Overview
프로토콜은 꼬리에 있는 morpholino 주입에 의하여 제브라피시에 있는 유전자 발현의 표적으로 한 녹다운을 기술합니다.
Protocol
1. 모르폴리노 주입
- 모폴리노를 주입하기 전날, 주사플레이트(도 1)를만든다. 미세 주입 절차에 대한 물고기를 안정화하는 데 도움이 우물의 한쪽 끝에 노치를 잘라해야합니다.
- 불소 태그 모폴리노를 적절한 농도(1.2mM로 시작하는 것이 좋습니다)로 희석하고 65°C 수조에 5분간 배치하십시오.
- 모폴리노로 바늘을적재하십시오(참고: 바늘을 먼저 적재할지 아니면 먼저 팁을 잘라낼지 여부를 결정합니다).
- 바늘을 비스듬히 잘라냅니다.
- 마이크로 주입 시스템의 방향을 따라 주입 당 모르폴리노의 약 5 nl 거품을 주입. 모르폴리노의 더 큰 양은 조직을 방해할 수 있었습니다.
- 물고기를 마취하고 주사 판에 놓습니다. 모든 여분의 액체를 제거하고 바늘을 적절한 위치로 방향을 지정하고 뼈선(도2)에다산하십시오. 모르폴리노 주사에 적합한 현미경 및 미세 주입 장치를 사용하여(특정 시약표 참조), 도 2에도시된 바와 같이 전방에서 후방까지 지느러미에 모르폴리노를 주입한다. 후방에서 전방으로 주입하면 주사 중에 지느러미 조직이 롤업되고 매우 어렵습니다.
- 바늘을 재생 조직에 부드럽게 삽입하고 각 뼈 선 (도 2에서"1"으로 표시)에 단면하고 블라스데마 (도 2에서"2"로 표시)에 있을 때까지 탈모하게 밀어 넣습니다. 전체 지느러미를 통해 바늘을 밀어하지 않도록주의하십시오. 바늘이 올바르게 국한되면 모르폴리노를 주입하십시오(예: 한 번 클릭). 1.2 mM에서, 형광 태그 모르폴리노 용액은 정상적인 조명 조건에서도 노란색 녹색으로 나타납니다. 각 주입을 통해 모르폴리노 용액의 노란색 "퍼프"를 시각화할 수 있어 주사를 블라데마에 국소화하는 데 도움이 됩니다. 모폴리노 용액의 약 75 nl (10-15 클릭)은 뼈 선 당 주입해야합니다. 클릭 수간에 ~ 1초 간 일시 중지합니다. 우리는 전기 기만 제어로 복부를 사용하여 등쪽 측만 주입합니다.
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Representative Results
그림 1. A. 아가로즈로 만들어지고 모르폴리노의 미세 주입 중에 물고기를 잡을 수있는 작은 우물이 들어있는 주입 판의 회로도.
그림 2. 모르폴리노 미세 주입의 회로도. A. 생선의 머리를 우물에서 잘라 내고 생선이 안정적으로 유지하는 데 도움이됩니다. B. 낮은 배율에서, 바늘을 배열하여 지느러미의 재생 조직에 가깝도록 하십시오. C. 더 높은 배율에서, 각 뼈 지느러미 선(즉 각 blastema)에 모르폴리노 탈설을 주입한다. 바늘은 뼈선 (1)에 단면 조직에 다만 단면하게 입력하고, 그 다음 blastema (2)의 위치로 계속되어야 합니다. 참고: 회로도의 녹색 원은 주입의 위치를 표시하기 위한 것입니다. 모르폴리노는 각 주입 다음 녹색 /노란색 "퍼프"로 간략하게 시각화 할 수 있습니다; 그러나, 이것은 회로도에 도시된 것과 같이 지속되지 않습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| Micro-injection pump | World Precision Instruments, Inc. | PV830 | Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used |
| Micro-manipulator | World Precision Instruments, Inc. | MMJR | Right-handed (MMJL for lefthanded) |
| Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
| Needle holder | World Precision Instruments, Inc. | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
| Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
