यह वीडियो प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक पैदा करने के लिए एक विधि दर्शाता<em> Xenopus laevis</em> Unfertilized अंडे में परमाणु प्रत्यारोपण द्वारा पीछा शुक्राणु नाभिक में transgenes की शुरूआत के द्वारा.
Xenopus जीनोम में क्लोन जीन उत्पादों की स्थिर एकीकरण समय और अभिव्यक्ति की जगह नियंत्रण, भ्रूण विकास के बाद के चरणों में व्यक्त जीनों, और परिभाषित करने के लिए कैसे enhancers के प्रमोटरों और भ्रूण के भीतर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल यहाँ प्रदर्शन करने के लिए कुशलतापूर्वक ट्रांसजेनिक Xenopus laevis भ्रूण का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह transgenesis दृष्टिकोण तीन भागों शामिल हैं: 1. शुक्राणु नाभिक वयस्क एक्स से अलग कर रहे हैं lysolecithin, जो शुक्राणु प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes के साथ इलाज के द्वारा laevis वृषण. 2. अंडे निकालने कम गति centrifugation, कैल्शियम के अलावा निकालने के कारण कोशिका चक्र के interphase प्रगति, और एक उच्च गति interphase cytosol अलग centrifugation से तैयार है. 3. परमाणु प्रत्यारोपण: नाभिक और निकालने linearized प्लाज्मिड transgene और प्रतिबंध एंजाइम की एक छोटी राशि के रूप में पेश किया डीएनए के साथ संयुक्त कर रहे हैं. एक छोटी प्रतिक्रिया के दौरान, अंडे निकालने आंशिक रूप से शुक्राणु chromatin decondenses और प्रतिबंध एंजाइम गुणसूत्र टूटता है कि जीनोम में transgene के पुनर्संयोजन को बढ़ावा देने के उत्पन्न करता है. इलाज शुक्राणु नाभिक तो unfertilized अंडे में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. Transgene की एकता आमतौर पर पहली भ्रूण दरार ऐसी है कि जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण chimeric नहीं कर रहे हैं करने से पहले होता है. ये भ्रूण किसी भी अगली पीढ़ी के लिए नस्ल, ट्रांसजेनिक भ्रूण के प्रमोटर और जीन समारोह के विश्लेषण के लिए कुशल और तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति की जरूरत के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. वयस्क एक्स इस प्रक्रिया से परिणामस्वरूप laevis भी germline के माध्यम से transgene प्रचार और ट्रांसजेनिक जानवरों के कई प्रयोजनों के लिए लाइनों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रत्येक ट्रांसजेनिक निर्माण का परीक्षण किया जा करने के लिए, हम आम तौर पर 500-1000 अंडे में नाभिक प्रत्यारोपण, इस पैमाने पर, हम ट्रांसजेनिक प्रति दिन 10 अलग constructs व्यक्त भ्रूण उत्पन्न, कितने मादा अंडे देना करने…
The authors have nothing to disclose.
हमारे काम के लिए अनुदान एनआईएच, ऑफ डाइम्स के मार्च, और अमेरिकन कैंसर सोसायटी द्वारा प्रदान की गई है.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)