이 비디오 프로토콜은 유전자 변형을 생성하는 방법을 보여줍니다<em> Xenopus laevis</em> unfertilized 계란으로 핵 이식 뒤에 정자 핵에 transgenes의 소개로.
Xenopus 게놈에 복제된 유전자 제품의 안정적인 통합은 배아 발달의 나중 단계에서 유전자를 표현하고, 그때와 발기인은 배아 내에서 유전자 발현을 조절하는 방법 정의, 표현의 시간과 장소를 제어하는 것이 필요합니다. 프로토콜 여기서 보여주는 효율적으로 유전자 변형 Xenopus laevis의 배아를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 1 :이 transgenesis 방식은 세 부분을 포함한다. 정자의 핵은 성인 X.으로부터 격리 아르 정자 플라즈마 막을 permeabilizes lysolecithin와 치료에 의해 laevis의 testis. 2. 에그 추출물은 저속 원심 분리, 세포주기의 계면으로 진행하기 위해 추출을 일으킬뿐만 아니라 칼슘과 계면 cytosol를 분리하기 위해 고속 원심 분리에 의해 준비가되어 있습니다. 3. 핵 이식 : 핵 및 추출물은 transgene 및 제한 효소의 작은 금액으로 소개하는 선형 플라스미드 DNA와 결합하고 있습니다. 짧은 반응 동안, 달걀 추출물은 부분적으로 정자 염색질을 decondenses하고 제한 효소는 게놈에 transgene의 재조합을 촉진 염색체 휴식을 생성합니다. 취급 정자 핵은 다음 unfertilized 계란으로 이식하고 있습니다. transgene의 통합은 일반적으로 이전 결과 배아는 키메라하지 않는 등 처음 배아 절단을 발생합니다. 이 배아는 발기인 및 유전자 기능 분석을위한 유전자 변형 배아의 효과적이고 신속한 세대 수 있도록, 다음 세대 번식을 필요로하지 않고 분석할 수 있습니다. 성인 X. 이 절차로 인한 laevis 또한 germline 통해 transgene을 전파하고 여러 목적을 위해 유전자 변형 동물의 라인을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
각 형질 구성을 테스트하기 위해서, 우리는 일반적으로 500-1000 계란으로 핵 이식,이 규모에서, 우리는 알을 낳기 위해 유도 얼마나 많은 암컷에 따라 하루에 10 가지 다른 구조까지 표현 형질 배아를 생성할 수 있습니다. 이러한 transplantations의 계란 클리브 중 하나에 대한 세 번째이 cleaving 배아의 60~80%가 정상적으로 gastrulation을 통해 진행합니다. 이 배아의 10-50% 사이에 사용하는 반응 조건에 따라?…
The authors have nothing to disclose.
우리의 작업에 대한 자금은 NIH, 천의 월, 및 미국 암 협회에 의해 제공됩니다.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)