Eletrofisiologia do grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar propriedades elétricas de neurônios

Overview

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios Mauthner e outras células reticulospinais em embriões de zebrafish.

Protocol

1. Gravação do grampo de patches (modo célula inteira)

1. Todas as gravações são realizadas em todo o modo de remendo celular. As câmaras de gravação são colocadas em um estágio de microscópio em uma configuração de eletrofisiologia. Nossos estágios são fixos e o microscópio de grampo de remendo vertical é aparafusado em uma plataforma de microscópio móvel ou um tradutor de microscópio.
2. As pipetas do grampo de remendo são puxadas em um puxador horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de vidro borossilicato de paredes finas obtidos do WPI. Os diâmetros da ponta pipeta estão na ordem de 0,2-0,4 μm após o polimento do fogo para uma borda lisa, e o afunilador da haste tem ~4 mm de comprimento.
3. Conecte a pipeta ao estágio da cabeça do amplificador na configuração de eletrofisiologia. É importante manter a cabeça em ângulo de aproximadamente 45° para o eixo horizontal, pois isso garante um ângulo de entrada para a pipeta adequada para a formação de vedações de alta resistência na célula Mauthner.
4. Pouco antes de entrar na solução de banho, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para reduzir a chance de sujar a ponta. Ao registrar mEPSCs, as soluções de banho incluem 1 μM TTX para bloquear potenciais de ação, 5 μM de estricnina para bloquear receptores de glicina e 10 μM bicucullina ou 100 μM picrotoxina para bloquear receptores GABAA. Ao gravar mIPSCs, as soluções de banho incluem 1 μM TTX, ácido kynurnic e bicucullina ou estricnina, dependendo da atividade receptora de interesse.
5. Aproxime-se da célula M com uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta. A pressão positiva empurra suavemente a célula de um lado para o outro e, quando posicionada imediatamente sobre a célula, forma uma pequena covinha na membrana celular. Deixe a pipeta no lugar por alguns segundos para limpar suavemente a superfície da célula para que uma vedação forte entre a pipeta e a membrana possa ser formada. A liberação da pressão positiva na pipeta permite que a vedação seja iniciada e uma pequena quantidade de pressão negativa juntamente com potenciais pipetas negativos resulta em selos GigaΩ formando em poucos segundos.
6. Altere o potencial de retenção do amplificador para -60 mV. Rompa a membrana celular com uma série de pulsos curtos de sucção. Regissos imediatamente potenciais de membrana e minimize artefatos de capacitância. Compensar a capacitância celular (Cm) e o acesso (série) resistência (Ra) em 70-85%. Ra deve ser monitorado rotineiramente, a cada 30 segundos a um minuto, e se houver uma mudança de 20% ou mais, aborte o experimento.
7. Uma vez que o experimento tenha terminado e dados suficientes foram adquiridos, a preparação é sacrificada removendo o cérebro traseiro com um par de fórceps. Neste ponto, a análise de dados pode começar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette Puller	Sutter Instruments Co	P-97
Upright Patch clamp microscope	Leica Microsystems	DMLFSA
Amplifier	Molecular Devices	200B
Micromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500