Disección del complejo eye-brain de Fly Pupae: Un método para aislar el tejido retiniano

Overview

Este video describe cómo diseccionar y aislar el complejo ojo-cerebro de las pupas de Drosophila. El protocolo destacado demuestra el procedimiento que produce tejido de alta calidad, compatible con, por ejemplo, inmunostaining, así como, otros experimentos de expresión génica.

Protocol

Este protocolo es un extracto de DeAngelis y Johnson, Disección de la Retina Pupal Drosophila para Inmunohistoquímica, Análisis Occidental, y Aislamiento de ARN,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparación de tejidos

1. Establecer cruces de Drosophila (como se describió anteriormente en Greenspan,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) o cultivar cepas específicas de Drosophila para obtener pupas del genotipo deseado. Para asegurar que un gran número de pupas emerjan casualmente, establezca estos cultivos de moscas en duplicados en los medios de alimentos ricos en nutrientes o los medios alimenticios estándar generosamente complementados con pasta de levadura.
2. Mantener los cultivos de Drosophila a 25 °C. Para las cruces que utilizan el sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 es un controlador ideal expresado en células de disco ocular larvario posteriores al surco morfógeno y durante todo el desarrollo pupal. La cruz UAS-lacZ X GMR-GAL4 sirve como una cruz de control ideal, ya que impulsa la expresión de la proteína β-galactosidasa no endógena e inerte.
3. Utilice la punta de una férula de bambú de 6" que ha sido mojada con agua destilada para levantar suavemente las pre-pupas blancas(Figura 1B)del lado de los viales de cultivo saludable(Figura 1A)y colóquelas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml(Figura 1C).
4. Coloque los tubos en una caja de punta de pipeta de plástico junto con un pequeño trozo de tejido empapado en agua destilada para mantener la cámara con suficiente humedad para proteger a la pupae de la desecación (Figura 1D). Incubar las pupas a 25 °C hasta su disección.
5. Usa una férula seca de bambú de 6" para empujar suavemente a la pupae desde el tubo de microcentrífuga y en un plato de disección negro. Coloca un trozo fresco de cinta a doble cara en el plato de disección lejos de la pupae.
6. Usando un par de fórceps, coloque cuidadosamente el lado dorsal pupae hacia arriba (es decir, operculums mirando hacia arriba, Figura 1B) en la cinta (Figura 2A). Asegúrese de que las pupas se adhieren bien a la cinta.
   NOTA: La humedad en la caja pupal inhibirá la adhesión segura a la cinta, en cuyo caso, permitirá que las pupas se sequen al aire antes de colocarlas en la cinta de doble cara.

2. Disección de complejos eye-brain

1. Utilice fórceps para eliminar el operculum de cada pupa (Figura 2C).
2. Use tijeras de microdisección para cortar o abrir la caja pupal de cada pupa. Abra la caja pupal para revelar la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, asegurando los bordes de la caja pupal a la cinta de doble cara(Figura 2C).
   NOTA: No es necesario revelar por completo la pupae.
3. Perforar el abdomen de cada pupa con fórceps afilados, para agarrar al animal, y sacarlo de su caja pupal(Figura 2C).
4. Coloque la pupae en el plato de disección negro, lejos de la cinta, y cubra con aproximadamente 400 μL de solución amortiguada por fosfato frío (PBS, pH 7.4).
5. Agarra cada pupa por el abdomen con fórceps, y con tijeras de microdisección, haz un corte transversal limpio a través de todo el tórax, cortando la pupa por la mitad(Figura 2D).
6. Retire el remanente posterior de cada canal del PBS y colóquelo a un lado en el plato de disección (no deseche, véase el paso 3.2.1).
7. Usando dos pares de fórceps finos, abra el tórax y la cabeza de cada pupa para revelar el complejo ojo-cerebro (Figura 2E). Para ello, sujete los bordes cortados del epitelio torácico y desgarre gradualmente para abrir el tórax y luego la cápsula de la cabeza, exponiendo el complejo eye-brain y el tejido graso circundante.
8. Sin agarrar el tejido, utilice fórceps para guiar el complejo ocular-cerebral lejos de los restos de la cápsula de la cabeza o recoger el complejo ojo-cerebro de la cápsula de la cabeza desgarrada.
   NOTA: El complejo eye-brain tiene forma de mancuerna, blanquecino y más translúcido que la grasa de color crema circundante(Figura 2B,E).
9. Con los fórceps, retire cuidadosamente la mayor parte de la grasa asociada con los complejos oculares y cerebrales sin tocar el tejido ocular.

3. Procesamiento de tejido para inmunofluorescencia

1. Disecciona al menos 6-10 pupas como se describe (pasos 2.1-2.9).
   NOTA: Tres a cuatro réplicas independientes de cada disección tienden a producir suficientes datos para probar una hipótesis.
2. Lavado y fijación
   1. Corte la punta de una punta de pipeta P20 o P100 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la abertura de la punta a ~ 1 mm de radio y lubricar canalizando una mezcla de PBS y grasa arriba y abajo. Esta grasa se puede obtener de los restos de la canal retirados en el paso 2.6.
   2. Transfiere los complejos eye-brain a ~400 μL de PBS en un plato de vidrio de 9 pozos, sobre hielo. Utilice la punta lubricada y un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 para transferirlo.
      NOTA: Los complejos oculares se adherirán a puntas no sobritas durante la pipeteo y se dañarán o perderán.
   3. Retire la grasa restante asociada con el tejido ocular pipendo el PBS hacia arriba y hacia abajo para arremolinar suavemente los complejos de los ojos y el cerebro. En este y todos los pasos de lavado posteriores, no canaliza directamente los complejos oculares de pipeta hacia arriba y hacia abajo, ya que esto dañará el tejido ocular frágil.
   4. Transfiera los complejos eye-brain en un volumen mínimo (<20 μL) de PBS a por lo menos 250 μL de fijación. Mezcle canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 35 min, en hielo.
      NOTA: La misma punta lubricada preparada en el paso 3.1.1 se puede utilizar para esta transferencia.
   5. Con la misma punta de pipeta, transfiera los complejos eye-brain a un pozo que contenga ~400 μL de PBS. Mezcle canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5-10 minutos en hielo, para lavarla. Repita el paso de lavado al menos dos veces.
      NOTA: Los complejos eye-brain se pueden mantener durante varias horas en el lavado final de PBS, en hielo o a 4 °C, antes de proceder al Paso 3.3.1.
3. Tinción de anticuerpos
   1. Para bloquear el tejido antes de la exposición a soluciones de anticuerpos, transfiera los complejos eye-brain a ~400 μL de PBT. Utilice la punta lubricada y un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 para la transferencia. Incubar de 10 a 60 minutos, en hielo.
   2. Prepare la solución principal de anticuerpos diluyendo anticuerpos apropiados en PBT. Dado que los complejos eye-brain se incuban en 10 alícuotas de μL de solución de anticuerpos, el volumen preparado será una réplica de 10.
   3. Aliquot 10 μL de solución de anticuerpos en un pozo limpio de una bandeja de micropocillos de 72 pozos.
   4. Corte la punta de una punta de pipeta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la abertura de la punta a ~ 0.5 mm en radio y lubricar canalizando PBT arriba y abajo.
   5. Transfiera no más de 5 complejos eye-brain, en un volumen de <3 μL de PBS, a cada pozo de solución de anticuerpos de 10 μL utilizando un micropipette de desplazamiento de aire P10 y la punta lubricada.
   6. Homogeneice la solución de anticuerpos canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. No pipetee los complejos oculares hacia arriba y hacia abajo, ya que esto dañará el tejido.
   7. Para minimizar la evaporación de la solución de anticuerpos, coloque un pequeño trozo de tejido empapado en agua destilada en la bandeja de micrograve y selle la bandeja (por ejemplo, con la tapa proporcionada). Incuba durante la noche a 4 °C.
   8. Transfiera los complejos eye-brain de la bandeja de micropocillos a ~400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pozos, para lavar. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P10 y una punta lubricada con PBT (prepárese como se describe en el paso 3.3.4). Mezcle canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 minutos en hielo.
   9. Repita el paso de lavado al menos dos veces. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos eye-brain entre soluciones de lavado.
   10. Prepare la solución secundaria de anticuerpos diluyendo anticuerpos secundarios adecuados etiquetados con fluoróforo en PBT según sea necesario. 100 μL de solución secundaria de anticuerpos es suficiente por lote de 6-10 pupas. Aliquot la solución secundaria de anticuerpos en un plato de disección de vidrio de 9 pozos.
   11. Transfiera los complejos eye-brain a una solución secundaria de anticuerpos. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para la transferencia.
   12. Incubar los complejos eye-brain en solución secundaria de anticuerpos durante 1-2 h a temperatura ambiente, o 3-5 h a 4 °C. Para evitar el blanqueamiento de fluoróforos por luz, cubra la preparación con papel de aluminio.
       NOTA: La duración óptima de la incubación en la solución secundaria de anticuerpos puede diferir según los anticuerpos primarios y secundarios utilizados.
   13. Transfiere los complejos eye-brain a ~400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pozos, para lavar. Mezcle canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 minutos en hielo. Este paso de lavado debe repetirse al menos dos veces.
4. Fijación secundaria
   1. Para una fijación secundaria, transfiera los complejos eye-brain a por lo menos 200 μL de fijación e incubar durante 20 min a temperatura ambiente o 35 min a 4 °C.
      NOTA: La fijación secundaria endurece el tejido ocular, lo que ayuda al montaje (paso 3.5).
   2. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir complejos eye-brain a ~400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pozos, sobre hielo, para lavar durante 5 minutos.
   3. Repita el paso de lavado al menos una vez.
   4. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos eye-brain a ~400 μL de PBS en un plato de vidrio de 9 pozos, sobre hielo, para enjuagar durante 1-2 min. Mantenga el tejido en movimiento pipendo PBS, pero no el tejido, arriba y abajo para evitar que los complejos de los ojos-cerebro se asienten y se adhieran al plato de vidrio durante el enjuague PBS.
5. montura
   1. Transfiere los complejos eye-brain a ~200 μL de medios de montaje. Utilice un micropipette de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos eye-brain. Deje que el tejido se reequilible en los medios de montaje durante 1-2 h.
   2. Coloque una caída de 5-8 μL de medios de montaje frescos en una diapositiva limpia del microscopio.
   3. Corte una punta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la abertura de la punta a ~ 0.5 mm en radio y utilice esto y un micropipette de desplazamiento de aire P10 para transferir los complejos eye-brain en 5-8 μL de medios de montaje en la gota de medios de montaje en la diapositiva.
   4. Utilice dos agujas de tungsteno para separar los ojos de los lóbulos ópticos. Ancle un complejo de cerebro ocular a la diapositiva con una aguja de tungsteno resistente y corte cada ojo lejos de su lóbulo óptico asociado con una aguja fina de tungsteno(Figura 2F).
   5. Utilice la aguja de tungsteno fino para maniobrar cada ojo a la superficie del microscopio deslizarse con la superficie basal de cada ojo adyacente a la diapositiva. Baje suavemente una cubierta limpia sobre el tejido y asegure con esmalte de uñas.
      NOTA: Organizar los ojos en la diapositiva para que estén cerca uno del otro o en una línea facilitará la microscopía posterior.
   6. Imagine las retinas con microscopía fluorescente o confocal.
      NOTA: Las diapositivas deben almacenarse a 4 °C si no se imágenes inmediatamente.

Representative Results

Figura 1: Selección y cultivo de pupas para la disección. (A) Tercera instar larvaria errante (L3) larvas y pupas localizar a lo largo de los lados de cultivos sanos de Drosophila. (B) Las pre-pupas pueden ser identificadas por su color blanco translúcido como pigmento aún no se ha generado en la caja protectora de pupal. El eje dorsal-ventral anterior y dorsal de la pupa se muestran en azul. Una férula de bambú húmeda se utiliza para desalojar y recoger pre-pupas de las paredes del vial. (C) Las pupas se colocan dentro de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que están etiquetados apropiadamente (genotipo, fecha de recolección y hora de recolección) y(D)cultivados dentro de una cámara humidificada montada a partir de una caja vacía de punta de pipeta. La humedad se mantiene colocando un pedazo de tejido húmedo dentro de la caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diseccionar el ojo pupal. (A) Pupae se adhieren a cinta de doble cara en un plato de disección negro. Las coordenadas anterior, posterior y dorsal se indican en azul. (B) Para aislar los complejos eye-brain (uno solo se muestra aquí), (C) la pupa se elimina por primera vez de su caso pupal. Se muestran los pasos importantes en este proceso. Las líneas rojas indican dónde rasgar y abrir la caja pupal después de eliminar el operculum. A continuación, las pupas se retiran de la caja de pupal desgarrada con fórceps. (D) Una pupa expuesta se corta primero a lo largo del tórax con tijeras de microdissección (posición indicada con línea roja discontinua) y el epitelio de la cabeza luego cuidadosamente abierto (flechas rojas), como se muestra en (E) para revelar el complejo opaco ojo-cerebro. (F) Después de la incubación con anticuerpos apropiados, las retinas se cortan de los complejos de los ojos y el cerebro. Se muestran los pasos importantes en este proceso. El cerebro ocular se estabiliza con una aguja de tungsteno resistente (izquierda) y las retinas removidas con una aguja fina de tungsteno (derecha). Para análisis de proteínas y ARN, las retinas no fijas se pueden cortar limpiamente de lóbulos ópticos usando una cuchilla fina de afeitar o tijeras de microdissección, en lugar de una aguja fina de tungsteno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O