Morpholino инъекции: метод нокдаун Целевой экспрессии генов для изучения функции в Зебрафиш

Overview

Протокол описывает целевой нокдаун экспрессии генов у зебры путем инъекции морфолино в хвост.

Protocol

1. Инъекция Морфолино

1. За день до введения морфолино сделайте инъекционной пластины(рисунок 1). Убедитесь в том, чтобы вырезать выемку на одном конце хорошо, что помогает стабилизировать рыбу для микроинъекции процедуры.
2. Разбавить морфолино с тегами флуоресксина до нужной концентрации (рекомендуем начинать с 1,2 мМ) и поместить в водяную баню 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
3. Загрузите иглу с морфолино (обратитевнимание: в зависимости от того, вы обратно заполнения или фронтальной нагрузки иглы будет определять, будете ли вы загрузить иглу в первую очередь, или сократить кончик в первую очередь).
4. Отрежьте кончик иглы под углом.
5. Следуйте указаниям вашей системы микро-инъекций, чтобы ввести примерно 5 нл пузырь морфолино за инъекцию. Большие объемы морфолино может нарушить ткани.
6. Обезболить рыбу и поместить на инъекционной тарелке. Удалите все излишки жидкости и сориентировать иглу в нужное место, просто дистал на костлявый луч(рисунок 2). Используя микроскоп и микроинъекции аппарата подходит для инъекций морфолино (см. Таблицу конкретных реагентов), вводить морфолино в плавник от передней до задней, как показано на рисунке 2. Инъекция от задней до передней вызывает плавник ткани свернуть во время инъекции и очень трудно.
7. Вставьте иглу осторожно в регенеративной ткани, просто дистальный к каждому костлявый луч (помечены "1" на рисунке 2) и нажмите distally до тех пор, пока находится в бластеме (с пометкой "2" на рисунке 2). Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть иглу через весь плавник. Когда игла правильно локализована, ввините морфолино (т.е. нажмите один раз). На 1,2 мМ, флуорескейн помечены морфолино решение появляется желто-зеленый, даже в нормальных условиях света. С каждой инъекцией можно визуализировать желтую «затяжку» раствора морфолино, которая помогает локализовать инъекцию бластеремы. Приблизительно 75 нл (10-15 кликов) раствора морфолино следует вводить в костлявый луч. Пауза 1 сек между щелчками. Мы вводим только спинную сторону, используя брюшной как электропорация только контроль.

Representative Results

Рисунок 1. A. Схема инъекционной пластины, которая изготовлена из агарозы и содержит небольшой колодец для удержания рыбы во время микроинъекции морфолино.

Рисунок 2. Схема микроинъекции морфолино. А. Поместите рыбу в блюдо с головой рыбы в вырезать из хорошо, что поможет рыбе оставаться стабильным. Б. При низком увеличении расположить иглу так, чтобы она была близка к регенерирующим тканям плавника. C. При более высоком увеличении ввишайте дистал морфолино каждому костному плавнику луча (т.е. в каждую бластерму). Игла должна войти в ткань просто дистальный костлявый луч (1), а затем продолжить расположение бластеремы (2). Примечание: зеленые круги в схеме предназначены только для того, чтобы показать местоположение инъекции. Морфолино можно кратко визуализировать как зеленый / желтый "слойка" после каждой инъекции; однако это не сохраняется, как показано в схеме.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump	World Precision Instruments, Inc.	PV830	Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder	World Precision Instruments, Inc.	5430-ALL	Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97	Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Number varies depending on the manufacturer	Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia