Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utveckling av multiplexa realtids-RT-qPCR-analyser för detektion av SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi presenterar två probbaserade enstegs RT-qPCR-kit för vanliga luftvägsvirus. Den första analysen är för SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 och H3N2) och influensa B. Den andra är för SARS-Cov-2 (N) och MERS (UpE och ORF1a). Dessa analyser kan framgångsrikt implementeras i alla specialiserade laboratorier.

Abstract

Det svåra akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som orsakar Coronavirus disease 2019 (COVID-19) är ett allvarligt hot mot allmänhetens hälsa. Under influensasäsonger kan spridningen av SARS-CoV-2 och andra luftvägsvirus orsaka en befolkningsomfattande börda av luftvägssjukdomar som är svår att hantera. För det kommer luftvägsvirusen SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) att behöva övervakas noggrant under de kommande höst- och vintersäsongerna, särskilt när det gäller SARS-CoV-2, influensa A och influensa B, som delar liknande epidemiologiska faktorer som mottagliga populationer, överföringssätt och kliniska syndrom. Utan målspecifika analyser kan det vara svårt att skilja mellan fall av dessa virus på grund av deras likheter. Följaktligen kommer en känslig och riktad multiplexanalys som enkelt kan skilja mellan dessa virala mål att vara användbar för vårdpersonal. I denna studie utvecklade vi en realtidsanalys av omvänt transkriptas-PCR med hjälp av ett egenutvecklat R3T enstegs RT-qPCR-kit för samtidig detektion av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopior av deras syntetiska RNA kan vi framgångsrikt identifiera SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och MERS-CoV-mål samtidigt med 100 % specificitet. Denna analys visar sig vara korrekt, pålitlig, enkel, känslig och specifik. Den utvecklade metoden kan användas som en optimerad SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analys på sjukhus, medicinska centra och diagnostiska laboratorier samt för forskningsändamål.

Introduction

Pandemin av den pågående coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) orsakas av det nya coronaviruset som kallas severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund av SAR-CoV-2:s starka smittsamhet och förmåga till snabb överföring uppstod covid-19-pandemin i staden Wuhan i Kina och spred sig snabbt över hela världen. Detta ledde så småningom till att man började få tecken på andnöd och till och med dödsfall 2,3,4. Covid-19 har förklarats vara en pandemi i mer än 213 länder, vilket tyder på en kraftig ökning av antalet bekräftade fall, vilket framgår av de artiklar som publicerats i olika forskningsstudier 3,5. COVID-19 överförs främst genom små luftvägsdroppar som infekterade individer släpper ut i miljön och sedan exponeras för sårbara individer genom inandning eller nära kontakt med kontaminerade ytor. När dessa droppar kommer i kontakt med slemhinnan i ögon, mun eller näsa kan en person bli infekterad6. Statistik från Världshälsoorganisationen (WHO) visar att det har funnits mer än 76 miljoner bekräftade fall av pandemin över hela världen, med häpnadsväckande 7 miljoner dödsfall7. Således klassificerade FN pandemin orsakad av COVID-19-sjukdomen som en katastrof på grund av dess direkta inverkan på livet för miljarder människor runt om i världen och hade långtgående ekonomiska, miljömässiga och sociala effekter.

Folkhälsoinitiativ som grundlig testning, tidig upptäckt, kontaktspårning och fallisolering har alla visat sig vara avgörande för att hålla denna pandemi under kontroll 8,9,10,11. Vintermånaderna kommer att öka cirkulationen av andra luftvägsvirus som influensa A och B med covid-19-liknande symtom som gör det svårt att identifiera, spåra och isolera covid-19-fall tidigt. Varje år börjar utbrott av influensa A och B i slutet av hösten eller början av januari med en förutsägbar säsongsvariation12. Många epidemiologiska egenskaper delas av SARS-CoV-2 och influensavirus. Dessutom delar likheter i de mottagliga populationerna som inkluderar barn, äldre, immunsupprimerade och individer med kroniska komorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, hjärt- och njursvikt eller diabetes12,13. Dessa virus delar inte bara sårbara populationer utan även smittvägar för kontakt och droppsmitta14. Det förväntas att patienter sannolikt kan drabbas av mer än ett av dessa luftvägsvirus när influensasäsongen närmar sig14. För det måste screening av SARS-CoV-2 och influensavirus göras på symtomatiska patienter innan de isoleras. Att köra separata tester för de tre virusen (SARS-CoV-2, influensa A och influensa B) är inte möjligt på grund av den globala bristen på resurser för nukleinsyraextraktion och diagnostik. För att screena dem alla i en reaktion behöver en metod eller ett test utvecklas.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV är en familjemedlem till humant coronavirus (CoV). De första isolaten av MERS-CoV-viruset kom från en patient som var inlagd på sjukhus i Saudiarabien och som hade avlidit i september 2012 på grund av akutaandningsproblem. Det finns bevis som tyder på att en framträdande reservoarvärd för MERS-CoV är dromedarer. Det har bevisats att virus från infekterade dromedarer är zoonotiska och därmed kan infektera människor16,17. Människor som är infekterade med detta virus kan sprida det till andra genom nära kontakt18. Fram till den 26 januari 2018 hade det förekommit 2143 laboratoriebekräftade fall av MERS-CoV-infektion inklusive 750 dödsfall globalt19. De mest typiska MERS-CoV-symtomen är hosta, feber och andnöd. MERS-CoV-infektioner har också rapporterats uppvisa symtom på lunginflammation, diarré och gastrointestinala sjukdomar20. För närvarande finns inget kommersiellt vaccin eller specifik behandling för MERS-CoV tillgängligt. Därför är snabb och exakt diagnos avgörande för att förhindra de utbredda MERS-CoV-utbrotten och skilja MERS-CoV från SARS-CoV-2-sjukdomen.

Hittills har många metoder föreslagits för att detektera dessa virus, t.ex. multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 och CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, pappersbaserade biomolekylära sensorer31, SHERLOCK-testning i en kruka 32, DNA-aptamer33, loopmedierad isoterm förstärkning (LAMPA)19,34, etc. Var och en av de ovan nämnda metoderna har unika fördelar och nackdelar när det gäller känslighet och specificitet. Bland dessa metoder är det nukleinsyraamplifieringsbaserade testet: multiplex qRT-PCR, det vanligaste och anses vara guldstandarden för diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och MERS-CoV.

I denna studie designade och utvärderade vi olika primerkombinationer och sonder för effektiv, exakt och samtidig detektion av SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV med hjälp av standard twist syntetiska virala RNA. De multiplexade analyserna som utvecklats för antingen MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener rekommenderas av Världshälsoorganisationen (WHO). Dessa gener kodar i allmänhet för proteiner och komplex som bidrar till bildandet av ett replikations-/transkriptionskomplex (RTC)35, såsom regionen inom den öppna läsramen 1a (ORF1a) som används för MERS-CoV-analys. Dessutom kodas strukturella proteiner av de gener som används i diagnostiska analyser, t.ex. uppströmsregionen av höljegenen (upE) och nukleokapsidgenen (N) som används för MERS-CoV- och SARS-Cov-2-analyser, respektive35,36. Vi använde vårt interna R3T-kit i ett steg RT-qPCR-kit för att etablera RT-qPCR för detektering av virus37. Virusdetektion, känslighet, specificitet och dynamiskt omfång för vårt R3T enstegs RT-qPCR-kit och primer-set testades och utvärderades med hjälp av 10-faldiga serieutspädningar av de syntetiska standard-RNA:erna. Den lägsta praktiska detektionsgränsen var cirka 10 transkriptkopior per reaktion. Som ett resultat kan det interna R3T-enstegs RT-qPCR-kitet och primer-/sonduppsättningarna framgångsrikt användas och implementeras för rutinmässig samtidig diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taq-polymerasuttryck och rening

  1. Konstruera en plasmid med en klyvbar hexa-histidintagg vid enzymets C-terminal.
  2. Transformera 50 ng av expressionsvektorn till E. coli BL21-(DE3) stam enligt standardprotokollet38.
  3. Inokulera de transformerade cellerna i fyra 6-literskolvar som var och en innehåller 2 liter 2 liter 2-litersbuljong vid 37 °C med skakning vid 170 varv per minut tills OD 600 på 0,8 eller cellnummer 6,4 x 108 uppnås.
  4. Inducera Taq-polymerasuttryck med 0,5 mM isopropyl-β-d-tiogalaktopyranosid (IPTG) och inkubera ytterligare vid 16 °C i 18 timmar med skakning.
  5. Skörda cellerna genom att snurra ner dem vid 4 °C vid 7808 x g i 10 min. Återsuspendera pelletsen i 200 ml iskall Taq-polymeraslyseringsbuffert (tabell 1) i 5 ml/g cellpellet.
  6. Inkubera cellerna med lysozym (2 mg/ml lyseringsbuffert) och proteashämmare i 45 minuter och låt sedan lysatet passera genom ett cellstörande ämne vid 30 kPsi och centrifugera vid 22 040 x g i 30 minuter vid 4 °C för att separera cellresterna.
  7. Värm supernatanten i 15 minuter vid 85 °C. Centrifugera vid 95 834 x g i 1 timme vid 4 °C. Samla upp supernatanten och filtrera den på is med 0,45 μm filter.
  8. Utför proteinrening med snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) genom att först passera sample genom en Ni-NTA HP 5 mL kolonn vid 4 mL / min flödeshastighet med Taq polymerasbuffert A (tabell 2; Figur 1A).
  9. Tvätta med 10 kolonnvolymer (CV) av Taq-polymerasbuffert A och 4 % av Taq-polymerasbuffert B (tabell 2). Eluera det bundna proteinet med en linjär gradient med hjälp av Taq-polymeras Buffer B över 20 CV i en 100 ml flaska.
  10. Låt elueringsmedlet i 100 ml flaskan passera genom en kolonn med katjonbyte 5 ml vid 4 ml/min med hjälp av Taq-polymerasbuffert C (tabell 2; Figur 1A).
  11. Tvätta med 20 CV 100 % Taq-polymerasbuffert C och 5 % Taq-polymerasbuffert D (tabell 2).
  12. Eluera med en linjär gradient med Taq-polymerasbuffert D (tabell 2) från 5 % till 100 %.
  13. Kontrollera de eluerade fraktionerna genom att utföra SDS-PAGE gelelektrofores 39 följt av gelfärgning 40 enligt tidigare beskrivning. Ta kort 10 μL av varje fraktion och tillsätt en lika stor volym 2x SDS-laddningsfärgämne. Denaturera provet vid 90°C i 10 min. Ladda proverna på 10 % SDS-PAGE gel och kör gelen i 25 minuter vid 200 V. Färga gelen med Coomassie Brilliant Blue och färga sedan av.
  14. Samla upp alla fraktioner som innehåller renat Taq-polymeras och dialysera mot lagringsbuffert för taq-polymeras (tabell 3) vid 4 °C. Förbered kortfattat 2 l av förvaringsbufferten och sänk ner dialyskassetten i bufferten i 2 minuter för att återfukta. Injicera de uppsamlade fraktionerna med hjälp av en nål i dialyskassetten och låt den stå över natten i dialysbufferten vid 200 rpm på omröraren.
  15. Efter dialys, mät proteinkoncentrationen med en spektrofotometer, gör 10 μL alikvoter och snapfrys i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
    OBS: Filtrera alla buffertar för rening med ett 0.45 μm filter innan du laddar dem i FPLC-systemet.

2. MMLV-RT-uttryck i insektscelluttryckssystem och rening

  1. Generering och isolering av Bacmid DNA
    1. Klona sekvensen av MMLV-RT med en C-terminus klyvbar TEV-8xHis-Strep-tagg som tidigare beskrivits41.
    2. Blanda 100 ng av expressionsvektorn i 50 μL DH10Bac-celler och blanda försiktigt genom att knacka på röret.
    3. Inkubera cellerna på is i 15 min. Värmechocka cellerna i 1 minut vid 42 °C.
    4. Överför omedelbart på is och tillsätt 400 μL S.O.C-medium. Inkubera vid 37 °C under omskakning i 4 timmar.
    5. Platta 10 μL och 15 μL av blandningen på LB-agarplattor som innehåller tre antibiotika. 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin och 7 μg/ml gentamicin tillsammans med 40 μg/ml IPTG och 100 μg/ml X-Gal för blåvitt urval.
    6. Inkubera plattorna vid 37 °C i 48 timmar. Välj flera vita kolonier och en blå koloni som kontroll, och stryk dem på nytt på färska LB-agarplattor som innehåller ovanstående antibiotika. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
    7. Efter att ha bekräftat den vita fenotypen, välj ett par kolonier och inokulera dem i 10 ml LB-media innehållande 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin och 7 μg/ml gentamicin i 50 ml rör.
    8. Inkubera kulturen vid 37 °C och skaka vid 170 varv per minut över natten. Pelletera ner cellerna genom att snurra ner dem med 22 040 x g i 10 minuter.
    9. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 μL resuspensionslösning från miniprep-kit (denna lösning måste hanteras i enlighet med tillverkarens instruktioner), överför sedan lösningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    10. Tillsätt 250 μl lyseringslösning, blanda försiktigt och inkubera i 3 minuter. Tillsätt 350 μl neutraliserande lösning, invertera 2x-3x och centrifugera vid 22,040 x g i 10 min.
    11. Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt en lika stor volym iskall isopropanol och inkubera i 30 minuter vid -20 °C.
    12. Pelletera ner det utfällda DNA:t genom att snurra med 22 040 x g i 10 minuter. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 700 μL 70% iskall etanol, 2x.
    13. Ta bort supernatanten med en pipett utan att röra pelleten. Låt pelleten lufttorka i huven med laminärt flöde i 5-10 min eller tills ingen vätska syns i röret. Lös upp pelleten i 100 μL EB-buffert.
  2. Bakterietransfektion och virusamplifiering
    1. Förberedelse av P1-virus
      1. I en 6-brunns vävnadsodlingsplatta, frö ~ 9 x 105 celler/brunn i 2 ml insektscellodlingsmedium.
      2. Inkubera plattan i ~30 minuter vid rumstemperatur så att cellerna kan fästa.
      3. Bered Bacmid/Fugene-blandningen på följande sätt: Blanda 1 μg Bacmid-DNA och 300 μL insektsceller i ett rör. Blanda 8 μL transfektionsreagens och 300 μL insektsceller i ett annat rör. Blanda båda blandningarna genom försiktig pipettering och låt stå i ~30 minuter i rumstemperatur för att bacmid/transfektionsreagenskomplexet ska bildas.
      4. Tillsätt bacmidkomplex (~210 μL) till varje brunn droppvis och försegla plattan med en genomskinlig film.
      5. Inkubera plattan vid 27 °C i 3-4 dagar.
      6. Ta mediet som innehåller viruset, tillsätt FBS (slutlig koncentration 2%), filtrera med 0,45 μm filter och förvara vid 4°C i mörker som P1-viruslager.
    2. Förberedelse av P2-virus
      1. Transfektera 50 ml insektsceller med 2 x 106 celler/ml med 3 ml P1-virus i en odlingskolv.
      2. Inkubera vid 27 °C med skakning vid 100 rpm i 4-6 dagar tills andelen döda celler når 25%-30%.
      3. Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter och samla upp supernatanten som innehåller viruset.
      4. Tillsätt FBS till en slutlig koncentration på 2 %, filtrera genom 0,45 μm filter och alikvot 1 ml vardera och förvara vid -80 °C som P2-virusstam.
    3. Förberedelse av P3-virus
      1. Transfektera 100 ml insektsceller vid 2 x 106 celler/ml med 2 ml P2-virus i en odlingskolv.
      2. Inkubera vid 27 °C med skakning vid 100 rpm i 3-4 dagar tills andelen döda celler når 15%-20%.
      3. Centrifugera cellerna med 300 x g i 10 minuter och samla upp supernatanten som innehåller viruset.
      4. Tillsätt FBS till en slutlig koncentration på 2 %. Filtrera genom ett 0,45 μm filter. Den kan förvaras mörkt vid 4 °C i 1 månad.
  3. Uttryck och rening av MMLV-RT i insektsceller
    1. Tillsätt 5 ml P3-virus till färska insektsceller med en densitet av 2 x 106 celler/ml (700 ml/2-literskolv) i totalt 6 kolvar.
    2. Skörda cellerna efter 55-60 timmars posttransfektion genom att centrifugera vid 7808 x g i 10 minuter.
    3. Återsuspendera cellpelletsen i 200 ml MMLV-RT-lysbuffert (tabell 4). Låt lysatet passera genom ett cellstörande ämne vid 15 kPsi och centrifugera vid 22 040 x g i 30 minuter vid 4 °C.
    4. Överför supernatanten till nya rör och centrifugera igen vid 95 834 x g vid 4 °C i 1 timme. Samla upp supernatanten och filtrera den på is med ett 0,45 μm filter.
    5. Starta proteinrening med FPLC genom att först föra provet genom Ni-NTA Excel 5 ml-kolonn (figur 1B) med en flödeshastighet på 4 ml/min med hjälp av MMLV-RT-buffert A (tabell 5).
    6. Tvätta kolonnen med 10 CV MMLV-RT-buffert A och 4 % MMLV-RT-buffert B (tabell 5) och eluera proteinet med den linjära gradienten av MMLV-RT-buffert B över 20 CV i en 100 ml flaska.
    7. Låt det eluerade provet passera genom Strep 5 ml-kolonnen (figur 1B) i jämvikt med MMLV-RT-buffert C (tabell 5).
    8. Tvätta kolonnen med 10 CV av 100 % MMLV-RT-buffert C och eluera proteinet med en linjär gradient med 20 CV av buffert D (tabell 5).
    9. Kontrollera de eluerade fraktionerna genom att utföra SDS-PAGE som gjort är steg 1.13.-1.14. och samla upp de fraktioner som innehåller renad MMLV-RT för dialysering mot MMLV-RT-lagringsbuffert (tabell 6) vid 4 °C.
    10. Mät proteinkoncentrationen med hjälp av Nanodrop, alikvot, snap freeze i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
      OBS: Filtrera alla buffertar för rening med ett 0.45 μm filter innan du laddar dem i FPLC-systemet.

3. Förberedelse av interna multiplex R3T enstegs RT-qPCR-kitkomponenter

  1. Beredning av buffertblandning
    1. Bered 2x-bufferten för RT-qPCR-reaktionen som innehåller de reagenser som tidigare visats i37. Bered alla reagenser i DNase/RNase-fritt vatten och buffertblandningen som förvaras i en frys vid -20 °C.
  2. Primer- och sondsatser och primers blandningsberedning
    OBS: Sonderna och primers som används är listade i tabell 7. Influensa- och SARS-CoV-2-multiplexeringssatsen innehåller 3 sonder och 4 framåt- och bakåtsatser. Sonderna är märkta i 5′-ändarna med hjälp av reporters 6-karboxyfluorescein (FAM) för InfA, Texas Red-XN för SARS-CoV-2 (N-genen) och Yakima Yellow för InfB. MERS-CoV och SARS-CoV-2 multiplexed-satsen innehåller 3 sonder och 3 framåt- och bakåtprimersatser. Sonderna är också märkta i 5′-ändarna med hjälp av reportrar Texas Red-XN för MERS-CoV (ORF1a-genen), VIC för MERS-CoV (UpE-genen) och 6-karboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (N-genen).
    1. Bered en primerblandning som innehåller alla primers och sonder som anges i tabell 7 med en slutlig koncentration på 6.7 μM för varje framåt- och bakåtprimer och 1.25 μM för varje sond i ett 1.5 ml rör. Förvara primerblandningen i frysen -20 °C. Använd elueringsbuffert för att fylla på den volym som krävs.
  3. Beredning av enzymblandning
    1. Bered enzymblandningen Taq-polymeras (30 E/μL) och MMLV-RT (60 ng/μL) i lagringsbufferten för Taq-polymeras enligt tabell 3 för att fylla den erforderliga volymen. Utför detta steg på is och förvara enzymblandningen vid -20 °C.
  4. RNA-mall
    1. Återsuspendera syntetiska RNA av SARS-CoV-2, influensa A H1N1, influensa A H3N2, influensa B och MERS-CoV separat i 100 μl 1x Tris-EDTA-buffert (10 mM Tri-Cl och 1 mM EDTA (pH 8,0) för att göra ett lager av 1 x 106 RNA-kopior/μL.
    2. Blanda syntetiska RNA för RT-qPCR i följande konfigurationer: 1) SARS-CoV-2, influensa A och influensa B genom att tillsätta 5 μL av varje virusstam till 50 μL volym för att göra 1 x 105 RNA-kopior/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV genom att tillsätta 5 μL av varje virusstam till 50 μL volym för att göra 1 x 105 RNA-kopior/μL. Gör 10-faldiga serieutspädningar av varje syntetisk RNA-blandning från 1 x 105 RNA-kopior/μL till 10 RNA-kopior/μL.
      OBS: Se till att använda iskallt DNase/RNase-fritt vatten för att förbereda den seriella utspädningen av mallarna.

4. Internt multiplexat SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV enstegs RT-qPCR-test

OBS: Desinficera arbetsstationens ytor och använd en mall med 96 brunnar för att planera PCR-plattans layout.

  1. Beredning av 96-hålsplatta
    1. Tina 2x buffert och primerblandning. Förvara enzymblandningen på is.
    2. Tillsätt 10 μl 2x buffertblandning till varje brunn, 1,5 μl primerblandning, 1 μl enzymblandning, 6,5 μl DNas/RNasfritt vatten och 1 μl motsvarande RNA-blandning som behöver testas. Den slutliga volymen i varje brunn är 20 μL. Se den förberedda layouten för hjälp med det här steget.
      OBS: Det rekommenderas att göra en masterblandning baserat på antalet reaktioner som innehåller alla reagenser utom RNA-provet för att undvika pipetteringsbias. Utför dessutom reaktionerna i dubbletter eller tre exemplar för att undvika tekniska fel.
    3. Försegla plattan med en självhäftande PCR-platttätning och centrifugera kort i 1 minut för att samla upp all vätska i botten av plattan. Se till att varje brunn har samma volym vätska och är fri från bubblor innan du överför samples till qPCR-maskinen.
      OBS: Alla PCR-reaktioner måste ställas in på is.
  2. PCR-program
    1. Öppna realtidsprogrammet qPCR och välj följande experimentella egenskaper:
      Blocktyp: Snabb 96-brunnar (0,1 ml)
      Uppställning av experiment: Standardkurva
      Reagenser: TaqMan-reagenser
      Egenskaper för körning: Standard.
    2. Definiera alla genmål och deras rapportfärgämne enligt tabell 7. Definiera dessutom provnamn för varje reaktion som ska testas för enklare analys av förstärkningskurvorna.
    3. Tilldela mål och samplingar till programmets plattlayout baserat på 96-brunnarsplattan.
    4. Ställ in följande cykelprogram i PCR-instrumentet enligt följande:
      55 °C i 10 min
      40 cykler: 94 °C i 1 min
      94 °C i 10 s
      68 °C i 10 s
      68 °C i 20 s; här får fluorescens.
    5. Överför plattan till realtids qPCR-maskinen och placera den i hållaren för att säkerställa rätt orientering av plattan och starta körningen.
    6. Välj filplats för att spara experimentella data.
  3. Analys av data
    1. Det är viktigt att först undersöka de amplifieringsdiagram som produceras av qPCR-programmet. Analysera detektionsgränsen för att bedöma den minsta RNA-koncentration som kan detekteras.
    2. Plotta logaritmningen av RNA-kopieantalet på x-axeln och motsvarande medelvärde för Ct på y-axeln för att bedöma analysens känslighet. Lutningen och R2 indikerar reaktionens tillförlitlighet och effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under de senaste åren har det skett betydande framsteg i den diagnostiska metoden för att upptäcka vanliga luftvägsvirus med hjälp av PCR-metoder 21,22,23,24,25. Men trots dessa framsteg har den multiplexade metoden, som gör det möjligt att upptäcka flera virus i ett enda test, inte implementerats i någon större utsträckning, särskilt inte i RT-qPCR-plattformen. Denna metod har framgångsrikt implementerats med hjälp av syntetiska RNA-virus och intern optimering av reaktionskomponenter37. Specificiteten, sensitiviteten och tillförlitligheten hos den diagnostiska analysen bedömdes vara hög genom användning av en detektionsgränsanalys. Det presenterade tillvägagångssättet kan avsevärt förbättra effektiviteten och noggrannheten i diagnosen av luftvägsvirus, minska behovet av flera tester och minimera risken för feldiagnos som i43. Ytterligare forskning behövs för att utforska fördelarna med detta tillvägagångssätt med hjälp av patientprover och uppmuntra dess antagande i klinisk praxis.

Uttryck och rening av histidintaggat Taq DNA-polymeras
Baserat på det etablerade protokollet för Taq DNA-polymerasuttryck och rening44, konstruerades N-terminal histidin-märkt Taq DNA-polymerasplasmid under kontroll av en köldchockpromotor för att underlätta dess uttryck och reningsprocess som förklarats ovan (figur 1A och figur 2A). Således, genom att bara ändra IPTG-koncentration och temperatur, kan uttrycksnivån för denna nya konstruktion enkelt kontrolleras. Inkubation av celler innehållande Taq DNA-polymerasplasmiden vid 16°C med 1 mM IPTG visade ökat uttryck av His-Taq DNA-polymeras. Dessutom krävde det tidigare etablerade protokollet44 tidskrävande utfällningssteg av polyetylenimin (PEI), vilket kan hoppas över med den konstruktion som används här eftersom slutproduktens renhet var opåverkad och jämförbar med kommersiellt tillgängligt Taq-polymeras (figur 2B). Det renade Taq-polymeraset migrerade långsammare än det kommersiella på grund av närvaron av länkpeptiderna mellan enzymet och histidintaggen vid N-terminalen. Taq DNA-polymeras framställdes framgångsrikt med 0,98 mg/L E. coli-odling av rent protein.

Uttryck och rening av dubbelt hans- och streptokocktaggat MMLV omvänt transkriptas
Baculovirusexpressionssystemet användes för att uttrycka MMLV-RT med en C-terminal dubbel His och Strep-tag i insektsceller (Sf9) som beskrivs i figur 2A. En tidigare studie visade att det C-terminalt märkta MMLV-RT uppvisar högre aktivitet där både det N-terminalt märkta proteinet och det C-terminalt märkta proteinet syntetiserades i silkesmaskar med hjälp av silkesmask-baculovirus-expressionsvektorsystemet (silkworm-BEVS)41. För att producera ett homogent MMLV-RT-protein användes samma strategier och protokoll som presenterades i den ovan nämnda studien. Som ett resultat uppnåddes förbättrat uttryck och mer än 95 % rent protein med ett utbyte på 7,5 mg/L insektscellkultur, vilket visas av SDS-PAGE-gelresultatet (Figur 2C).

Optimering och standardisering av multiplexad qRT-PCR
Ett optimerat och utvecklat internt multiplexat RT-qPCR-test sammanställdes och producerades framgångsrikt efter omgångar av optimering av buffert- och primerblandning för att detektera tre olika vanliga luftvägsvirus samtidigt (figur 3)37. Det första kitet var utformat för att rikta in sig på SARS-CoV-2 N-genen, influensa A H1N1 och H3N2 och influensa B-genen; och det andra kitet är för SARS-CoV-2 N-genen, MERS ORF1a och upE-generna. På så sätt kan båda satserna framgångsrikt och samtidigt identifiera alla tre målen som arbetsflödet som presenteras här (figur 3). Syntetiska RNA-prover av vart och ett av de virus som användes i detta protokoll förstärktes, vilket indikerar möjligheten att använda såsom ett multiplexat kit för detektion av vanliga luftvägsvirus. Sensitiviteten hos detta diagnostiska test liknar tidigare rapporterade resultat i patientprover. I de fall där patienter uppvisar influensaliknande symtom har användningen av en multiplexerad realtids-RT-qPCR visat jämförbara resultat med SARS-CoV-2, influensa A och influensa B multiplexed assay45.

Känslighet och detektionsgräns för internt multiplexerat RT-qPCR-kit mot vanliga luftvägsvirus
Effektiviteten hos det interna multiplexade kitet bedömdes med hjälp av två uppsättningar primermix och motsvarande syntetiskt RNA för varje kit, vilket illustreras i det multiplexerade RT-qPCR-arbetsflödet (figur 3). Genom att använda varje primerblandning med 10-faldig seriell utspädning av varje syntetisk RNA-blandning från 10 till 105 kopior/μL som mall, kan känsligheten, specificiteten och detektionsgränsen för båda utvecklade multiplexerade RT-qPCR bestämmas med hjälp av standardkurvanalys. Detta görs i tre oberoende replikat av varje test, för att bekräfta effektiviteten och konsistensen hos det multiplexerade RT-qPCR-kitet. Som ett resultat av detta kan de två kiten som utvecklats här framgångsrikt amplifiera alla tre målgenerna samtidigt med så lite som 10 RNA-kopior/reaktion, sett till amplifieringskurvan och detektionsgränsen (LoD) (figur 4 och figur 5). Lutningen och R2-värdena för varje kurva användes för att utvärdera effektiviteten hos enskilda analyser (figur 4 och figur 5). R2-värdena gav en uppskattning av hur bra den linjära anpassningen till datapunkterna var. I en effektiv qPCR-analys börR2 vara mycket nära eller större än 0,90. Amplifieringseffektiviteten för influensa A, influensa B och SARS-CoV-2 eller MERS-CoV och SARS-CoV-2-titreringar var över 99 % för alla primeruppsättningar (figur 4 och figur 5). Dessutom bevisar de små felstaplarna reproducerbarheten för varje multiplexerat RT-qPCR-kit. Det är viktigt att notera att båda multiplexade satserna inte visade någon primerdimerbildning eftersom det inte finns någon förstärkning med den negativa kontrollen (data visas inte). Således har utformningen av båda kiten framgångsrikt förstärkt alla målgener med tillförlitlighet, specificitet och känslighet.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över den multiplexerade enstegs RT-qPCR-satsen. Monteringen av kitet börjar med uttryck och rening av de enzymer som behövs, Taq DNA-polymeras och MMLV omvänt transkriptas. Båda enzymerna behövde passera genom två kolonner som illustreras. För det andra, efter reningen var optimeringen av reaktionsförhållandena och det termiska cykelprogrammet vilket resulterade i optimala förhållanden för det multiplexerade testkitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Plasmidkonstruktionerna och reningsresultaten för His-Taq Pol och C-His/Strep MMLV-RT. (A) Schematisk representation av de rekombinanta plasmiderna His-Taq Pol och C-His/Strep MMLV-RT. Förkortningar: CSPA-promotor - köldchockprotein A-promotor; RBS - ribosombindningsställe; 6x Hans - His-tag med sex histidiner; TEE - translationellt förbättrande element; Taq ORF - Taq Pol öppen läsram; Polh - polyedrinpromotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT öppen läsram; TEV - målsökande plats för etsvirusproteas; 8x Hans - His-tag med åtta histidiner; Streptokocker - Strep-tagg; polyA - SV40 sen polyadenyleringssignal. (B) SDS-PAGE-analys av His-Taq Pol uttryckt i BL21(DE3) E. coli-celler och Taq-polymeras. (C) SDS-PAGE-analys av renad C-His/Strep MMLV-RT uttryckt i Sf9-cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Schematisk bild av de två optimerade, standardiserade och utvecklade multiplexerade RT-qPCR-satserna i ett steg tillsammans med reaktionskomponenterna. Varje enskild multiplexerad reaktion består av dNTP, buffertblandning, enzymblandning, multiplexerad primerblandning och den syntetiska RNA-mallen som ska testas. (A) Influensa A/B, SARS-CoV-2-kit och (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Förstärkningskurvorna och detektionsgränsen för influensa A/B och SARS-CoV2 multiplex enstegs RT-qPCR-kit. Amplifieringskurvorna för den multiplexerade RT-qPCR utfördes med hjälp av syntetisk RNA-blandning med 10-faldiga serieutspädningar (10 till 105 kopior/μL) med alla mål (A) influensa A, (C) influensa B och (E) SARS-CoV-2. Reaktionerna utfördes i tre exemplar och visade en replikat som exempel. Detektionsgränsen för (B) influensa A, (D) influensa B och (F) SARS-CoV-2 bestämdes genom att medelvärdet av tre replikeradeCt-värden plottades mot antalet loggkopior. Bestämningskoefficienten (R2) och ekvationen för den linjära regressionskurvan beräknades och visades i varje panel. Felstaplarna representerar standardavvikelsen mellan tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Förstärkningskurvorna och detektionsgränsen för MERS ORF1a/upE och SARS-CoV2 multiplex enstegs RT-qPCR-kit. Amplifieringskurvorna för den multiplexerade RT-qPCR utfördes med hjälp av en syntetisk RNA-blandning med 10-faldiga serieutspädningar (10 till 105 kopior/μL) med alla mål (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE och (E) SARS-Cov-2. Reaktionerna utfördes i tre exemplar och visade en replikat som exempel. Detektionsgränsen för (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE och (F) SARS-CoV-2 bestämdes genom att plotta medelvärdet av tre replikeradeC-t-värden mot loggkopienumret. Bestämningskoefficienten (R2) och ekvationen för den linjära regressionskurvan beräknades och visades i varje panel. Felstaplarna representerar standardavvikelsen mellan tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Listan över komponenterna för Taq-polymeraslysbuffert. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Buffertar för rening av Taq-polymeraser. En förteckning över de buffertkomponenter som behövs för tvåkolonnrening av Taq-DNA-polymeras. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Lagringsbuffert för Taq-polymeras. En förteckning över de buffertkomponenter som krävs för att dialysera Taq DNA-polymeras efter rening. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Listan över komponenter för MMLV-RT-lysbuffert. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: MMLV-RT-reningsbuffertar. En förteckning över de buffertkomponenter som behövs för tvåkolonnrening av MMLV-RT. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: MMLV-RT-lagringsbuffert. Listan över de buffertkomponenter som behövs för att dialysera MMLV-RT efter rening. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 7: Information om primers och sonder. Sekvensinformation för de primers och prober som behövs för varje multiplexerad primerblandning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hälso- och sjukvårdssystemet i hela världen har en tung ekonomisk börda till följd av de höga infektions- och dödstalen på grund av spridningen av vanliga luftvägsvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV-varianterna 12,19,20. Motiverade av ansvarskänslan för att lindra denna börda insåg vi behovet av en snabb, exakt och tillgänglig diagnostisk analys som RT-qPCR för att skilja mellan dessa vanliga virus i ett test. På grund av qRT-PCR:s multiplexa karaktär är det möjligt att diagnostisera och särskilja SARS-CoV-2 från andra luftvägsvirus, såsom influensa A/B- och MERS-CoV-virus. Så småningom kan bättre och mer exakt behandling av patienter uppnås med hjälp av den nuvarande multiplexade analysen46. För att rekapitulera beskriver denna studie realiseringen av ett internt enstegs multiplex RT-qPCR-test som kan rikta in sig på två olika kombinationer. Varje kombination består av tre olika luftvägsvirus för att begränsa spridningen av sådana smittsamma virus och minska den ekonomiska belastningen på sjukvården.

Det nuvarande multiplexade RT-qPCR-kitet kan rikta in sig på två kombinationer av vanliga luftvägsvirus (SARS-CoV-2, influensa A/B) och (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a). Det beskrivna protokollet är enkelt, okomplicerat att följa och mycket billigare än de kommersiellt tillgängliga RT-qPCR-kiten i ett steg. En annan fördel var de multiplexerade egenskaperna hos satsen som kan rikta in sig på flera virala genetiska mål genom att använda olika sond- och primerkombinationer. Således möjliggör kitets mångsidighet och enkelhet enkel implementering i resursbegränsade miljöer. Satsen är också lämplig för omfattande tester som resulterar i korrekt och exakt diagnos som kan hjälpa till att begränsa spridning och samtidig infektion av flera luftvägsvirus.

Preliminära analyser utfördes för att säkerställa att alla mål amplifierades framgångsrikt och med hög noggrannhet för att begränsa bildandet av icke-specifika produkter. Först gick vi igenom flera optimeringsomgångar för komponenterna i buffertmixen och deras respektive koncentrationer i buffertmixen. För det andra optimerade vi primers och deras motsvarande koncentrationer i både primerblandningen och PCR-reaktionen. För det tredje optimerade vi sammansättningen av enzymblandningen för att maximera dess aktivitet och minimera den hämmande effekten av MMLV-RT på aktiviteten av Taq-polymeras47. För det fjärde optimerade vi de termiska cykelförhållandena med hänsyn till begränsningarna för den termiska stabiliteten hos båda enzymerna. Genom att införliva de ovan nämnda förbättringarna kunde den optimerade versionen av vårt multiplexerade RT-qPCR-kit som presenteras här detektera ner till 10 RNA-kopior/reaktioner med hög specificitet, känslighet och reproducerbarhet.

Vissa försiktighetsåtgärder måste övervägas för att säkerställa hög effektivitet och framgångsrik implementering av multiplex RT-qPCR-analysen, för att förhindra inhibitorer och undvika pipetteringsfel. Eftersom varje anläggning är unik i sin installation och instrumentering, här är några steg som kan hjälpa till när du bygger ett sådant kit: För det första måste handskar alltid bäras för att undvika förekomst av kontaminering och PCR-hämmare. För det andra, se till att använda aerosolresistenta filterspetsar och använd en kalibrerad pipett. Se dessutom till att använda vatten av PCR-kvalitet. Användningen av kontroll utan mall hjälper till att verifiera förekomsten av eventuell kontaminering. Det är viktigt att notera att masterblandningen måste beredas för alla replikat för att undvika eventuell kontaminering och pipettering. Andra felsökningstips måste övervägas för att bibehålla sondkvaliteten, t.ex. alikvotering av stammen och undvikande av användning av vatten för att späda ut den. Det är viktigt att följa tillverkarens rekommendationer om förvaring och spädning av den primer och sond som används. Således kommer dessa enkla tips att hjälpa till att upprätthålla framgången för multiplex RT-qPCR-analysen och säkerställa dess höga effektivitet.

Även om de multiplexerade RT-qPCR-analyserna som utvecklats i denna forskning har visat goda resultat när de testats med de syntetiska virala RNA:erna, måste dess effektivitet i en verklig klinisk miljö fortfarande utvärderas och valideras. Tyvärr gör bristen på kliniska prover det svårt att fastställa analysens specificitet och känslighet för de virus som ingår i denna undersökning. Det är dock värt att nämna att LOD (detection limit), som anger det minsta antalet kopior som kan detekteras i 100 % av proverna, fastställdes genom en statistiskt bevisad linjär regression. Detta ger möjlighet till klinisk diagnostik och är ett viktigt resultat av forskningen.

En intern multiplex enstegs RT-qPCR-analys som är probbaserad utvecklades och validerades framgångsrikt med hög effektivitet i denna studie. SARS-CoV-2 kan lätt detekteras och särskiljas från andra vanliga luftvägsvirus som förklarats ovan med hög effektivitet och tillförlitlighet i bara ett provrör. Således kommer beroendet av denna multiplexerade funktion att hjälpa till att öka genomströmningen av diagnosen och spara tid, kostnad och prov jämfört med andra testmetoder och singleplex PCR. Sammantaget är risken för att luftvägsvirus cirkulerar tillsammans hög och denna multiplexa enstegs RT-qPCR kommer att vara mycket fördelaktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av King Abdullah University of Science and Technology genom kärnfinansiering och National Term Grand Challenge (NTGC) till S.M.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

Denna månad i JoVE utgåva 201 Taq-polymeras MMLV-RT proteinuttryck COVID-19 SARS-CoV-2 influensa A/B MERS-CoV multiplex RT-qPCR
Utveckling av multiplexa realtids-RT-qPCR-analyser för detektion av SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter