זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס<em> Xenopus laevis</em> על ידי הכנסת transgenes לתוך גרעין הזרע בעקבות השתלת גרעיני ביצים מופרית.
שילוב יציב של מוצרים גן משובט לתוך הגנום Xenopus יש צורך לשלוט על הזמן והמקום של ביטוי, להביע את הגנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות העוברית, וכדי להגדיר כיצד משפרי ומקדמי לווסת התבטאות גנים בתוך העובר. פרוטוקול הפגינו כאן ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות מהונדס Xenopus laevis עוברים. גישה זו transgenesis כוללת שלושה חלקים: 1. גרעינים זרע מבודדים מבוגר X. laevis testis על ידי טיפול lysolecithin, אשר permeabilizes הממברנה הפלסמטית הזרע. 2. ביצה היא תמצית שהוכנה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, תוספת של סידן לגרום לחלץ להתקדם שלבי הביניים של מחזור התא, וכן צנטריפוגה במהירות גבוהה לבודד cytosol שלבי הביניים. 3. השתלת גרעיני: גרעין ותמצית בשילוב עם ה-DNA פלסמיד לינארית להיות הציג כמו transgene ואת כמות קטנה של אנזים הגבלה. במהלך התגובה קצר, לחלץ ביצה חלקית decondenses הכרומטין זרע האנזים הגבלה יוצרת הפסקות כרומוזומליות המקדמים של transgene רקומבינציה לתוך הגנום. גרעינים זרע שטופלו מושתלים מכן לתוך ביצים מופרית. שילוב של transgene מתרחשת בדרך כלל לפני המחשוף העוברית הראשונה כגון כי עוברי וכתוצאה מכך הם לא chimeric. עוברים אלו ניתן לנתח ללא כל צורך לגדל את הדור הבא, המאפשר לדור יעיל ומהיר של עוברים מהונדס עבור ניתוחים של האמרגן ותפקוד הגן. למבוגרים X. laevis הנובע הליך זה גם להפיץ את דרך transgene germline והוא יכול לשמש כדי ליצור שורות של חיות טרנסגניות למטרות מרובות.
עבור כל אחד לבנות מהונדס להיבדק, אנחנו בדרך כלל השתלת גרעינים לתוך 500-1000 ביצים, בקנה המידה הזה, אנחנו יכולים ליצור עוברים מהונדס המבטא עד 10 מבנים שונים ליום, תלוי כמה נקבות רבות המושרה להטיל ביצים. של השתלות אלו, כשליש לדבוק ביצים 60-80% מהם עוברים דרך gastrulation ביקוע להמשיך ?…
The authors have nothing to disclose.
המימון עבודתנו מסופק על ידי ה-NIH, מצעד הפרוטות, ואת האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)