Zerlegung des Augen-Hirn-Komplexes von Fly Pupae: Eine Methode zur Isolierung von Netzhautgewebe

Overview

Dieses Video beschreibt, wie man den Augen-Hirn-Komplex von Drosophila-Pupae seziert und isoliert. Das vorgestellte Protokoll zeigt das Verfahren, das hochwertiges Gewebe hervorbringt, das beispielsweise mit Immunfärbung kompatibel ist, sowie andere Genexpressionsexperimente.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus DeAngelis und Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Gewebevorbereitung

1. Richten Sie Drosophila-Kreuze (wie zuvor in Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) oder kulturspezifische Drosophila-Stämme beschrieben, um Pupae des gewünschten Genotyps zu erhalten. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Pupas zufällig entstehen, etablieren Sie diese Fliegenkulturen in Duplikat auf nährstoffreichen Lebensmittelmedien oder Standard-Lebensmittelmedien großzügig mit Hefepaste ergänzt.
2. Drosophila-Kulturen bei 25 °C pflegen. Für Kreuze, die das UAS-GAL4-System verwenden, ist GMR-GAL4 ein idealer Treiber, der in Larvenaugenscheibenzellen exprimiert wird, die hinter der morphogenetischen Furche und während der gesamten pupal-Entwicklung sind. Das Kreuz UAS-lacZ X GMR-GAL4 dient als ideales Regelkreuz, da es die Expression des nicht-endogenen und inerten β-Galactosidase-Proteins antreibt.
3. Verwenden Sie die Spitze einer 6" Bambusschiene, die mit destilliertem Wasser nass wurde, um weiße Vorpupae (Abbildung 1B) sanft von der Seite der gesunden Kulturfläschchen zu heben (Abbildung 1A) und legen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr (Abbildung 1C).
4. Legen Sie die Rohre in eine Kunststoff-Pipettenspitze zusammen mit einem kleinen Stück Gewebe in destilliertem Wasser getränkt, um die Kammer bei ausreichender Feuchtigkeit zu halten, um die Pupae vor Austrocknung zu schützen (Abbildung 1D). Die Pupae bei 25 °C bis zur Zerlegung inkubieren.
5. Verwenden Sie eine trockene 6" Bambusschiene, um die Pupae sanft aus dem Mikrozentrifugenrohr auf eine schwarze Sezierenstube zu schieben. Legen Sie ein frisches Stück doppelseitiges Klebeband auf die sezierende Schale weg von den Pupae.
6. Mit einem Zangenpaar die pupae dorsale Seite vorsichtig nach oben legen (d. h. Operculums nach oben, Abbildung 1B) auf das Band legen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die Welpen gut am Band kleben.
   HINWEIS: Feuchtigkeit auf dem Pupal-Gehäuse hemmt die sichere Haftung auf dem Band, in diesem Fall lassen Sie die Pupae lufttrocknen, bevor sie auf das doppelseitige Band.

2. Zerlegung von Augen-Hirn-Komplexen

1. Verwenden Sie Zangen, um das Operculum jedes Welpen zu entfernen (Abbildung 2C).
2. Verwenden Sie Mikrodissektionschere, um das Pupalgehäuse jedes Welpen zu schneiden oder zu schneiden. Klappe öffnen Sie das Pupal-Gehäuse, um den Kopf, Thorax und vorderes Bauchsegment zu offenbaren, und sichern Sie die Ränder des Pupalgehäuses auf dem doppelseitigen Band (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Pupae vollständig zu enthüllen.
3. Pierce den Bauch jeder Pupa mit scharfen Zangen, um das Tier zu greifen, und entfernen Sie es aus seinem Pupal-Gehäuse (Abbildung 2C).
4. Die Pupae auf die schwarze Sezierschale legen, weg vom Band, und mit ca. 400 l eiskalte Phosphat-Pufferlösung (PBS, pH 7.4) abdecken.
5. Greifen Sie jede Pupa durch den Bauch mit Zange, und mit Mikrodissektion Schere, machen Sie einen sauberen Querschnitt schnitt durch den gesamten Thorax, schneiden Sie die Pupa in die Hälfte (Abbildung 2D).
6. Entfernen Sie den hinteren Rest jedes Schlachtkörpers aus dem PBS und legen Sie ihn zur Seite auf die Sezschale (nicht entsorgen, siehe Schritt 3.2.1).
7. Öffnen Sie mit zwei Paaren feiner Zangen den Thorax und den Kopf jeder Pupa, um den Augen-Hirn-Komplex zu enthüllen (Abbildung 2E). Um dies zu tun, greifen Sie die Schnittkanten des Thoraxepithels und reißen Sie nach und nach, um den Thorax und dann die Kopfkapsel zu öffnen, indem Sie den Augen-Hirn-Komplex und das umgebende Fettgewebe freisetzen.
8. Ohne das Gewebe zu greifen, verwenden Sie Zangen, um den Augen-Hirn-Komplex von den Resten der Kopfkapsel weg zu führen oder den Augen-Hirn-Komplex aus der zerrissenen Kopfkapsel zu schöpfen.
   HINWEIS: Der Augen-Hirn-Komplex ist hantelförmig, cremefarben und durchscheinender als das umgebende cremefarbene Fett (Abbildung 2B,E).
9. Mit Zangen, entfernen Sie sorgfältig das meiste Fett, das mit den Augen-Hirn-Komplexen verbunden ist, ohne das Augengewebe zu berühren.

3. Verarbeitung von Gewebe für Immunfluoreszenz

1. Sezieren Sie mindestens 6-10 Welpen wie beschrieben (Schritte 2.1-2.9).
   HINWEIS: Drei bis vier unabhängige Replikationen jeder Sezierenin ergeben in der Regel ausreichende Daten, um eine Hypothese zu testen.
2. Waschen und Fixieren
   1. Schneiden Sie die Spitze einer P20- oder P100-Pipettespitze mit einer sauberen Rasierklinge, um die Spitzenöffnung auf 1 mm Radius zu erhöhen, und schmieren Sie, indem Sie eine Mischung aus PBS und Fett nach oben und unten pfeifen. Dieses Fett kann aus den in Schritt 2.6 entfernten Schlachtkörperresten gewonnen werden.
   2. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in eine 9-Well-Glasschale auf Eis in 400 L PBS. Verwenden Sie die geschmierte Spitze und eine P20 oder P100 Luftverschiebung Mikropipette zu übertragen.
      HINWEIS: Augen-Hirn-Komplexe haften an ungeschmierten Spitzen während der Pipettenundierung und werden beschädigt oder verloren.
   3. Entfernen Sie das restliche Fett, das mit dem Augengewebe verbunden ist, indem Sie das PBS nach oben und unten pfeifen, um die Augen-Hirn-Komplexe sanft zu wirbeln. In diesem und allen nachfolgenden Waschschritten, nicht direkt Pipette Auge-Hirn-Komplexe auf und ab, da dies das empfindliche Augengewebe beschädigen wird.
   4. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in einem minimalen Volumen (<20 l) von PBS in mindestens 250 l fixativ. Mischen Sie die Lösung nach oben und unten. 35 min auf Eis bebrüten.
      HINWEIS: Für diesen Transfer kann die gleiche geschmierte Spitze verwendet werden, die in Schritt 3.1.1 vorbereitet wurde.
   5. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe mit der gleichen Pipettespitze in einen Brunnen, der 400 L PBS enthält. Mischen Sie die Lösung nach oben und unten und brüten Sie für 5-10 min auf Eis, zu waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens zweimal.
      HINWEIS: Augen-Hirn-Komplexe können in der letzten PBS-Wäsche, auf Eis oder bei 4 °C mehrere Stunden lang gewartet werden, bevor sie mit Schritt 3.3.1 fortfahren.
3. Antikörper-Färbung
   1. Um das Gewebe vor der Exposition gegenüber Antikörperlösungen zu blockieren, übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe auf 400 L PBT. Verwenden Sie die geschmierte Spitze und eine P20 oder P100 Luftverschiebung Mikropipette für die Übertragung. 10 bis 60 min auf Eis bebrüten.
   2. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie geeignete Antikörper in PBT verdünnen. Da Augen-Hirn-Komplexe in 10 L Aliquots der Antikörperlösung inkubiert werden, wird das vorbereitete Volumen eine Replikation von 10 sein.
   3. Aliquot 10 l Antikörperlösung in einen sauberen Brunnen eines 72-Well-Mikrowell-Tabletts.
   4. Schneiden Sie die Spitze einer P10 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge, um die Spitzenöffnung auf 0,5 mm Radius zu erhöhen und durch Pipettieren von PBT nach oben und unten zu schmieren.
   5. Übertragen Sie nicht mehr als 5 Augen-Hirn-Komplexe in einem Volumen von <3 l PBS, in jeden 10-L-Bohrloch der Antikörperlösung mit einer P10 Luftverschiebungsmikropipette und der geschmierten Spitze.
   6. Homogenisieren Sie die Antikörperlösung, indem Sie die Lösung nach oben und unten pipetieren. Pipette nicht die Augen-Hirn-Komplexe auf und ab, da dies das Gewebe beschädigen wird.
   7. Um die Verdunstung der Antikörperlösung zu minimieren, legen Sie ein kleines Stück Gewebe, das in destilliertem Wasser eingeweicht ist, in die Mikrobrunnenschale und versiegeln Sie das Tablett (z. B. mit dem mitgelieferten Deckel). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   8. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe aus dem Mikrobrunnen-Tray in 400 L PBT in einer 9-welled Glasschale, zum Waschen. Verwenden Sie eine P10 Luftverschiebung Smicropipette und PBT-geschmierte Spitze (vorbereiten, wie in Schritt 3.3.4 beschrieben). Mischen Sie die Lösung nach oben und unten. 5-10 min auf Eis inkubieren.
   9. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens zweimal. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverschiebungsmikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Augen-Hirn-Komplexe zwischen Waschlösungen zu übertragen.
   10. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie geeignete fluorophor-markierte sekundäre Antikörper in PBT nach Bedarf verdünnen. Pro Charge von 6-10 Welpen reichen 100 l Sekundärantikörperlösung aus. Aliquot die sekundäre Antikörperlösung in eine 9-welled Glas-Dissektionschale.
   11. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in sekundäre Antikörperlösung. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverschiebungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze für den Transfer.
   12. Inkubieren Sie die Augen-Hirn-Komplexe in sekundärer Antikörperlösung für 1-2 h bei Raumtemperatur oder 3-5 h bei 4 °C. Um das Bleichen von Fluorophoren durch Licht zu verhindern, bedecken Sie die Zubereitung mit Folie.
       HINWEIS: Die optimale Inkubationsdauer in sekundärer Antikörperlösung kann je nach verwendetem primärer und sekundärer Antikörper variieren.
   13. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in eine 9-Well-Glasschale in 400 L PBT, um sie zu waschen. Mischen Sie die Lösung nach oben und unten. 5-10 min auf Eis inkubieren. Dieser Waschschritt sollte mindestens zweimal wiederholt werden.
4. Sekundäre Fixierung
   1. Übertragen Sie bei einer sekundären Fixierung die Augen-Hirn-Komplexe auf mindestens 200 l fixativ und brüten 20 min bei Raumtemperatur oder 35 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Die sekundäre Fixierung versteift das Augengewebe, was die Montage erleichtert (Schritt 3.5).
   2. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverschiebungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um Augen-Hirn-Komplexe in einer 9-Well-Glasschale auf Eis in 400 l PBT zu übertragen, um sie 5 min zu waschen.
   3. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens einmal.
   4. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverschiebungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Augen-Hirn-Komplexe in einer 9-Well-Glasschale auf Eis in 400 l PBS zu übertragen, um 1-2 min zu spülen. Halten Sie das Gewebe in Bewegung, indem Sie PBS, aber nicht das Gewebe, nach oben und unten pfeifen, um zu verhindern, dass sich Augen-Hirn-Komplexe während der PBS-Spülung absetzen und an der Glasschale festhalten.
5. Montage
   1. Übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in montagemedien im Wert von 200 L. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverschiebungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Augen-Hirn-Komplexe zu übertragen. Lassen Sie das Gewebe in Montagemedien für 1-2 h ausdemaieren.
   2. Legen Sie einen 5-8 L Tropfen frischer Montagemedien auf ein sauberes Mikroskopschlitten.
   3. Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge, um die Spitzenöffnung auf 0,5 mm Radius zu erhöhen und verwenden Sie diese und eine P10 Luftverschiebungsmikropipette, um die Augen-Hirn-Komplexe in 5-8 l Montagemedien in den Tropfen der Montagemedien auf dem Dia zu übertragen.
   4. Verwenden Sie zwei Wolframnadeln, um die Augen von optischen Lappen zu trennen. Pin ein Auge-Hirn-Komplex auf die Folie mit einer robusten Wolframnadel und schneiden Jedes Auge weg von seinem zugehörigen optischen Lappen mit einer feinen Wolframnadel (Abbildung 2F).
   5. Verwenden Sie die feine Wolframnadel, um jedes Auge auf die Oberfläche des Mikroskopschlittens mit der Basaloberfläche jedes Auges neben dem Dia zu manövrieren. Senken Sie vorsichtig einen sauberen Deckel-Schlupf über dem Gewebe und sichern Sie mit Nagellack.
      HINWEIS: Die Anordnung der Augen auf der Folie, so dass sie nahe beieinander oder in einer Linie sind, wird die nachfolgende Mikroskopie erleichtern.
   6. Stellen Sie die Netzhaut mit fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie ab.
      HINWEIS: Dias sollten bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort abgebildet werden.

Representative Results

Abbildung 1: Auswahl und Kultur der Pupae zur Zerlegung. (A) Wandernde dritte Larven instar (L3) Larven und Pupae an den Seiten gesunder Drosophila-Kulturen ansiedeln. (B) Pre-Pupae kann durch ihre transluzente weiße Farbe identifiziert werden, da Pigment noch im schützenden Pupalgehäuse erzeugt werden muss. Die vordere posteriorische und dorsal-ventrale Achse der Pupa ist blau dargestellt. Eine feuchte Bambusschiene wird verwendet, um Pre-Pupae von den Durchstecherwänden zu lösen und zu pflücken. (C) Pupae werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren platziert, die entsprechend beschriftet sind (Genotyp, Sammlungsdatum und Zeitpunkt der Sammlung) und (D) in einer befeuchteten Kammer kultiviert, die aus einer leeren Pipettenspitzenbox zusammengesetzt ist. Die Luftfeuchtigkeit wird aufrechterhalten, indem ein Stück feuchtes Gewebe in die Box einlegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zerlegen des Pupalauges. (A) Pupae werden auf doppelseitigem Klebeband auf einer schwarzen Sezierenderschale aufgehalten. Vordere, hintere und dorsale Koordinaten sind blau angegeben. (B) Um Augen-Hirn-Komplexe zu isolieren (hier wird ein einziger gezeigt), (C) wird die Pupilpe zuerst aus ihrem Pupal-Gehäuse entfernt. Wichtige Schritte in diesem Prozess werden angezeigt. Rote Linien zeigen an, wo das Pupalgehäuse nach dem Entfernen des Operculums zerrissen und geöffnet werden soll. Die Pupilbe werden dann mit Zangen aus dem zerrissenen Pupalkoffer entfernt. (D) Eine exponierte Pupa wird zuerst entlang des Thorax mit Mikrodissektionsschere (Position mit gestrichelter roter Linie) geschnitten und das Kopfepithel dann vorsichtig aufgerissen (rote Pfeile), wie in (E) gezeigt, um den undurchsichtigen Augen-Hirn-Komplex zu offenbaren. (F) Nach der Inkubation mit geeigneten Antikörpern werden Netzhaut aus Augen-Hirn-Komplexen geschnitten. Wichtige Schritte in diesem Prozess werden angezeigt. Das Augenhirn wird mit einer stabilen Wolframnadel (links) stabilisiert und die Netzhaut mit einer feinen Wolframnadel (rechts) entfernt. Für Protein- und RNA-Analysen können unfixierte Netzhaut mit einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektionsschere und nicht mit einer feinen Wolframnadel sauber aus optischen Lappen geschnitten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O