Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Udvikling af multiplex realtids RT-qPCR-assays til påvisning af SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi præsenterer to sondebaserede interne et-trins RT-qPCR-sæt til almindelige luftvejsvira. Det første assay er for SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 og H3N2) og influenza B. Den anden er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analyser kan implementeres med succes i ethvert specialiseret laboratorium.

Abstract

Det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der forårsager Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mod offentlighedens sundhed. I influenzasæsoner kan spredningen af SARS-CoV-2 og andre luftvejsvira forårsage en byrde af luftvejssygdomme i hele befolkningen, der er vanskelig at håndtere. Til det skal respiratoriske vira SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåges nøje i de kommende efterårs- og vintersæsoner, især i tilfælde af SARS-CoV-2, influenza A og influenza B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som modtagelige populationer, transmissionsmåde og kliniske syndromer. Uden målspecifikke analyser kan det være udfordrende at skelne mellem tilfælde af disse vira på grund af deres ligheder. Derfor vil et følsomt og målrettet multiplexassay, der let kan skelne mellem disse virale mål, være nyttigt for sundhedspersonale. I denne undersøgelse udviklede vi et realtids revers transkriptase-PCR-baseret assay ved hjælp af et internt udviklet R3T et-trins RT-qPCR-kit til samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier af deres syntetiske RNA'er kan vi med succes identificere SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og MERS-CoV-mål samtidigt med 100% specificitet. Denne analyse viser sig at være nøjagtig, pålidelig, enkel, følsom og specifik. Den udviklede metode kan bruges som et optimeret SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk assay på hospitaler, medicinske centre og diagnostiske laboratorier samt til forskningsformål.

Introduction

Pandemien af den igangværende coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er forårsaget af den nye coronavirus kendt som det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund af SAR-CoV-2's stærke smitsomhed og kapacitet til hurtig transmission opstod COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte sig hurtigt over hele verden. Dette førte til sidst til starten af tegn på åndedrætsbesvær og endda død 2,3,4. COVID-19 er blevet erklæret en pandemi i mere end 213 lande og forventer en kraftig stigning i antallet af bekræftede tilfælde, som det fremgår af papirerne offentliggjort af forskellige forskningsundersøgelser 3,5. COVID-19 overføres primært af små åndedrætsdråber, som inficerede personer frigiver i miljøet og derefter udsættes for sårbare personer gennem indånding eller tæt kontakt med forurenede overflader. Når disse dråber kommer i kontakt med slimhinden i øjne, mund eller næse, kan en person blive smittet6. Statistikker frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) viser, at der har været mere end 76 millioner bekræftede tilfælde af pandemien på verdensplan med svimlende 7 millioner dødsfald7. FN klassificerede således pandemien forårsaget af COVID-19-sygdommen som en katastrofe på grund af dens direkte indvirkning på milliarder af menneskers liv over hele kloden og havde vidtrækkende økonomiske, miljømæssige og sociale virkninger.

Folkesundhedsinitiativer, herunder grundig testning, tidlig påvisning, kontaktsporing og isolering af tilfælde, har alle vist sig at være afgørende for at holde denne pandemi under kontrol 8,9,10,11. Vintermånederne vil øge cirkulationen af andre luftvejsvira som influenza A og B med COVID-19-lignende symptomer, hvilket gør det vanskeligt at identificere, spore og isolere COVID-19-tilfælde tidligt. Hvert år starter influenza A- og B-udbrud i det sene efterår eller begyndelsen af januar med en forudsigelig sæsonudsving12. Talrige epidemiologiske træk deles af SARS-CoV-2- og influenzavirus. Desuden deler ligheder i de modtagelige populationer, der inkluderer børn, ældre, immunkompromitterede og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, hjerte- og nyresvigt eller diabetes12,13. Disse vira deler ikke kun sårbare populationer, men også transmissionsveje for kontakt og åndedrætsdråber14. Det forventes, at patienter sandsynligvis kan indgå mere end en af disse respiratoriske vira, når influenzasæsonen nærmer sig14. Til det skal screeningen af SARS-CoV-2 og influenzavirus udføres på symptomatiske patienter, før de isoleres. Det er ikke muligt at køre separate tests for de tre vira (SARS-CoV-2, influenza A og influenza B) på grund af den globale mangel på ressourcer til nukleinsyreekstraktion og diagnostik. For at screene dem alle i en reaktion skal der udvikles en metode eller test.

Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS)-CoV er et familiemedlem til human coronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolater kom fra en indlagt patient i Saudi-Arabien, der var død i september 2012 på grund af akutte åndedrætsproblemer15. Der er beviser, der tyder på, at en fremtrædende reservoirvært for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist, at vira fra inficerede dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan inficere mennesker16,17. Mennesker inficeret med denne virus kan sprede den til andre gennem tæt kontakt18. Pr. 26. januar 2018 havde der været 2143 laboratoriebekræftede tilfælde af MERS-CoV-infektion, herunder 750 dødsfald globalt19. De mest typiske MERS-CoV symptomer er hoste, feber og åndenød. MERS-CoV-infektioner er også blevet rapporteret at udvise lungebetændelse, diarré og gastrointestinale sygdomssymptomer20. I øjeblikket er der ingen kommerciel vaccine eller specifik behandling for MERS-CoV tilgængelig. Derfor er hurtig og præcis diagnose afgørende for at forhindre de udbredte MERS-CoV-udbrud og differentiere MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sygdommen.

Til dato er der foreslået mange tilgange til at detektere disse vira, såsom multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserede biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-test i en gryde 32, DNA-aptamer33, loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP)19,34 osv. Hver af de ovennævnte metoder har unikke fordele og ulemper med hensyn til følsomhed og specificitet. Blandt disse metoder er den nukleinsyreamplifikationsbaserede test: multiplex qRT-PCR, den mest almindelige og anses for at være guldstandarden til diagnosticering af SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og MERS-CoV.

I denne undersøgelse designede og vurderede vi forskellige primerkombinationer og sonder til effektiv, nøjagtig og samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved hjælp af standard twist syntetiske virale RNA'er. De multipleksede assays udviklet til enten MERS-CoV eller SARS-CoV-2 målgener anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO). Disse gener koder generelt for proteiner og komplekser, der bidrager til dannelsen af et replikations-/transkriptionskompleks (RTC)35, såsom regionen inden for den åbne læseramme 1a (ORF1a), der anvendes til MERS-CoV-assay. Derudover kodes strukturelle proteiner af de gener, der anvendes i diagnostiske assays, såsom opstrømsregionen af kuvertgenet (upE) og nukleocapsidgenet (N), der anvendes til henholdsvis MERS-CoV- og SARS-Cov-2-assays, 35,36. Vi brugte internt R3T et-trins RT-qPCR-sæt til at etablere RT-qPCR til påvisning af vira37. Virusdetektion, følsomhed, specificitet og dynamisk område af vores R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primersæt blev testet og evalueret ved hjælp af 10 gange serielle fortyndinger af standard twist syntetiske RNA'er. Den laveste praktiske detektionsgrænse var ca. 10 udskriftskopier pr. Reaktion. Som et resultat kan det interne R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primer-/sondesæt med succes anvendes og implementeres til rutinemæssig samtidig diagnose af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taq polymeraseekspression og oprensning

  1. Konstruer et plasmid med et spaltbart hexa-histidinmærke ved enzymets C-terminal.
  2. 50 ng af ekspressionsvektoren omdannes til E. coli BL21-(DE3)-stamme efter standardprotokol38.
  3. De transformerede celler podes i fire 6 L-kolber, der hver indeholder 2 liter 2YT-mediebouillon ved 37 °C, omrystes ved 170 omdr./min., indtil OD 600 på 0,8 eller cellenummer 6,4 x 108 er nået.
  4. Taq-polymeraseekspression induceres med 0,5 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) og inkuberes yderligere ved 16 °C i 18 timer under omrystning.
  5. Høst cellerne ved at dreje dem ned ved 4 °C ved 7808 x g i 10 min. Pellets resuspenderes i 200 ml af en iskold Taq-polymeraselysebuffer (tabel 1) i 5 ml / g cellepellet.
  6. Cellerne inkuberes med lysozym (2 mg/ml lysisbuffer) og proteasehæmmere i 45 minutter, hvorefter lysatet ledes gennem en celleforstyrrende faktor ved 30 kPsi, og der centrifugeres ved 22.040 x g i 30 minutter ved 4 °C for at separere celleaffaldet.
  7. Supernatanten opvarmes i 15 minutter ved 85 °C. Spin ned ved 95.834 x g i 1 time ved 4 °C. Supernatanten opsamles og filtreres på is med et filter på 0,45 μm.
  8. Udfør proteinoprensning ved hjælp af Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) ved først at føre prøven gennem en Ni-NTA HP 5 ml søjle ved 4 ml/min flowhastighed ved hjælp af Taq polymerasebuffer A (tabel 2; Figur 1A).
  9. Der vaskes med 10 kolonnevolumener (CV) Taq-polymerasebuffer A og 4 % Taq-polymerasebuffer B (tabel 2). Eluer det bundne protein med en lineær gradient ved hjælp af Taq polymerasebuffer B over 20 CV i en 100 ml flaske.
  10. Elueringsmidlet ledes i 100 ml flasken gennem en kationbytter 5 ml kolonne ved 4 ml/min ved hjælp af Taq polymerasebuffer C (tabel 2; Figur 1A).
  11. Vask med 20 CV 100% Taq polymerasebuffer C og 5% Taq polymerasebuffer D (tabel 2).
  12. Eluer med en lineær gradient ved anvendelse af Taq-polymerasebuffer D (tabel 2), der starter fra 5% til 100%.
  13. Kontroller de eluerede fraktioner ved at udføre SDS-PAGE gelelektroforese 39 efterfulgt af gelfarvning 40 som tidligere beskrevet. Kort sagt, tag 10 μL af hver fraktion og tilsæt et lige volumen 2x SDS ilægningsfarvestof. Denaturer prøven ved 90oC i 10 min. Læg prøverne på 10% SDS-PAGE gel og kør gelen i 25 minutter ved 200 V. Plet gelen med Coomassie Brilliant Blue og pletter derefter.
  14. Alle fraktioner, der indeholder renset Taq-polymerase, opsamles, og dialyseres mod Taq-polymeraseopbevaringsbufferen (tabel 3) ved 4 °C. Forbered kort 2 L af opbevaringsbufferen og nedsænk dialysekassetten i bufferen i 2 minutter for at hydrere. Injicer de opsamlede fraktioner med en nål i dialysekassetten og lad den stå natten over i dialysebufferen ved 200 rpm på omrøreren.
  15. Efter dialyse måles proteinkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer, der laves 10 μL alikvoter, snapfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Filtrer alle buffere til rensning ved hjælp af et 0,45 μm filter, før du lægger dem i FPLC-systemet.

2. MMLV-RT-ekspression i insektcelleekspressionssystem og oprensning

  1. Bacmid DNA-generering og isolering
    1. Klon sekvensen af MMLV-RT med en C-terminus spaltbar TEV-8xHis-Strep tag som tidligere beskrevet41.
    2. Bland 100 ng af ekspressionsvektoren i 50 μL DH10Bac-celler og bland forsigtigt ved at banke på røret.
    3. Inkuber cellerne på is i 15 min. Varmechok cellerne i 1 min ved 42 °C.
    4. Overfør straks på is og tilsæt 400 μL SOC-medium. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning i 4 timer.
    5. Plade 10 μL og 15 μL af blandingen på LB Agar-plader indeholdende tre antibiotika; 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin og 7 μg/ml gentamicin sammen med 40 μg/ml IPTG og 100 μg/ml X-Gal til blåhvid selektion.
    6. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 48 timer. Vælg flere hvide kolonier og en blå koloni som kontrol, og stribe dem igen på friske LB-agarplader, der indeholder ovennævnte antibiotika. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
    7. Efter bekræftelse af den hvide fænotype skal du vælge et par kolonier og inokulere dem i 10 ml LB-medier indeholdende 50 μg / ml Kanamycin, 10 μg / ml tetracyclin og 7 μg / ml Gentamicin i 50 ml rør.
    8. Kulturen inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 170 o/min natten over. Pellet cellerne ned ved at dreje dem ned ved 22.040 x g i 10 min.
    9. Supernatanten deponeres, og pelletpen resuspenderes i 250 μL resuspensionsopløsning fra miniprep-sættet (denne opløsning skal håndteres i overensstemmelse med producentens anvisninger), og opløsningen overføres derefter til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
    10. Der tilsættes 250 μL lysisopløsning, blandes forsigtigt og inkuberes i 3 min. Der tilsættes 350 μL neutraliserende opløsning, inverteres 2x-3x og centrifugeres ved 22.040 x g i 10 minutter.
    11. Supernatanten overføres til et frisk glas, tilsættes en tilsvarende mængde iskold isopropanol og inkuberes i 30 minutter ved -20 °C.
    12. Pellet ned det udfældede DNA ved at spinde ved 22.040 x g i 10 min. Supernatanten kasseres, og pelletsen vaskes med 700 μL 70% iskold ethanol, 2x.
    13. Supernatanten fjernes med en pipette uden at røre pillen. Lad pillen lufttørre i laminar flow-emhætten i 5-10 min, eller indtil der ikke ses væske i røret. Pellet opløses i 100 μL EB-buffer.
  2. Bacmid transfektion og virusforstærkning
    1. P1 virus forberedelse
      1. I en 6-brønds vævskulturplade, frø ~ 9 x 105 celler / brønd i 2 ml insektcellekulturmedium.
      2. Inkuber pladen i ~30 minutter ved stuetemperatur for at lade cellerne sætte sig fast.
      3. Bacmid/Fugene blandes som følger: 1 μg Bacmid DNA og 300 μL insektcellemedier blandes i et rør. I et andet rør blandes 8 μL transfektionsreagens og 300 μL insektcellemedier. Begge blandinger blandes forsigtigt og henstår i ~30 minutter ved stuetemperatur, så bacmid/transfektionsreagenskomplekset dannes.
      4. Tilsæt bacmid kompleks blanding (~ 210 μL) til hver brønd dråbevis og forsegl pladen med en gennemsigtig film.
      5. Pladen inkuberes ved 27 °C i 3-4 dage.
      6. Tag det medium, der indeholder virussen, tilsæt FBS (slutkoncentration 2%), filtrer ved hjælp af 0,45 μm filter og opbevar ved 4 ° C i mørke som P1-viruslager.
    2. P2 virus forberedelse
      1. 50 ml insektceller transfekteres ved 2 x 106 celler/ml med 3 ml P1-virus i en dyrkningskolbe.
      2. Inkuberes ved 27 °C med omrystning ved 100 o / min i 4-6 dage, indtil procentdelen af døde celler når 25% -30%.
      3. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og den supernatant, der indeholder virussen, opsamles.
      4. Der tilsættes FBS til en slutkoncentration på 2 %, filtreres gennem 0,45 μm filter og alikvote 1 ml hver og opbevares ved -80 °C som P2-viruslager.
    3. P3 virus præparat
      1. 100 ml insektceller transfekteres ved 2 x 106 celler/ml med 2 ml P2-virus i en dyrkningskolbe.
      2. Der inkuberes ved 27 °C under omrystning ved 100 omdr./min. i 3-4 dage, indtil procentdelen af døde celler når 15-20%.
      3. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og den supernatant, der indeholder virussen, opsamles.
      4. Tilsæt FBS til en endelig koncentration på 2%. Filtrer gennem et 0,45 μm filter. Det kan opbevares mørkt ved 4 °C i 1 måned.
  3. Ekspression og oprensning af MMLV-RT i insektceller
    1. Der tilsættes 5 ml P3-virus til friske insektceller med en massefylde på 2 x 106 celler/ml (700 ml/2L kolbe) i alt 6 kolber.
    2. Høst cellerne efter 55-60 timers posttransfektion ved at dreje ved 7808 x g i 10 min.
    3. Resuspender cellepillerne i 200 ml MMLV-RT lysisbuffer (tabel 4). Lysatet ledes gennem en celleforstyrrende faktor ved 15 kPsi og centrifugeres ved 22.040 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Supernatanten overføres til nye glas og centrifugeres igen ved 95,834 x g ved 4 °C i 1 time. Supernatanten opsamles og filtreres på is med et 0,45 μm filter.
    5. Start proteinoprensning ved hjælp af FPLC ved først at føre prøven gennem Ni-NTA Excel 5 ml kolonne (figur 1B) ved 4 ml / min strømningshastighed ved hjælp af MMLV-RT buffer A (tabel 5).
    6. Kolonnen vaskes med 10 CV MMLV-RT-buffer A og 4 % MMLV-RT-buffer B (tabel 5), og proteinet elueres med den lineære gradient af MMLV-RT-buffer B over 20 CV i en 100 ml flaske.
    7. Den eluerede prøve ledes gennem Strep 5 ml kolonnen (figur 1B) ekvilibreret med MMLV-RT-buffer C (tabel 5).
    8. Kolonnen vaskes med 10 CV 100 % MMLV-RT-buffer C, og proteinet elueres med en lineær gradient med 20 CV buffer D (tabel 5).
    9. Kontroller de eluerede fraktioner ved at udføre SDS-PAGE som udført er trin 1.13.-1.14. og opsamle de fraktioner, der indeholder renset MMLV-RT, som skal dialyseres mod MMLV-RT-lagringsbuffer (tabel 6) ved 4 °C.
    10. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Nanodrop, aliquot, snap freeze i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C.
      BEMÆRK: Filtrer alle buffere til rensning ved hjælp af et 0,45 μm filter, før du lægger dem i FPLC-systemet.

3. Forberedelse af interne multiplex R3T et-trins RT-qPCR-kitkomponenter

  1. Forberedelse af bufferblanding
    1. Forbered 2x-bufferen til RT-qPCR-reaktionen, der indeholder de reagenser, der tidligere er vist i37. Alle reagenserne fremstilles i DNase/RNasefrit vand og bufferblandingen opbevares i en fryser til -20 °C.
  2. Primer og sonde Sæt og primere blanding forberedelse
    BEMÆRK: De anvendte sonder og primere er anført i tabel 7. Influenza- og SARS-CoV-2-multiplexsættet indeholder 3 sonder og 4 fremadgående og omvendte primersæt. Sonderne er mærket i 5′-enderne ved hjælp af reportere 6-carboxyfluorescein (FAM) for InfA, Texas Red-XN for SARS-CoV-2 (N-gen) og Yakima Yellow for InfB. MERS-CoV og SARS-CoV-2 multiplekset kit indeholder 3 sonder og 3 fremadgående og omvendte primersæt. Sonderne er også mærket i 5′-enderne ved hjælp af reportere Texas Red-XN for MERS-CoV (ORF1a-gen), VIC for MERS-CoV (UpE-gen) og 6-carboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (N-gen).
    1. Der fremstilles en primerblanding, der indeholder alle de primere og sonder, der er anført i tabel 7 , med en slutkoncentration på 6,7 μM for hver fremadgående og omvendt primer og 1,25 μM for hver sonde i et 1,5 ml rør. Opbevar grundblandingen i -20 °C fryseren. Brug elueringsbuffer til at udgøre det krævede volumen.
  3. Enzymblanding forberedelse
    1. Der fremstilles Taq-polymerase (30 E/μL) og MMLV-RT (60 ng/μL) enzymblanding i Taq-polymeraselagringsbufferen som vist i tabel 3 for at udgøre det krævede volumen. Dette trin udføres på is og enzymblandingen opbevares ved -20 °C.
  4. RNA skabelon
    1. Resuspender syntetiske RNA'er af SARS-CoV-2, influenza A H1N1, influenza A H3N2, influenza B og MERS-CoV separat i 100 μL 1x Tris-EDTA-buffer (10 mM Tri-Cl og 1 mM EDTA (pH 8,0) for at lave en bestand på 1 x 106 RNA-kopier/μL.
    2. Bland syntetiske RNA'er til RT-qPCR i følgende konfigurationer: 1) SARS-CoV-2, influenza A og influenza B ved at tilføje 5 μL af hver virusbestand til 50 μL volumen for at lave 1 x 105 RNA-kopier / μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV ved at tilføje 5 μL af hver virusbestand til 50 μL volumen for at lave 1 x 105 RNA-kopier / μL. Lav 10 gange serielle fortyndinger af hver syntetisk RNA-blanding fra 1 x 105 RNA-kopier / μL til 10 RNA-kopier / μL.
      BEMÆRK: Sørg for at bruge iskold DNase/RNase-frit vand til at forberede seriefortyndingen af skabelonerne.

4. Intern multiplekset SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV et-trins RT-qPCR-test

BEMÆRK: Desinficer arbejdsstationens overflader, og brug en 96-brønds pladeskabelon til at planlægge PCR-pladelayoutet.

  1. Forberedelse af 96-brønds plade
    1. Optø 2x buffer og primerblanding. Hold enzymblanding på is.
    2. Til hvert hul tilsættes 10 μL 2x bufferblanding, 1,5 μL af primerblandingen, 1 μL enzymblanding, 6,5 μL DNase/RNasefrit vand og 1 μL tilsvarende RNA-blanding, der skal testes. Det endelige volumen i hver brønd er 20 μL. Se det forberedte layout for at få hjælp til dette trin.
      BEMÆRK: Det anbefales at lave en masterblanding baseret på antallet af reaktioner, der indeholder alle reagenserne undtagen RNA-prøven for at undgå pipetteringsbias. Derudover skal du udføre reaktionerne i to eller tre eksemplarer for at undgå tekniske fejl.
    3. Pladen forsegles med en klæbende PCR-pladeforsegling og centrifugeres kortvarigt i 1 min for at opsamle al væske i bunden af pladen. Sørg for, at hver brønd har det samme volumen væske og er fri for bobler, før prøverne overføres til qPCR-maskinen.
      BEMÆRK: Alle PCR-reaktioner skal sættes op på is.
  2. PCR-program
    1. Åbn qPCR-maskinprogrammet i realtid, og vælg følgende eksperimentelle egenskaber:
      Bloktypen: Hurtig 96-brønd (0,1 ml)
      Opsætning af eksperiment: Standardkurve
      Reagenser: TaqMan-reagenser
      Kør egenskaber: Standard.
    2. Definer alle genmålene og deres reporterfarve som vist i tabel 7. Derudover skal du definere prøvenavne for hver reaktion, der skal testes, for lettere analyse af amplifikationskurverne.
    3. Tildel mål og prøver til programmets pladelayout baseret på 96-brøndpladen.
    4. Indstil følgende cyklusprogram i PCR-instrumentet som følger:
      55 °C i 10 min
      40 cyklusser: 94 °C i 1 min
      94 °C i 10 s
      68 °C i 10 s
      68 °C i 20 sek Her erhverver fluorescens.
    5. Overfør pladen til qPCR-maskinen i realtid, og placer den i holderen, så pladen vender korrekt og starter kørslen.
    6. Vælg filplaceringen for at gemme eksperimentelle data.
  3. Analyse af data
    1. Det er vigtigt først at undersøge forstærkningsplottene produceret af qPCR-programmet. Analyser detektionsgrænsen for at vurdere den mindste RNA-koncentration, der kan detekteres.
    2. Log over RNA-kopinummer på x-aksen og den tilsvarende gennemsnitlige Ct-værdi på y-aksen plottes for at vurdere analysens følsomhed. Hældningen ogR2 angiver reaktionens pålidelighed og effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de senere år har der været betydelige fremskridt i den diagnostiske tilgang til påvisning af almindelige respiratoriske vira ved hjælp af PCR-tilgange 21,22,23,24,25. På trods af disse fremskridt er den multipleksede tilgang, som gør det muligt at detektere flere vira i en enkelt test, imidlertid ikke blevet implementeret bredt, især i RT-qPCR-platformen. Denne metode er blevet implementeret med succes ved hjælp af syntetiske RNA-vira og intern optimering af reaktionskomponenter37. Specificiteten, følsomheden og pålideligheden af det diagnostiske assay blev vurderet til at være højt ved anvendelse af en detektionsgrænseanalyse. Den præsenterede tilgang kunne i høj grad forbedre effektiviteten og nøjagtigheden af respiratorisk virusdiagnose, reducere behovet for flere tests og minimere risikoen for fejldiagnose som i43. Yderligere forskning er nødvendig for at undersøge fordelene ved denne tilgang ved hjælp af patientprøver og tilskynde til dens vedtagelse i klinisk praksis.

Ekspression og oprensning af histidinmærket Taq DNA-polymerase
Baseret på den etablerede protokol for Taq DNA-polymeraseekspression og oprensning44 blev N-terminal histidinmærket Taq DNA-polymeraseplasmid konstrueret under kontrol af en koldchokpromotor for at lette dens ekspression og oprensningsproces som forklaret ovenfor (figur 1A og figur 2A). Ved blot at ændre IPTG-koncentration og temperatur kan ekspressionsniveauet for denne nye konstruktion således let kontrolleres. Inkubation af celler indeholdende Taq DNA-polymeraseplasmidet ved 16 °C med 1 mM IPTG viste forbedret ekspression af His-Taq DNA-polymerase. Derudover krævede den tidligere etablerede protokol44 tidskrævende polyethyleneimin (PEI) udfældningstrin, som kan springes over med den konstruktion, der anvendes her, da slutproduktets renhed var upåvirket og sammenlignelig med kommercielt tilgængelig Taq-polymerase (figur 2B). Den oprensede Taq-polymerase migrerede langsommere end den kommercielle på grund af tilstedeværelsen af linkerpeptiderne mellem enzymet og histidinmærket ved N-terminalen. Taq DNA-polymerase blev produceret med succes med 0,98 mg / L E. coli-kultur af rent protein.

Ekspression og oprensning af dobbelt His- og Strep-Tagged MMLV revers transkriptase
Baculovirusekspressionssystemet blev brugt til at udtrykke MMLV-RT med en C-terminal dobbelt His og Strep-tag i insektceller (Sf9) som beskrevet i figur 2A. En tidligere undersøgelse viste, at det C-terminalt mærkede MMLV-RT demonstrerer højere aktivitet, hvor både det N-terminalt mærkede protein og det C-terminalt mærkede protein blev syntetiseret i silkeorme ved hjælp af silkeorm-baculovirusekspressionsvektorsystemet (silkeorm-BEVS)41. For at producere et homogent MMLV-RT-protein blev de samme strategier og protokoller anvendt som præsenteret i ovennævnte undersøgelse. Som et resultat blev forbedret ekspression og mere end 95% rent protein opnået med et udbytte på 7,5 mg / L insektcellekultur som vist ved SDS-PAGE gelresultatet (figur 2C).

Optimering og standardisering af den multipleksede qRT-PCR
En optimeret og udviklet intern multiplekset RT-qPCR-test blev samlet og produceret med succes efter runder med buffer- og primermixoptimering for at detektere tre forskellige almindelige luftvejsvira samtidigt (figur 3)37. Det første kit blev designet til at målrette SARS-CoV-2 N-genet, Influenza A H1N1 og H3N2 og Influenza B-genet; og det andet kit er til SARS-CoV-2 N-gen, MERS ORF1a og upE-gener. Således kan begge sæt med succes og samtidigt registrere alle tre mål som den arbejdsgang, der præsenteres her (figur 3). Syntetiske RNA-prøver af hver af de vira, der anvendes i denne protokol, blev amplificeret, hvilket indikerer muligheden for at anvende et multiplekset kit til påvisning af almindelige respiratoriske vira. Følsomheden af denne diagnostiske test svarer til tidligere rapporterede resultater i patientprøver. I tilfælde, hvor patienter viser influenzalignende symptomer, har brugen af en multiplexet realtids RT-qPCR vist sammenlignelige resultater med SARS-CoV-2, influenza A og influenza B multiplexed assay45.

Følsomhed og detektionsgrænse for internt multiplekset RT-qPCR-kit over for almindelige luftvejsvira
Effektiviteten af det interne multipleksede kit blev vurderet ved hjælp af to sæt primerblanding og det tilsvarende syntetiske RNA for hvert sæt som illustreret i den multipleksede RT-qPCR-arbejdsgang (figur 3). Ved anvendelse af hver primerblanding med 10 gange seriel fortynding af hver syntetisk RNA-blanding fra 10 til 105 kopier / μL som skabelon kan følsomheden, specificiteten og detektionsgrænsen for begge udviklede multipleksede RT-qPCR bestemmes ved hjælp af standardkurveanalyse. Dette gøres i tre uafhængige replikater af hver test for at bekræfte effektiviteten og konsistensen af det multipleksede RT-qPCR-sæt. Som et resultat kan de to kits, der er udviklet her, med succes forstærke alle tre målgener samtidigt med så lave som 10 RNA-kopier / reaktion set ved amplifikationskurven og detektionsgrænsen (LoD) (figur 4 og figur 5). Hældningen og R2-værdierne for hver kurve blev anvendt til at evaluere effektiviteten af individuelle assays (figur 4 og figur 5). R2-værdierne gav et skøn over godheden af den lineære tilpasning til datapunkterne. I et effektivt qPCR-assay skalR2 være meget tæt på eller større end 0,90. Amplifikationseffektiviteten af influenza A-, influenza B- og SARS-CoV-2- eller MERS-CoV- og SARS-CoV-2-titreringer var over 99 % for alle primersæt (figur 4 og figur 5). Derudover beviser de små fejlbjælker reproducerbarheden af hvert multiplekset RT-qPCR-sæt. Det er vigtigt at bemærke, at begge multipleksede sæt ikke viste nogen primerdimerdannelse, da der ikke er nogen forstærkning med den negative kontrol (data ikke vist). Således forstærkede designet af begge sæt alle målgener med succes med pålidelighed, specificitet og følsomhed.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over den multipleksede et-trins RT-qPCR-sætsamling. Samlingen af kittet starter med ekspression og oprensning af de nødvendige enzymer, Taq DNA-polymerase og MMLV revers transkriptase. Begge enzymer skulle føres gennem to kolonner som illustreret. For det andet var der efter rensningen optimering af reaktionsbetingelserne og det termiske cykelprogram, hvilket resulterede i optimale betingelser for det multipleksede testsæt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Plasmidkonstruktionerne og oprensningsresultaterne af His-Taq Pol og C-His/Strep MMLV-RT. (A) Skematisk gengivelse af de rekombinante His-Taq Pol og C-His/Strep MMLV-RT ekspressionsplasmider. Forkortelser: CSPA-promotor - koldchokprotein A-promotor; RBS - ribosombindingssted; 6x Hans - Hans-tag med seks histidiner; TEE - translationelt forbedrende element; Taq ORF - Taq Pol åben læseramme; Polh - polyhedrin promotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT åben læseramme; TEV - etch virus protease målretning site; 8x Hans - Hans-tag med otte histidiner; Strep - Strep-tag; polyA - SV40 sent polyadenyleringssignal. B) SDS-PAGE-analyse af His-Taq Pol udtrykt i BL21(DE3), E. coli-celler og Taq-polymerase. C) SDS-PAGE-analyse af oprenset C-His/Strep MMLV-RT udtrykt i Sf9-cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk diagram over de to optimerede, standardiserede og udviklede multipleksede et-trins RT-qPCR-sæt sammen med reaktionskomponenterne. Hver enkelt multiplekset reaktion består af dNTP'er, bufferblanding, enzymblanding, multiplexet primerblanding og den syntetiske RNA-skabelon, der skal testes. A) Influenza A/B, SARS-CoV-2-kit og B) MERS ORF1a/UPE, SARS-CoV-2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Amplifikationskurverne og detektionsgrænsen for influenza A/B og SARS-CoV2 multiplex et-trins RT-qPCR-sæt. Amplifikationskurverne for den multipleksede RT-qPCR blev udført under anvendelse af syntetisk RNA-blanding med 10 gange serielle fortyndinger (10 til 105 kopier / μL) med alle mål (A) influenza A, (C) influenza B og (E) SARS-CoV-2. Reaktionerne blev udført i tre eksemplarer med en replikat som eksempel. Detektionsgrænsen for (B) influenza A, (D) influenza B og (F) SARS-CoV-2 blev bestemt ved at plotte gennemsnittet af tre replikeredeCt værdier mod logkopinummeret. Determineringskoefficienten (R2) og ligningen for den lineære regressionskurve blev beregnet og vist i hvert panel. Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen mellem tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Forstærkningskurverne og detektionsgrænsen for MERS ORF1a/upE og SARS-CoV2 multiplex et-trins RT-qPCR-sæt. Amplifikationskurverne for den multipleksede RT-qPCR blev udført under anvendelse af en syntetisk RNA-blanding med 10 gange serielle fortyndinger (10 til 105 kopier / μL) med alle mål (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE og (E) SARS-Cov-2. Reaktionerne blev udført i tre eksemplarer med en replikat som eksempel. Detektionsgrænsen for (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE og (F) SARS-CoV-2 blev bestemt ved at plotte gennemsnittet af tre replikerede Ct-værdier mod logkopinummeret. Determineringskoefficienten (R2) og ligningen for den lineære regressionskurve blev beregnet og vist i hvert panel. Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen mellem tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Listen over komponenterne til Taq polymeraselysisbuffer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Taq polymeraserensningsbuffere. Listen over de bufferkomponenter, der er nødvendige til tokolonneoprensning af Taq DNA-polymerase. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Taq polymerase opbevaring buffer. Listen over de bufferkomponenter, der kræves for at dialysere Taq DNA-polymerase efter oprensning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Listen over komponenterne til MMLV-RT-lysisbuffer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: MMLV-RT-rensningsbuffere. Listen over de bufferkomponenter, der er nødvendige til rensning af MMLV-RT med to kolonner. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: MMLV-RT-lagringsbuffer. Listen over de bufferkomponenter, der er nødvendige for at dialysere MMLV-RT efter rensning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Oplysninger om primere og sonder. Sekvensoplysningerne for de primere og sonder, der er nødvendige for hver multiplekset primerblanding. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er en tung økonomisk byrde for sundhedssystemet over hele verden som følge af de høje infektions- og dødelighedsrater på grund af spredningen af almindelige luftvejsvira såsom SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV-varianter 12,19,20. Motiveret af ansvarsfølelsen mod at lette denne byrde indså vi behovet for en hurtig, præcis og tilgængelig diagnostisk analyse såsom RT-qPCR for at skelne mellem disse almindelige vira i en test. På grund af den multipleksede karakter af qRT-PCR er det muligt at diagnosticere og skelne SARS-CoV-2 fra andre luftvejsvira, såsom influenza A / B- og MERS-CoV-vira. I sidste ende kan der opnås en bedre og mere præcis behandling af patienter ved hjælp af det nuværende multipleksede assay46. For at rekapitulere beskriver denne undersøgelse realiseringen af en intern et-trins multiplex RT-qPCR-test, der kan målrette mod to forskellige kombinationer. Hver kombination består af tre forskellige luftvejsvira for at begrænse spredningen af sådanne infektiøse vira og reducere den økonomiske byrde for sundhedssystemet.

Det nuværende multipleksede RT-qPCR-kit kan målrette mod to kombinationer af almindelige luftvejsvira (SARS-CoV-2, Influenza A / B) og (SARS-CoV-2, MERS UpE / ORF1a). Den beskrevne protokol er let, ligetil at følge og meget billigere end de kommercielt tilgængelige et-trins RT-qPCR-sæt. En anden fordel var de multipleksede egenskaber ved sættet, der kan målrette mod flere virale genetiske mål ved at udnytte forskellige sonde- og primerkombinationer. Således muliggør sættets alsidighed og enkelhed enkel implementering i ressourcebegrænsede indstillinger. Sættet er også velegnet til omfattende test, hvilket resulterer i nøjagtig og præcis diagnose, der kan hjælpe med at begrænse spredning og co-infektion af flere luftvejsvira.

Foreløbige analyser blev udført for at sikre, at alle mål blev forstærket med succes og med høj nøjagtighed for at begrænse dannelsen af ikke-specifikke produkter. Først gennemgik vi flere optimeringsrunder for komponenterne i bufferblandingen og deres respektive koncentrationer i buffermixet. For det andet optimerede vi primerne og deres tilsvarende koncentrationer i både primerblandingen og PCR-reaktionen. For det tredje optimerede vi sammensætningen af enzymblandingen for at maksimere dens aktivitet og minimere den hæmmende virkning af MMLV-RT på aktiviteten af Taq-polymerase47. For det fjerde optimerede vi de termiske cyklusbetingelser under hensyntagen til begrænsningerne for begge enzymers termiske stabilitet. Ved at inkorporere de førnævnte forbedringer var den optimerede version af vores multipleksede RT-qPCR-kit, der præsenteres her, i stand til at detektere ned til 10 RNA-kopier/reaktioner med høj specificitet, følsomhed og reproducerbarhed.

Nogle forholdsregler skal overvejes for at sikre høj effektivitet og vellykket implementering af multiplex RT-qPCR-assayet for at forhindre hæmmere og undgå pipetteringsfejl. Da hver facilitet er unik i sin opsætning og instrumentering, er her nogle trin, der kan hjælpe, mens du bygger et sådant sæt: For det første skal handsker altid bæres for at undgå tilstedeværelse af forurening og PCR-hæmmer. For det andet skal du sørge for at bruge aerosolresistente filterspidser og bruge en kalibreret pipette. Sørg desuden for at bruge vand af PCR-kvalitet. Brug af kontrol uden skabelon hjælper med at verificere tilstedeværelsen af enhver forurening. Det er vigtigt at bemærke, at masterblandingen skal forberedes for alle replikater for at undgå mulig kontaminering og pipetteringsvariation. Andre fejlfindingstip skal overvejes for at opretholde sondekvaliteten, såsom at citere bestanden og undgå brug af vand til at fortynde den. Det er vigtigt at følge producentens anbefalinger om opbevaring og fortynding af den anvendte primer og sonde. Således vil disse enkle tip hjælpe med at opretholde succesen med multiplex RT-qPCR-analysen og sikre dens høje effektivitet.

Selvom de multipleksede RT-qPCR-assays, der er udviklet i denne forskning, har vist gode resultater, når de testes med de syntetiske virale RNA'er, skal dets effektivitet i en reel klinisk indstilling stadig evalueres og valideres. Desværre gør manglen på kliniske prøver det vanskeligt at bestemme analysens specificiteter og følsomhed for de vira, der er inkluderet i denne undersøgelse. Det er dog værd at nævne, at LOD (detektionsgrænse), som angiver det mindste antal kopier, der kan detekteres i 100% af prøverne, blev etableret gennem en statistisk bevist lineær regression. Dette giver potentiale for klinisk diagnose og er et vigtigt fund af forskningen.

Et internt multiplex et-trins RT-qPCR-assay, der er sondebaseret, blev med succes udviklet og valideret med høj effektivitet i denne undersøgelse. SARS-CoV-2 kan let detekteres og skelnes fra andre almindelige luftvejsvira som forklaret ovenfor med høj effektivitet og pålidelighed i kun et reagensglas. Således vil afhængigheden af denne multipleksede funktion hjælpe med at øge diagnosens gennemstrømning og spare tid, omkostninger og prøve sammenlignet med andre testmetoder og singleplex PCR. Alt i alt er muligheden for, at luftvejsvira cirkulerer sammen, høj, og denne multiplex et-trins RT-qPCR vil være meget fordelagtig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af King Abdullah University of Science and Technology gennem kernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 201 Taq-polymerase MMLV-RT proteinekspression COVID-19 SARS-CoV-2 influenza A/B MERS-CoV multiplex RT-qPCR
Udvikling af multiplex realtids RT-qPCR-assays til påvisning af SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter