Dissecção do Complexo Olho-Cérebro da Pupae Mosca: Um Método para Isolar tecido retiniano

Overview

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o complexo olho-cérebro de Drosophila pupae. O protocolo em destaque demonstra o procedimento que produz tecido de alta qualidade, compatível com, por exemplo, imunostaining, bem como outros experimentos de expressão genética.

Protocol

Este protocolo é um trecho de DeAngelis e Johnson, Dissecção da Retina Pupal Drosophila para Imunohistoquímica, Análise Ocidental e Isolamento do RNA,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação tecidual

1. Configurar cruzes de Drosophila (como descrito anteriormente em Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) ou cultivar cepas específicas de Drosophila para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas surja coincidentemente, estabeleça essas culturas de moscas em duplicatas na mídia alimentar rica em nutrientes ou na mídia alimentar padrão generosamente complementada com pasta de levedura.
2. Mantenha as culturas de Drosophila a 25 °C. Para cruzes que utilizam o sistema UAS-GAL4, o GMR-GAL4 é um driver ideal expresso em células de disco ocular larval posteriores ao sulco morfogenético e durante todo o desenvolvimento pupal. O cross UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve como uma cruz de controle ideal, pois impulsiona a expressão da proteína não endógena e inerte β-galactosidase.
3. Use a ponta de uma tala de bambu de 6" que foi molhada com água destilada para levantar suavemente a pré-pupae branca(Figura 1B) do lado dos frascos de cultura saudável(Figura 1A) e coloque em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL(Figura 1C).
4. Coloque os tubos em uma caixa de ponta de pipeta de plástico junto com um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada para manter a câmara em umidade suficiente para proteger a pupa de dessecação(Figura 1D). Incubar a pupa a 25 °C até a dissecação.
5. Use uma tala de bambu seca de 6" para empurrar suavemente a pupa para fora do tubo de microcentrifuuge e para um prato de dissecação preto. Coloque um pedaço fresco de fita dupla face no prato de dissecação longe da pupae.
6. Usando um par de fórceps, coloque cuidadosamente o lado dorsal pupae para cima (ou seja, operculums voltados para cima, Figura 1B) na fita(Figura 2A). Certifique-se de que a pupae adere bem à fita.
   NOTA: A umidade na caixa pupal inibirá a adesão segura à fita, nesse caso, permitirá que a pupa seque ao ar antes de colocar na fita de dupla face.

2. Dissecção de Complexos olho-cérebro

1. Use fórceps para remover o operculum de cada pupa (Figura 2C).
2. Use uma tesoura de microdisseção para cortar ou cortar a caixa de pupal de cada pupa. Retalho abre a caixa pupal para revelar a cabeça, o tórax e o segmento abdominal anterior, protegendo as bordas da caixa pupal à fita de dupla face(Figura 2C).
   NOTA: Não é necessário revelar inteiramente a pupae.
3. Furar o abdômen de cada pupa com fórceps afiados, para agarrar o animal, e removê-lo de sua caixa pupal(Figura 2C).
4. Coloque a pupae sobre o prato de dissecção preta, longe da fita, e cubra com cerca de 400 μL de solução tamponada de fosfato gelado (PBS, pH 7.4).
5. Segure cada pupa pelo abdômen com fórceps, e com uma tesoura de microdisseção, faça um corte transversal limpo através de todo o tórax, cortando a pupa ao meio(Figura 2D).
6. Retire o remanescente posterior de cada carcaça do PBS e coloque de um lado no prato de dissecação (não descarte, veja o passo 3.2.1).
7. Usando dois pares de fórceps finos, abra o tórax e a cabeça de cada pupa para revelar o complexo olho-cérebro(Figura 2E). Para isso, segure as bordas cortadas do epitélio tórax e gradualmente rasgue para abrir o tórax e, em seguida, a cápsula da cabeça, expondo o complexo olho-cérebro e o tecido adiposo circundante.
8. Sem agarrar o tecido, use fórceps para guiar o complexo olho-cérebro para longe dos restos da cápsula da cabeça ou colher o complexo olho-cérebro da cápsula da cabeça rasgada.
   NOTA: O complexo olho-cérebro é em forma de haltere, off-white e mais translúcido do que a gordura cor de creme circundante(Figura 2B,E).
9. Com fórceps, remova cuidadosamente a maior parte da gordura associada aos complexos olho-cérebro sem tocar no tecido ocular.

3. Processamento de tecido para imunofluorescência

1. Disseque pelo menos 6-10 pupas como descrito (etapas 2.1-2.9).
   NOTA: Três a quatro réplicas independentes de cada dissecção tendem a produzir dados suficientes para testar uma hipótese.
2. Lavagem e Fixação
   1. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P20 ou P100 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~1 mm no raio e lubrifique por tubos de pbs e gordura para cima e para baixo. Esta gordura pode ser obtida a partir dos restos de carcaça removidos na etapa 2.6.
   2. Transfira os complexos olho-cérebro em ~400 μL de PBS em um prato de vidro de 9 poços, no gelo. Use a ponta lubrificada e uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 para transferir.
      NOTA: Os complexos oculares-cerebrais aderirão a pontas não lubrificadas durante a pipetação e serão danificados ou perdidos.
   3. Remova a gordura restante associada ao tecido ocular, canalizando o PBS para cima e para baixo para girar suavemente os complexos olho-cérebro. Nesta e em todas as etapas de lavagem subsequentes, não se sobresso em complexos diretamente de cérebro-olho para cima e para baixo, pois isso danificará o frágil tecido ocular.
   4. Transfira os complexos olho-cérebro em um volume mínimo (<20 μL) de PBS em pelo menos 250 μL de fixação. Misture a solução para cima e para baixo. Incubar por 35 minutos, no gelo.
      NOTA: A mesma ponta lubrificada preparada na etapa 3.1.1 pode ser usada para esta transferência.
   5. Com a mesma ponta de pipeta, transfira os complexos olho-cérebro para um poço contendo ~400 μL de PBS. Misture a solução para cima e para baixo e incubar por 5-10 minutos no gelo, para lavar. Repita o passo de lavagem pelo menos duas vezes.
      NOTA: Os complexos olho-cérebro podem ser mantidos por várias horas na lavagem final da PBS, no gelo, ou a 4 °C, antes de seguir para a Etapa 3.3.1.
3. Mancha de anticorpos
   1. Para bloquear o tecido antes da exposição a soluções de anticorpos, transfira os complexos olho-cérebro para ~400 μL de PBT. Use a ponta lubrificada e uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 para a transferência. Incubar por 10 a 60 min, no gelo.
   2. Prepare a solução de anticorpos primárias diluindo anticorpos apropriados em PBT. Uma vez que os complexos olho-cérebro são incubados em 10 μL alíquotas de solução de anticorpos, o volume preparado será uma réplica de 10.
   3. Aliquot 10 μL de solução de anticorpos em um poço limpo de uma bandeja de microwell de 72 poços.
   4. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~0,5 mm em raio e lubrifique por pipetar PBT para cima e para baixo.
   5. Transfira não mais do que 5 complexos olho-cérebro, em um volume de <3 μL de PBS, em cada poço de 10 μL de solução de anticorpos usando uma micropipette de deslocamento de ar P10 e a ponta lubrificada.
   6. Homogeneize a solução de anticorpos, encanar a solução para cima e para baixo. Não encobra os complexos olho-cérebro para cima e para baixo, pois isso danificará o tecido.
   7. Para minimizar a evaporação da solução de anticorpos, coloque um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada na bandeja de microwell e sele a bandeja (por exemplo, com a tampa fornecida). Incubar durante a noite a 4 °C.
   8. Transfira os complexos olho-cérebro da bandeja de microwell para ~400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, para lavar. Use uma micropipette de deslocamento de ar P10 e ponta lubrificada pbt (prepare-se conforme descrito na etapa 3.3.4). Misture a solução para cima e para baixo. Incubar por 5-10 minutos no gelo.
   9. Repita o passo de lavagem pelo menos duas vezes. Use uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 e ponta lubrificada pbt para transferir os complexos olho-cérebro entre soluções de lavagem.
   10. Prepare a solução de anticorpos secundários diluindo anticorpos secundários com marca fluorófora apropriada em PBT, conforme necessário. 100 μL de solução de anticorpos secundários é suficiente por lote de 6-10 pupas. Aliquot a solução de anticorpos secundários em um prato de dissecção de vidro de 9 poços.
   11. Transfira os complexos olho-cérebro para uma solução secundária de anticorpos. Use uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada pbt para a transferência.
   12. Incubar os complexos olho-cérebro em solução de anticorpos secundários para 1-2 h em temperatura ambiente, ou 3-5 h a 4 °C. Para evitar branqueamento de fluoroforos pela luz, cubra a preparação com papel alumínio.
       NOTA: A duração ideal da incubação na solução de anticorpos secundários pode diferir de acordo com os anticorpos primários e secundários utilizados.
   13. Transfira os complexos olho-cérebro em ~400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, para lavar. Misture a solução para cima e para baixo. Incubar por 5-10 minutos no gelo. Esta etapa de lavagem deve ser repetida pelo menos duas vezes.
4. Fixação secundária
   1. Para uma fixação secundária, transfira os complexos olho-cérebro para pelo menos 200 μL de fixação e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente ou 35 min a 4 °C.
      NOTA: A fixação secundária endurece o tecido ocular, que auxilia na montagem (passo 3.5).
   2. Use uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 e uma ponta lubrificada pbt para transferir complexos olho-cérebro em ~400 μL de PBT em um prato de vidro de 9 poços, no gelo, para lavar por 5 minutos.
   3. Repita o passo de lavagem pelo menos uma vez.
   4. Use uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 e ponta lubrificada pbt para transferir os complexos olho-cérebro em ~400 μL de PBS em um prato de vidro de 9 poços, no gelo, para enxaguar por 1-2 min. Mantenha o tecido em movimento, pipetando PBS, mas não o tecido, para cima e para baixo para evitar que os complexos olho-cérebro se acomodem e aduquem ao prato de vidro durante a lavagem de PBS.
5. montagem
   1. Transfira os complexos olho-cérebro para ~200 μL de mídia de montagem. Use uma micropipette de deslocamento de ar P20 ou P100 e ponta lubrificada pbt para transferir os complexos olho-cérebro. Deixe o tecido equilibrar-se em mídia de montagem por 1-2 h.
   2. Coloque uma gota de 5-8 μL de mídia de montagem fresca em um slide de microscópio limpo.
   3. Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a abertura da ponta para ~0,5 mm em raio e use esta e uma micropipette de deslocamento de ar P10 para transferir os complexos olho-cérebro em 5-8 μL de mídia de montagem na gota de mídia de montagem no slide.
   4. Use duas agulhas de tungstênio para separar os olhos dos lobos ópticos. Fixar um complexo olho-cérebro ao slide com uma agulha de tungstênio resistente e cortar cada olho longe de seu lobo óptico associado com uma agulha de tungstênio fino(Figura 2F).
   5. Use a agulha de tungstênio fino para manobrar cada olho até a superfície do microscópio slide com a superfície basal de cada olho adjacente ao slide. Abaixe suavemente um deslizamento de cobertura limpo sobre o tecido e fixe com esmalte.
      NOTA: Organizar os olhos no escorregador para que eles estejam próximos um do outro ou em uma linha facilitará a microscopia subsequente.
   6. Imagem das retinas usando microscopia fluorescente ou confocal.
      NOTA: Os slides devem ser armazenados a 4 °C se não forem imagens imediatamente.

Representative Results

Figura 1: Seleção e cultura de pupae para dissecção. (A) Perambulando terceira larva instar (L3) larvas e pupas se localizam ao longo dos lados de culturas saudáveis de Drosophila. (B) A pré-pupa pode ser identificada por sua cor branca translúcida, pois o pigmento ainda não foi gerado na caixa pupal protetora. O eixo anterior-posterior e dorsal-ventral da pupa são mostrados em azul. Uma tala de bambu úmida é usada para desalojar e colher pré-pupae das paredes do frasco. (C) Pupae são colocados dentro de tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL que são rotulados adequadamente (genótipo, data de coleta e tempo de coleta) e (D) cultivados dentro de uma câmara umidificada montada a partir de uma caixa vazia de ponta de pipeta. A umidade é mantida colocando um pedaço de tecido úmido dentro da caixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dissecando o olho pupal. (A) Pupae são aderidos a fita dupla face em um prato de dissecação preto. Coordenadas anteriores, posteriores e dorsais são indicadas em azul. (B) Para isolar os complexos olho-cérebro (um único é mostrado aqui), (C) a pupa é primeiramente removida de seu caso pupal. Passos importantes nesse processo são mostrados. Linhas vermelhas indicam onde rasgar e abrir a caixa de pupal depois que o operculum é removido. As pupas são então removidas da caixa pupal rasgada com fórceps. (D) Uma pupa exposta é primeiramente cortada ao longo do tórax com tesoura de microdisseção (posição indicada com linha vermelha tracejada) e o epitélio da cabeça, em seguida, cuidadosamente rasgado aberto (setas vermelhas), como mostrado em (E) para revelar o complexo olho-cérebro opaco. (F) Após a incubação com anticorpos apropriados, as retinas são cortadas de complexos olho-cérebro. Passos importantes nesse processo são mostrados. O cérebro-olho é estabilizado com uma agulha de tungstênio resistente (esquerda) e as retinas removidas com uma agulha de tungstênio fino (direita). Para análises de proteínas e RNA, as retinas não fixadas podem ser limpamente cortadas de lóbulos ópticos usando uma lâmina de barbear fina ou uma tesoura de microdisseção, em vez de uma agulha de tungstênio fina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O