Dissectie van het oog-hersencomplex van Fly Pupae: een methode om netvliesweefsel te isoleren

Overview

Deze video beschrijft hoe je het oog-hersencomplex kunt ontleden en isoleren van Drosophila poppen. Het aanbevolen protocol demonstreert de procedure die hoogwaardig weefsel oplevert, compatibel met bijvoorbeeld immunostaining en andere genexpressie-experimenten.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit DeAngelis and Johnson, Dissectie van de Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Weefselvoorbereiding

1. Stel Drosophila-kruisen (zoals eerder beschreven in Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) of cultuurspecifieke Drosophila-stammen op om poppen van het gewenste genotype te verkrijgen. Om ervoor te zorgen dat een groot aantal poppen toevallig tevoorschijn komt, stelt u deze vliegculturen in tweevoud vast op voedselrijke voedselmedia of standaardvoedselmedia die royaal worden aangevuld met gistpasta.
2. Houd de Drosophila-culturen op 25 °C. Voor kruisen die het UAS-GAL4-systeem gebruiken, is GMR-GAL4 een ideale driver uitgedrukt in larvale oogschijfcellen posterieure aan de morfogenetische groef en tijdens de popontwikkeling. Het kruis UAS-lacZ X GMR-GAL4 dient als een ideaal controlekruis omdat het de expressie van het niet-endogene en inerte β-galactosidase-eiwit stimuleert.
3. Gebruik de punt van een 6" bamboespalk die nat is gemaakt met gedestilleerd water om witte voorpoppeppen (figuur 1B) voorzichtig van de zijkant van gezonde kweekflacons te tillen ( figuur1A) en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml ( figuur1C).
4. Plaats de buizen in een plastic pipettipdoos samen met een klein stukje weefsel gedrenkt in gedestilleerd water om de kamer op voldoende vochtigheid te houden om de poppen te beschermen tegen uitdroging (Figuur 1D). Incubeer de poppen bij 25 °C tot dissectie.
5. Gebruik een droge 6" bamboespalk om de poppen voorzichtig uit de microcentrifugebuis te duwen en op een zwarte ontleedschaal. Leg een vers stuk dubbelzijdige tape op de ontleedschaal weg van de poppen.
6. Plaats met behulp van een tang de pop dorsale kant naar boven (d.w.z. operculums naar boven, figuur 1B) op de tape (afbeelding 2A). Zorg ervoor dat de poppen goed aan de tape hechten.
   OPMERKING: Vocht op de popbehuizing remt een veilige hechting aan de tape, in welk geval de poppen aan de lucht kunnen drogen voordat ze op de dubbelzijdige tape worden geplaatst.

2. Dissectie van oog-hersencomplexen

1. Gebruik een tang om het operculum van elke pop te verwijderen (figuur 2C).
2. Gebruik een microdissectieschaar om de poppenkast van elke pop te snijden of open te snijden. Flap open de popbehuizing om het hoofd, de thorax en het voorste buiksegment te onthullen, waarbij de randen van de popbehuizing aan de dubbelzijdige tape worden vastgespecht (figuur 2C).
   OPMERKING: Het is niet nodig om de poppen volledig te onthullen.
3. Doorboor de buik van elke pop met een scherpe tang, om het dier vast te pakken en verwijder het uit zijn poppenkast (figuur 2C).
4. Plaats de poppen op de zwarte dissectieschaal, uit de buurt van de tape, en dek af met ongeveer 400 μL ijskoude fosfaatbufferoplossing (PBS, pH 7.4).
5. Pak elke pop bij de buik met een tang en maak met een microdissectieschaar een schone dwarsdoorsnede door de hele thorax en snijd de pop doormidden (figuur 2D).
6. Verwijder het achterste restant van elk karkas uit het PBS en leg het aan één kant op de ontleedschaal (niet weggooien, zie stap 3.2.1).
7. Open met behulp van twee paar fijne tangen de thorax en het hoofd van elke pop om het oog-hersencomplex te onthullen (figuur 2E). Om dit te doen, grijpt u de snijranden van het thoraxepitheel en scheurt u geleidelijk om de thorax en vervolgens de hoofdcapsule te openen, waardoor het oog-hersencomplex en het omliggende vetweefsel worden blootgelegd.
8. Zonder het weefsel vast te pakken, gebruikt u een tang om het oog-hersencomplex weg te leiden van de restanten van de hoofdcapsule of schept u het oog-hersencomplex uit de gescheurde hoofdcapsule.
   OPMERKING: Het oog-hersencomplex is haltervormig, off-white en doorschijnender dan het omringende crèmekleurige vet(figuur 2B,E).
9. Verwijder met een tang zorgvuldig het meeste vet dat verband houdt met de oog-hersencomplexen zonder het oogweefsel aan te raken.

3. Verwerking van weefsel voor immunofluorescentie

1. Ontleed ten minste 6-10 poppen zoals beschreven (stappen 2.1-2.9).
   OPMERKING: Drie tot vier onafhankelijke replica's van elke dissectie hebben de neiging om voldoende gegevens op te leveren om een hypothese te testen.
2. Wassen en fixeren
   1. Snijd de punt van een P20- of P100-pipetpunt met een schoon scheermesje om de tipopening te vergroten tot ~ 1 mm in straal en smeer door een mix van PBS en vet op en neer te pipetten. Dit vet kan worden verkregen uit de karkasresten die in stap 2.6 zijn verwijderd.
   2. Breng de oog-hersencomplexen over in ~400 μL PBS in een 9-put glazen schaal, op ijs. Gebruik de gesmeerde punt en een P20 of P100 luchtverplaatsingsmicropipet om over te brengen.
      OPMERKING: Oog-hersencomplexen hechten zich aan ongebreidelde uiteinden tijdens het pipetten en worden beschadigd of verloren.
   3. Verwijder het resterende vet dat bij het oogweefsel is betrokken door de PBS op en neer te gieten om de oog-hersencomplexen voorzichtig te wervelen. In deze en alle daaropvolgende wasstappen, niet direct pipetteer oog-hersencomplexen op en neer, omdat dit het fragiele oogweefsel zal beschadigen.
   4. Breng de oog-hersencomplexen in een minimaal volume (<20 μL) PBS over in ten minste 250 μL fixatief. Meng door de oplossing op en neer te pipetten. Incubeer gedurende 35 minuten, op ijs.
      OPMERKING: Dezelfde gesmeerde punt die in stap 3.1.1 is voorbereid, kan voor deze overdracht worden gebruikt.
   5. Breng met dezelfde pipetpunt de oog-hersencomplexen over in een put met ~400 μL PBS. Meng door de oplossing op en neer te pipetten en incubeer gedurende 5-10 minuten op ijs, om te wassen. Herhaal de wasstap minstens twee keer.
      OPMERKING: Oog-hersencomplexen kunnen enkele uren worden onderhouden in de laatste PBS-wasbeurt, op ijs of bij 4 °C, voordat u doorgaat naar stap 3.3.1.
3. Antilichaam kleuring
   1. Om het weefsel te blokkeren voorafgaand aan blootstelling aan antilichaamoplossingen, brengt u de oog-hersencomplexen over naar ~400 μL PBT. Gebruik de gesmeerde punt en een P20 of P100 luchtverplaatsingsmicropipet voor de overdracht. Incubeer gedurende 10 tot 60 minuten, op ijs.
   2. Bereid de primaire antilichaamoplossing voor door geschikte antilichamen in PBT te verdunnen. Aangezien oog-hersencomplexen worden geïncubeerd in 10 μL aliquots antilichaamoplossing, zal het bereide volume een replicatie van 10 zijn.
   3. Aliquot 10 μL antilichaamoplossing in een schone put van een 72-put microwell tray.
   4. Snijd de punt van een P10 pipetpunt met een schoon scheermesje om de puntopening te vergroten tot ~ 0,5 mm in straal en smeer door PBT op en neer te pipetten.
   5. Breng niet meer dan 5 oog-hersencomplexen, in een volume van <3 μL PBS, over in elke 10 μL bron van antilichaamoplossing met behulp van een P10 luchtverplaatsingsmicropipet en de gesmeerde punt.
   6. Homogeniseer de antilichaamoplossing door de oplossing op en neer te pipetten. Pipetteer de oog-hersencomplexen niet op en neer, omdat dit het weefsel zal beschadigen.
   7. Om verdamping van de antilichaamoplossing te minimaliseren, plaatst u een klein stukje weefsel gedrenkt in gedestilleerd water in de microwell-lade en sluit u de lade af (bijv. met het meegeleverde deksel). Incubeer 's nachts bij 4 °C.
   8. Breng de oog-hersencomplexen van de microwell-lade over in ~ 400 μL PBT in een 9-welled glazen schaal, om te wassen. Gebruik een P10 luchtverplaatsingsmicropipet en PBT-gesmeerde punt (bereid u voor zoals beschreven in stap 3.3.4). Meng door de oplossing op en neer te pipetten. Incubeer gedurende 5-10 minuten op ijs.
   9. Herhaal de wasstap minstens twee keer. Gebruik een P20 of P100 luchtverplaatsing micropipet en PBT-gesmeerde tip om de oog-hersencomplexen tussen wasoplossingen over te brengen.
   10. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor door indien nodig geschikte fluorofoorgeagde secundaire antilichamen in PBT te verdunnen. 100 μL secundaire antilichaamoplossing is voldoende per partij van 6-10 poppen. Aliquot de secundaire antilichaamoplossing in een 9-welled glazen dissectieschaal.
   11. Breng de oog-hersencomplexen over in secundaire antilichaamoplossing. Gebruik een P20 of P100 luchtverplaatsing micropipet en PBT-gesmeerde tip voor de overdracht.
   12. Incubeer de oog-hersencomplexen in secundaire antilichaamoplossing gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of 3-5 uur bij 4 °C. Om bleken van fluoroforen door licht te voorkomen, bedek het preparaat met folie.
       OPMERKING: Optimale incubatieduur in secundaire antilichaamoplossing kan verschillen afhankelijk van de gebruikte primaire en secundaire antilichamen.
   13. Breng de oog-hersencomplexen over in ~400 μL PBT in een 9-put glazen schaal, om te wassen. Meng door de oplossing op en neer te pipetten. Incubeer gedurende 5-10 minuten op ijs. Deze wasstap moet minstens twee keer worden herhaald.
4. Secundaire fixatie
   1. Breng voor een secundaire fixatie de oog-hersencomplexen over naar ten minste 200 μL fixatief en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur of 35 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Secundaire fixatie verstijft het oogweefsel, wat helpt bij de montage (stap 3.5).
   2. Gebruik een P20 of P100 luchtverplaatsing micropipet en PBT-gesmeerde tip om oog-hersencomplexen over te brengen in ~ 400 μL PBT in een 9-put glazen schaal, op ijs, om gedurende 5 minuten te wassen.
   3. Herhaal de wasstap minstens één keer.
   4. Gebruik een P20 of P100 luchtverplaatsing micropipet en PBT-gesmeerde punt om de oog-hersencomplexen over te brengen in ~400 μL PBS in een 9-put glazen schaal, op ijs, om 1-2 minuten te spoelen. Houd het weefsel in beweging door PBS, maar niet het weefsel, op en neer te pipetten om te voorkomen dat oog-hersencomplexen bezinken en zich aan de glazen schaal vastkuren tijdens PBS-spoelen.
5. Montage
   1. Breng de oog-hersencomplexen over in ~200 μL montagemedia. Gebruik een P20 of P100 luchtverplaatsing micropipet en PBT-gesmeerde tip om de oog-hersencomplexen over te brengen. Laat het weefsel gedurende 1-2 uur in montagemedia equilibreren.
   2. Plaats een druppel verse montagemedia van 5-8 μL op een schone microscoopschuif.
   3. Snijd een P10-tip met een schoon scheermesje om de tipopening te vergroten tot ~ 0,5 mm in straal en gebruik deze en een P10 luchtverplaatsingsmicropipet om de oog-hersencomplexen in 5-8 μL montagemedia over te brengen in de druppel montagemedia op de glijbaan.
   4. Gebruik twee wolfraamnaalden om de ogen van optische kwabben te scheiden. Speld een oog-hersencomplex met een stevige wolfraamnaald aan de glijbaan en snijd elk oog weg van de bijbehorende optische kwab met een fijne wolfraamnaald(figuur 2F).
   5. Gebruik de fijne wolfraamnaald om elk oog naar het oppervlak van de microscoopschuif te manoeuvreren met het basale oppervlak van elk oog naast de glijbaan. Laat voorzichtig een schone cover-slip over het weefsel zakken en zet vast met nagellak.
      OPMERKING: Het rangschikken van de ogen op de dia zodat ze dicht bij elkaar of in een lijn zijn, vergemakkelijkt de daaropvolgende microscopie.
   6. Beeld het netvlies met behulp van fluorescerende of confocale microscopie.
      OPMERKING: Dia's moeten bij 4 °C worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden afgebeeld.

Representative Results

Figuur 1: Selectie en cultuur van poppen voor dissectie. (A) Zwervende derde larvale instar (L3) larven en poppen lokaliseren zich langs de zijkanten van gezonde Drosophila-culturen. (B) Pre-poppen kunnen worden geïdentificeerd door hun doorschijnende witte kleur als pigment moet nog worden gegenereerd in de beschermende pop geval. Voorste-posterieure en dorsaal-ventrale as van de pop worden in blauw weergegeven. Een vochtige bamboespalk wordt gebruikt om pre-poppen van de flaconwanden los te maken en te plukken. (C) Poppen worden geplaatst in microcentrifugebuizen van 1,5 ml die op de juiste wijze zijn geëtiketteerd (genotype, datum van verzameling en tijdstip van verzameling) en (D) worden gekweekt in een bevochtigde kamer die is samengesteld uit een lege pipetpuntdoos. De luchtvochtigheid wordt gehandhaafd door een stuk vochtig weefsel in de doos te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Ontleden van het popoog. (A) Poppen worden op dubbelzijdige tape op een zwarte ontleedschaal vastgemaakt. Voorste, achterste en dorsale coördinaten zijn blauw aangegeven. (B) Om oog-hersencomplexen te isoleren (een enkele wordt hier getoond), (C) wordt de pop eerst uit zijn popgeval verwijderd. Belangrijke stappen in dit proces worden weergegeven. Rode lijnen geven aan waar de popbehuizing moet worden gescheurd en geopend nadat het operculum is verwijderd. De poppen worden vervolgens met een tang uit de gescheurde poppenkast verwijderd. (D) Een blootgestelde pop wordt eerst langs de thorax gesneden met een microdissectieschaar (positie aangegeven met een rode lijn) en het hoofdepitheel wordt vervolgens voorzichtig opengescheurd (rode pijlen), zoals weergegeven in (E) om het ondoorzichtige oog-hersencomplex te onthullen. (F) Na incubatie met geschikte antilichamen worden netvliezen gesneden uit oog-hersencomplexen. Belangrijke stappen in dit proces worden weergegeven. De ooghersenen worden gestabiliseerd met een stevige wolfraamnaald (links) en het netvlies wordt verwijderd met een fijne wolfraamnaald (rechts). Voor eiwit- en RNA-analyses kunnen niet-gefixeerde retina's netjes uit optische kwabben worden gesneden met behulp van een fijn scheermesje of microdissectieschaar, in plaats van een fijne wolfraamnaald. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O