Overview
Het protocol beschrijft gerichte knockdown van genexpressie bij zebravissen door morfolino-injectie in de staart.
Protocol
1. Morfolino injectie
- Maak de dag voorafgaand aan het injecteren van de morfolino een injectieplaat (figuur 1). Zorg ervoor dat u een inkeping aan het ene uiteinde van de put uitsnijdt, wat helpt de vis te stabiliseren voor de micro-injectieprocedure.
- Verdun het met fluoresceïne gelabelde morfolino tot de juiste concentratie (aan te bevelen te beginnen met 1,2 mM) en plaats het gedurende 5 minuten in een waterbad van 65 °C.
- Laad de naald met de morfolino(let op: afhankelijk van of u de naald terugvult of voorladen, bepaalt u of u de naald eerst laadt of eerst de punt snijdt).
- Snijd de punt schuin van de naald af.
- Volg de aanwijzingen van uw micro-injectie systeem om een ongeveer 5 nl bubbel van morfolino per injectie te injecteren. Grotere hoeveelheden morfolino kunnen het weefsel verstoren.
- Verdoof de vis en plaats deze op de injectieplaat. Verwijder alle overtollige vloeistof en oriënteer de naald op de juiste plaats, net distaal naar de benige straal (Figuur 2). Injecteer de morfolino in de vin van voorste naar achterste, zoals weergegeven in figuur 2met behulp van een microscoop en micro-injectieapparatuur die geschikt is voor morfolino-injecties (zie tabel met specifieke reagentia). Injecteren van achterste naar voorste zorgt ervoor dat het vinweefsel oprolt tijdens de injectie en is erg moeilijk.
- Steek de naald voorzichtig in het regeneratieve weefsel, enkel distaal op elke benige straal (gemarkeerd met "1" in figuur 2) en duw distaal totdat deze zich in het blastema bevindt (gemarkeerd met "2" in figuur 2). Zorg ervoor dat u de naald niet door de hele vin duwt. Wanneer de naald correct is gelokaliseerd, injecteert u de morfolino (d.w.z. één keer klikken). Bij 1,2 mM lijkt de met fluoresceïne gelabelde morfolino-oplossing geelgroen, zelfs bij normaal licht. Bij elke injectie kan een gele "puff" van morfolino-oplossing worden gevisualiseerd, wat helpt de injectie op het blastema te lokaliseren. Per benige straal moet ongeveer 75 nl (10-15 klikken) morfolino-oplossing worden geïnjecteerd. Pauzeer ~ 1 seconde tussen klikken. We injecteren alleen de dorsale kant, met behulp van de ventrale als elektroporatie-only controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. A. Schematisch van de injectieplaat, die is gemaakt van agarose en een kleine put bevat om de vis vast te houden tijdens de micro-insectie van de morfolino.
Figuur 2. Schematisch van morfolino micro-injection. A. Plaats de vis in de schaal met de kop van de vis in de uitgesneden inkeping uit de put, waardoor de vis stabiel blijft. B. Bij een lage vergroting, schik de naald zodat deze dicht bij het regenererende weefsel van de vin ligt. C. Injecteer bij een hogere vergroting het morfolino distaal op elke benige vinstraal (d.w.z. in elk blastema). De naald moet het weefsel net distaal naar de benige straal (1) binnendringen en vervolgens doorgaan naar de locatie van het blastema (2). Opmerking: de groene cirkels in het schema zijn alleen bedoeld om de locatie van de injectie weer te geven. De morfolino kan kort worden gevisualiseerd als een groen/gele "puff" na elke injectie; dit blijft echter niet bestaan zoals in het schema wordt weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| Micro-injection pump | World Precision Instruments, Inc. | PV830 | Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used |
| Micro-manipulator | World Precision Instruments, Inc. | MMJR | Right-handed (MMJL for lefthanded) |
| Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
| Needle holder | World Precision Instruments, Inc. | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
| Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
