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Encyclopedia of Experiments

DNA-Extraktion aus Schwanz Clip: Eine Methode in Zebrafisch Genotypisierung verwendet

Overview

Dieser Artikel beschreibt die DNA-Extraktion aus Zebrafischschwanzclip. Das Protokoll demonstriert eine schnelle und effiziente Methode zur Analyse von Zebrafischgenotypen.

Protocol

1. DNA-Vorbereitung

  1. Herstellung von DNA-Lysepuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. Fügen Sie frische Proteinase K zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml am Tag der Anwendung hinzu.
  2. Gewebesammlung:
    1. Für erwachsene Fischflossenclip:
      1. Anästhesisieren Sie Fische: Legen Sie den Fisch in 0.004% MS-222 (Tricain) Lösung. Warten Sie, bis sich die Kiemenbewegung verlangsamt.
      2. Legen Sie Fisch auf einen Stapel von 5-10 Kimwipes und schneiden Sie ein kleines Stück der Schwanzflosse, etwa 2-3 mm, mit einer sterilen Rasierklinge.
      3. Legen Sie den Fisch schnell in einen markierten Tank mit frischem Wasser für die Erholung; Beschriften Sie sorgfältig sowohl den Tank als auch das entsprechende Rohr, das den Flossenclip enthält. Wechseln Sie das Wasser und füttern Sie die Fische jeden zweiten Tag.
      4. Nehmen Sie den Flossenclip mit einer sterilen Pipettenspitze auf und übertragen Sie ihn in ein Rohr, das mit einem 100-l-DNA-Lysepuffer gefüllt ist.
      5. Entsorgen Sie die Pipettenspitze, und entsorgen Sie die Rasierklinge in einen scharfen Behälter.
    2. Für Embryoschwanzclip:
      1. Setzen Sie Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricain) Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Schneiden Sie ein Stück Schwanz mit Zange unter einem Sezieren Mikroskop.
      3. Legen Sie den Schwanz in ein beschriftetes Rohr, das mit einem 30-l-DNA-Lysepuffer gefüllt ist.
      4. Den Embryo schnell in eine Röhre geben, die 100 l 4% Paraformaldehyd enthält.
      5. Etikettenrohre mit Embryonen und ihren dazugehörigen Schwanzröhren.
      6. Lagern Sie die Rohre mit Embryonen bei 4 °C über Nacht zur Fixierung.
      7. Reinigen Sie die Zange mit Milli-Q-Wasser und Kimwipes zwischen jedem Embryo, um die Kontamination zu minimieren.
    3. Für ganze Embryonen:
      1. Setzen Sie Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricain) Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Legen Sie 1-5 Embryonen in ein Rohr, das mit einem DNA-Lysepuffer von 100 l gefüllt ist. Dechorionation ist nicht notwendig.
  3. DNA-Verdauung
    Inkubieren Sie Tuben mit Gewebe (Flossen- oder Schwanzclips oder Embryonen) bei 55 °C für 4 Stunden bis über Nacht.
  4. Inaktivieren Sie die Proteinase K
    Wärmerohre auf 95 °C für 15 min. DNA sollte sofort für PCR verwendet oder bei -20 °C für bis zu 3 Monate gelagert werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire HRLS-ASY-0002 www.biofiredx.com
Tricaine 
Paraformaldehyde

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