-हिस/स्ट्रेप एमएमएलवी-आरटी अभिव्यक्ति प्लास्मिड का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। संक्षिप्ताक्षर: सीएसपीए प्रमोटर - कोल्ड-शॉक प्रोटीन ए प्रमोटर; आरबीएस - राइबोसोम बाध्यकारी साइट; 6x उसका - छह हिस्टिडिन के साथ उसका टैग; टीईई - अनुवाद-बढ़ाने वाला तत्व; Taq ORF - Taq Pol ओपन रीडिंग फ्रेम; पोल्ह - पॉलीहेड्रिन प्रमोटर; MMLV-RT ORF - MMLV-RT ओपन रीडिंग फ्रेम; TEV - नक़्क़ाशी वायरस प्रोटीज़ लक्ष्यीकरण साइट; 8x उसका - आठ हिस्टिडिन के साथ उसका टैग; स्ट्रेप - स्ट्रेप-टैग; पॉलीए - SV40 लेट पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल। (बी) बीएल 21 (डीई 3) ई कोलाई कोशिकाओं और टाक पोलीमरेज़ में व्यक्त हिस-टाक पोल का एसडीएस-पेज विश्लेषण। (सी) एसएफ 9 कोशिकाओं में व्यक्त शुद्ध सी-हिस/स्ट्रेप एमएमएलवी-आरटी का एसडीएस-पेज विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिक्रिया घटकों के साथ दो अनुकूलित, मानकीकृत और विकसित मल्टीप्लेक्स एक-चरण आरटी-क्यूपीसीआर किट का योजनाबद्ध आरेख। प्रत्येक एकल मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया dNTPs, बफर मिश्रण, एंजाइम मिश्रण, मल्टीप्लेक्स प्राइमर मिश्रण, और सिंथेटिक आरएनए टेम्पलेट का परीक्षण किया जाना से बना है। (A) इन्फ्लुएंजा A/B, SARS-CoV-2 किट और (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: इन्फ्लुएंजा A/B और SARS-CoV2 मल्टीप्लेक्स वन-स्टेप RT-qPCR किट के लिए प्रवर्धन वक्र और पता लगाने की सीमा। मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के प्रवर्धन घटता सभी लक्ष्यों (A) इन्फ्लुएंजा A, (C) इन्फ्लुएंजा B और (E) SARS-CoV-2 के साथ 10-गुना सीरियल dilutions (10 से 105 प्रतियां/μL) के साथ सिंथेटिक RNA मिश्रण का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। प्रतिक्रियाओं को तीन प्रतियों में किया गया था, एक उदाहरण के रूप में एक प्रतिकृति दिखा रहा था। (बी) इन्फ्लुएंजा ए, (डी) इन्फ्लुएंजा बी और (एफ) SARS-CoV-2 के लिए पता लगाने की सीमा लॉग कॉपी नंबर के खिलाफ तीन प्रतिकृति सीटी मानों के माध्य की साजिश रचकर निर्धारित की गई थी। निर्धारण के गुणांक (आर2) और रैखिक प्रतिगमन वक्र के समीकरण की गणना की गई और प्रत्येक पैनल में दिखाया गया। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों के बीच मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रवर्धन वक्र और MERS ORF1a/upE और SARS-CoV2 मल्टीप्लेक्स वन-स्टेप RT-qPCR किट के लिए पता लगाने की सीमा। मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के प्रवर्धन घटता सभी लक्ष्यों (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE, और (E) SARS-Cov-2 के साथ 10-गुना सीरियल dilutions (10 से 105 प्रतियां/μL) के साथ सिंथेटिक RNA मिश्रण का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। प्रतिक्रियाओं को तीन प्रतियों में किया गया था, एक उदाहरण के रूप में एक प्रतिकृति दिखा रहा था। (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE, और (F) SARS-CoV-2 के लिए पता लगाने की सीमा लॉग कॉपी नंबर के खिलाफ तीन प्रतिकृतिCt मानों के माध्य की साजिश रचकर निर्धारित की गई थी। निर्धारण के गुणांक (आर2) और रैखिक प्रतिगमन वक्र के समीकरण की गणना की गई और प्रत्येक पैनल में दिखाया गया। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों के बीच मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: Taq पोलीमरेज़ lysis बफर के लिए घटकों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: Taq पोलीमरेज़ शुद्धि बफर। "टाक डीएनए पोलीमरेज़ के दो-स्तंभ शुद्धिकरण के लिए आवश्यक बफर घटकों की सूची"। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: Taq पोलीमरेज़ भंडारण बफर। शुद्धिकरण के बाद टाक डीएनए पोलीमरेज़ को डायलाइज करने के लिए आवश्यक बफर घटकों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: MMLV-RT lysis बफर के लिए घटकों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 5: एमएमएलवी-आरटी शुद्धिकरण बफर। एमएमएलवी-आरटी के दो-स्तंभ शुद्धिकरण के लिए आवश्यक बफर घटकों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 6: एमएमएलवी-आरटी भंडारण बफर। शुद्धिकरण के बाद MMLV-RT को डायलाइज़ करने के लिए आवश्यक बफर घटकों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 7: प्राइमरों और जांच की जानकारी। प्रत्येक मल्टीप्लेक्स प्राइमर मिश्रण के लिए आवश्यक प्राइमरों और जांच की अनुक्रम जानकारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B और MERS-CoV वेरिएंट 12,19,20 जैसे सामान्य श्वसन वायरस के प्रसार के कारण उच्च संक्रमण और मृत्यु दर के परिणामस्वरूप दुनिया भर में स्वास्थ्य सेवा प्रणाली पर भारी आर्थिक बोझ है। इस बोझ को कम करने की दिशा में जिम्मेदारी की भावना से प्रेरित होकर, हमें एक परीक्षण में इन सामान्य वायरस के बीच अंतर करने के लिए RT-qPCR जैसे त्वरित, सटीक और सुलभ नैदानिक परख की आवश्यकता का एहसास हुआ। qRT-PCR की मल्टीप्लेक्स प्रकृति के आधार पर, SARS-CoV-2 को इन्फ्लुएंजा A/B और MERS-CoV वायरस जैसे अन्य श्वसन वायरसों से निदान और अंतर करना संभव है। आखिरकार, रोगियों के बेहतर और अधिक सटीक उपचार वर्तमान मल्टीप्लेक्स परख46 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. संक्षेप में, यह अध्ययन एक इन-हाउस वन-स्टेप मल्टीप्लेक्स RT-qPCR परीक्षण की प्राप्ति का वर्णन करता है जो दो अलग-अलग संयोजनों को लक्षित कर सकता है। प्रत्येक संयोजन ऐसे संक्रामक वायरस के प्रसार को सीमित करने और स्वास्थ्य सेवा प्रणाली पर आर्थिक बोझ को कम करने के लिए तीन अलग-अलग श्वसन वायरस से बना है।

वर्तमान मल्टीप्लेक्स RT-qPCR किट सामान्य श्वसन वायरस (SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B) और (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a) के दो संयोजनों को लक्षित कर सकती है। वर्णित प्रोटोकॉल आसान, पालन करने के लिए सीधा है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक-चरणीय आरटी-क्यूपीसीआर किट की तुलना में बहुत सस्ता है। एक अन्य लाभ किट के मल्टीप्लेक्स गुण थे जो विभिन्न जांच और प्राइमर संयोजनों का उपयोग करके कई वायरल आनुवंशिक लक्ष्यों को लक्षित कर सकते हैं। इस प्रकार, किट की बहुमुखी प्रतिभा और सादगी संसाधन-सीमित सेटिंग्स में सीधे कार्यान्वयन को सक्षम करती है। इसके अलावा, किट व्यापक परीक्षण के लिए उपयुक्त है जिसके परिणामस्वरूप सटीक और सटीक निदान होता है जो कई श्वसन वायरस के प्रसार और सह-संक्रमण को सीमित करने में मदद कर सकता है।

प्रारंभिक परख यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया गया था कि सभी लक्ष्यों को सफलतापूर्वक और गैर-विशिष्ट उत्पादों के गठन को सीमित करने के लिए उच्च निष्ठा के साथ बढ़ाया गया था। सबसे पहले, हम बफर मिश्रण के घटकों और बफर मिश्रण में उनके संबंधित सांद्रता के लिए अनुकूलन के कई दौर के माध्यम से चला गया. दूसरा, हम प्राइमर मिश्रण और पीसीआर प्रतिक्रिया दोनों में प्राइमरों और उनके इसी सांद्रता अनुकूलित. तीसरा, हमने एंजाइम मिश्रण की संरचना को इसकी गतिविधि को अधिकतम करने और टाक पोलीमरेज़47 की गतिविधि पर एमएमएलवी-आरटी के निरोधात्मक प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित किया। चौथा, हमने दोनों एंजाइमों की थर्मल स्थिरता के लिए सीमाओं को ध्यान में रखते हुए थर्मल साइकलिंग स्थितियों को अनुकूलित किया। उपरोक्त सुधारों को शामिल करते हुए, यहां प्रस्तुत हमारे मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर किट का अनुकूलित संस्करण उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और प्रजनन क्षमता के साथ 10 आरएनए प्रतियों / प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में सक्षम था।

मल्टीप्लेक्स RT-qPCR परख की उच्च दक्षता और सफल कार्यान्वयन सुनिश्चित करने के लिए कुछ सावधानियों पर विचार किया जाना चाहिए, ताकि अवरोधकों को रोका जा सके और पाइपिंग त्रुटियों से बचा जा सके। चूंकि प्रत्येक सुविधा अपने सेटअप और इंस्ट्रूमेंटेशन में अद्वितीय है, यहां कुछ कदम दिए गए हैं जो इस तरह की किट का निर्माण करते समय मदद कर सकते हैं: सबसे पहले, किसी भी संदूषण और पीसीआर अवरोधक की उपस्थिति से बचने के लिए दस्ताने को हर समय पहनने की आवश्यकता होती है। दूसरा, एयरोसोल प्रतिरोधी फिल्टर सुझावों का उपयोग करें और एक कैलिब्रेटेड विंदुक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें. इसके अलावा, पीसीआर-ग्रेड पानी का उपयोग करना सुनिश्चित करें। नो-टेम्प्लेट नियंत्रण का उपयोग किसी भी संदूषण की उपस्थिति को सत्यापित करने में मदद करेगा। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मास्टर मिश्रण को संभावित संदूषण और पाइपिंग भिन्नता से बचने के लिए सभी प्रतिकृतियों के लिए तैयार करने की आवश्यकता है। जांच की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए अन्य समस्या निवारण युक्तियों पर विचार करने की आवश्यकता है जैसे कि स्टॉक को एलिकोट करना और इसे पतला करने के लिए पानी के उपयोग से बचना। उपयोग किए गए प्राइमर और जांच को संग्रहीत करने और पतला करने पर निर्माता की सिफारिशों का पालन करना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, ये सरल टिप्स मल्टीप्लेक्स RT-qPCR परख की सफलता को बनाए रखने और इसकी उच्च दक्षता सुनिश्चित करने में मदद करेंगे।

हालांकि इस शोध में विकसित मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर परखों ने सिंथेटिक वायरल आरएनए के साथ परीक्षण किए जाने पर अच्छे परिणाम दिखाए हैं, लेकिन वास्तविक नैदानिक सेटिंग में इसकी प्रभावशीलता का अभी भी मूल्यांकन और सत्यापन करने की आवश्यकता है। दुर्भाग्य से, नैदानिक नमूनों की कमी इस जांच में शामिल वायरस के लिए परख की विशिष्टताओं और संवेदनशीलता को निर्धारित करना मुश्किल बनाती है। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि एलओडी (पता लगाने की सीमा), जो 100% नमूनों में पाई जा सकने वाली प्रतियों की न्यूनतम संख्या को इंगित करता है, सांख्यिकीय रूप से सिद्ध रैखिक प्रतिगमन के माध्यम से स्थापित किया गया था। यह नैदानिक निदान के लिए क्षमता प्रदान करता है और अनुसंधान की एक महत्वपूर्ण खोज है।

एक इन-हाउस मल्टीप्लेक्स वन-स्टेप आरटी-क्यूपीसीआर परख जो जांच-आधारित है, इस अध्ययन में उच्च प्रभावकारिता के साथ सफलतापूर्वक विकसित और मान्य किया गया था। SARS-CoV-2 को आसानी से पता लगाया जा सकता है और अन्य सामान्य श्वसन वायरस से अलग किया जा सकता है जैसा कि ऊपर बताया गया है, केवल एक टेस्ट ट्यूब में उच्च दक्षता और विश्वसनीयता के साथ। इस प्रकार, इस मल्टीप्लेक्स सुविधा पर निर्भरता निदान के थ्रूपुट को बढ़ाने और अन्य परीक्षण दृष्टिकोणों और सिंगलप्लेक्स पीसीआर की तुलना में समय, लागत और नमूने को बचाने में मदद करेगी। कुल मिलाकर, श्वसन वायरस के एक साथ घूमने की संभावना अधिक है और यह मल्टीप्लेक्स वन-स्टेप RT-qPCR बहुत फायदेमंद होगा।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी द्वारा कोर फंडिंग और एसएमएच को नेशनल टर्म ग्रैंड चैलेंज (एनटीजीसी) के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

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