莫莫利诺注射：一种击倒目标基因表达的方法，研究斑马鱼的功能

Overview

该协议描述了通过在尾部注射变形金刚来有针对性地敲除斑马鱼的基因表达。

Protocol

1. 莫莫利诺注射

1. 注射变形金刚前一天，做一个注射板（图1）。确保在井的一端切出一个缺口，这有助于稳定鱼的微注射程序。
2. 将荧光素标记的变形金刚稀释到适当的浓度（建议从 1.2 mM 开始），并放置在 65 °C 的水浴中，5 分钟。
3. 用变形金刚加载针头（注意： 取决于您是回填还是正面加载，您的针头将决定您是先加载针头，还是先切尖）。
4. 以一个角度切断针尖。
5. 按照微注射系统的方向，每次注射注射约5 nl的形态素气泡。更大的变形金刚可能会破坏组织。
6. 麻醉鱼并放在注射板上。取出所有多余的液体，将针头定向到适当的位置，只需与骨射线（图2）分离。使用显微镜和微注射装置，适合变形金刚注射（见特定试剂表），将变形金刚从前部注射到后鳍，如图2所示。从后部注射到前部会导致鳍组织在注射过程中卷起，并且非常困难。
7. 将针头轻轻地插入再生组织中，只是与每一个骨射线（图2中标有"1"）相分离，并轻轻推至位于爆炸（图2中标记为"2"）。小心不要把针头穿过整个鳍。当针头正确本地化时，注射变形金刚（即单击一次）。在 1.2 mM 时，荧光素标记的变形金刚溶液呈黄绿色，即使在正常光线条件下也是如此。每次注射时，都可以可视化变形溶液的黄色"泡芙"，这有助于将注射局部化到爆破。每骨射线应注射约 75 nl （10-15 次点击） 的变形金刚溶液。点击之间暂停~1秒。我们只注射后侧，使用腹腔作为电波控制。

Representative Results

图1。A. 注射板的原理图，由蔗糖制成，含有一个小井，在变形金刚的微投射过程中容纳鱼。

图2。变形金刚微注射的原理图。A.将鱼放在盘子里，鱼头放在从井里切出的缺口里，这将有助于鱼保持稳定。B.在低倍率下，安排针头，使其接近鳍的再生组织。 C.在更高的放大倍率下，将变形金刚注射到每个骨鳍射线（即在每个爆破中）。针应该进入组织只是解剖到骨射线 （1）， 然后继续到爆炸的位置 （2）.注意：示意图中的绿色圆圈仅用于显示注射的位置。每次注射后，变形金刚可以短暂地想象成绿色/黄色的"泡芙"：但是，这不会像示意图中所示那样持续。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump	World Precision Instruments, Inc.	PV830	Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder	World Precision Instruments, Inc.	5430-ALL	Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97	Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Number varies depending on the manufacturer	Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia