Injeção de Morpholino: Um método para derrubar a expressão genética direcionada para estudar a função em zebrafish

Overview

O protocolo descreve o knockdown direcionado da expressão genética em zebrafish por injeção de morfolino na cauda.

Protocol

1. Injeção de Morfolino

1. Um dia antes de injetar o morfolino, faça uma placa de injeção(Figura 1). Certifique-se de cortar um entalhe em uma extremidade do poço, o que ajuda a estabilizar o peixe para o procedimento de microinjeção.
2. Diluir o morpholino marcado por fluoresceína para a concentração adequada (recomendo começar com 1,2 mM) e coloque em um banho de água de 65 °C, por 5 minutos.
3. Carregue a agulha com o morfolino (nota: dependendo se você encher ou carregar frontalmente sua agulha determinará se você carrega a agulha primeiro, ou cortará a ponta primeiro).
4. Corte a ponta da agulha em um ângulo.
5. Siga as instruções do seu sistema de micro-injeção para injetar uma bolha de aproximadamente 5 nl de morfelino por injeção. Volumes maiores de morfolino podem perturbar o tecido.
6. Anestesiar o peixe e colocar na placa de injeção. Remova todo o excesso de líquido e oriente a agulha até o local apropriado, apenas distal ao raio ósseo(Figura 2). Utilizando um microscópio e aparelho de microinjeção apropriados para injeções de morfolino (ver Tabela de Reagentes Específicos), injete o morfolino na barbatana de anterior para posterior, como mostrado na Figura 2. Injetar de posterior para anterior faz com que o tecido da barbatana enrole durante a injeção e é muito difícil.
7. Insira a agulha suavemente no tecido regenerativo, apenas distal a cada raio ósseo (marcado como "1" na Figura 2) e empurre distally até localizado no blastema (marcado como "2" na Figura 2). Tenha cuidado para não empurrar a agulha através de toda a barbatana. Quando a agulha estiver corretamente localizada, injete o morfolino (ou seja, clique uma vez). A 1,2 mM, a solução de morfolino marcada por fluoresceína aparece verde-amarela, mesmo em condições normais de luz. A cada injeção, pode ser visualizado um "puff" amarelo da solução de morfolino, que ajuda a localizar a injeção no blastema. Aproximadamente 75 nl (10-15 cliques) de solução de morfolino devem ser injetados por raio ósseo. Pausa ~ 1 seg entre cliques. Só injetamos o lado dorsal, usando o ventral como controle somente de eletroporação.

Representative Results

Figura 1. A. Esquema da placa de injeção, que é feita de agarose e contém um pequeno poço para segurar o peixe durante a microinjeção do morfelino.

Figura 2. Esquema de microinjeção de morfolino. A. Coloque o peixe no prato com a cabeça do peixe no entalhe cortado do poço, o que ajudará o peixe a se manter estável. B. Em baixa ampliação, organize a agulha para que ela fique perto do tecido regenerador da barbatana. C. Em uma ampliação mais elevada, injete o distal de morfelino em cada raio-barbatana óssea (ou seja, em cada blastema). A agulha deve entrar no tecido apenas distal para o raio ósseo (1), e depois continuar até a localização do blastema (2). Nota: os círculos verdes no esquema são feitos apenas para mostrar a localização da injeção. O morfolino pode ser brevemente visualizado como um "puff" verde/amarelo após cada injeção; no entanto, isso não persiste como mostrado no esquema.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump	World Precision Instruments, Inc.	PV830	Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder	World Precision Instruments, Inc.	5430-ALL	Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97	Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Number varies depending on the manufacturer	Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia