기계적 해리: 조직에서 실행 가능한 세포를 얻는 방법

Overview

이 비디오는 실행 가능한 세포를 얻기 위해 신선한 인간 조직의 비 효소 해리를 설명합니다. 이 기술은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45 양성 세포 (림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 분석을 위해 사용됩니다.

Protocol

1. 조직 호모게네이트의 준비

1. 해부 된 조직 (수술실에서 제복된 악성 및 정상 조직)은 즉시 픽업을위한 숙련 된 인력에 의해 병리학 실험실에 있습니다. 종양, NANT (가능한 한 종양에서 가장 먼 거리를 촬영) 및 정상적인 조직 단편은 인간 조직에 대한 표준 생물 안전 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 수술 절제의 1 - 3 시간 이내에 정기적으로 처리됩니다. 프로토콜의 흐름 차트는 도 1에도시되어 있습니다.
2. 모든 조직 단편(정상, 난터 및 종양)의 무게와 길이, 너비 및 높이(길이 x 너비 x 높이)를 측정합니다. 이것은 세포 하위 집단, 추출된 RNA 등의 후속 정상화를 위한 중요한 단계입니다.
   참고: 샘플 크기의 범위는 가능하면 지방이 없는 100~10,000mm^3입니다.
3. H&E 염색을 위한 유리 슬라이드에 종양 단편을 각인하여 조직이 실제로 종양의 일부인지 확인합니다.
   1. 종양 조각에 유리 현미경 슬라이드를 누르고 몇 초 동안 손가락으로 부드러운 압력을 가하여이 작업을 수행하십시오.
   2. 이소프로파놀로 슬라이드를 2분 간 고정한 다음 물 에서 세척 단계를 수행합니다. 메이어의 헤마톡시린과 30 초 동안 조직을 카운터 스테인.
   3. 6개의 욕조에서 슬라이드를 씻으십시오. 플록신 B의 얼룩은 15초 동안 2%
   4. 한 번의 목욕으로 씻고 이소프로판놀 4개 욕조를 식시켜 1개의 목욕으로 마무리합니다.
   5. 이소프로파놀에 1분 간 배양하고 배수합니다. 자일렌의 두 개의 욕조에서 취소합니다.
   6. 자일렌 기반 마운팅 매체와 함께 마운트. 종양 세포성에 대한 검사(도 2).
      참고: 주로, 종양 세포는 각인 된 슬라이드에 충실 - 기질, 림프성 또는 지방 세포는 거의 남아, 종양 세포 사이의 공간을 떠나(도 2).
4. 조직 조각을 화학적으로 정의된 혈청 없는 조혈 세포 배지(이하 중간이라고 함)를 포함하는 작은 배양 접시에 배치하여 멸균 메스를 사용하여 작은 조각(~1-2mm^{2mm 2)으로}주사위한다.
5. 모든 것 (조직 단편 + 중간)을 기계적 해리C 튜브로 옮기십시오.
6. 페트리 접시와 메스를 파스퇴르 파이펫을 사용하여 2 ml의 매체로 헹구고 C 튜브 (해리를위한 매체의 부피 = 3 ml)에 추가하십시오.
7. C 튜브 (가장 부드러운 프로그램)에 대한 기계적 해리 프로그램 A.01을 사용하여 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 균질화하십시오. 장치에 C 튜브를 놓고 프로그램을 두 번 연속으로 실행합니다 (1 사이클 = 25 초).
   참고: 이 균질화 절차는 확립되고 인간 유방 조직을 위해 검증되었습니다, 그밖 종양 또는 조직 모형은 다른 프로그램을 사용해야 할 지도 모르고 먼저 시험되어야 합니다.
8. 장치에서 C 튜브를 제거하고 50ml 튜브에 앉은 40 μm 셀 스트레이너로 직접 균형 극조를 제거합니다. 1.6단계와동일한 파스퇴르 파이펫을 사용하여 C 튜브에 남아 있는 액체를 셀 스트레이너로 이송합니다.
9. 1ml 마이크로피펫 팁을 사용하여 여과된 액체를 15ml 튜브로 옮길 수 있습니다. 일시적으로 셀 스트레이너와 50ml 튜브를 유지합니다.
10. C 튜브를 추가로 3 ml의 중간 크기로 헹구고 이것을 옮기고, 다시 1.6 단계와동일한 파스퇴르 파이펫을 사용하여 50ml 튜브에 앉아있는 셀 스트레이너로 이동합니다. 투명하게 된 조직에 갇힌 잔류액의 최대 량을 50ml 튜브에 넣고 깨끗한 파스퇴르 파이펫 또는 1ml 팁으로 스트레이너 주위를 부드럽게 움직여 용출을 오염시키는 것을 피하십시오.
11. 세포 스트레이너를 원래 C 튜브에 거꾸로 놓고 3 ml의 배지로 헹구어 불균성 조직이 C 튜브로 다시 떨어뜨립니다.
12. A.01 프로그램의 두 주기에 대해 1.7 단계와 같이 다시 균질화합니다.
13. 50ml 튜브에 앉은 셀 스트레이너를 통해 이 두 번째 호모게이닝을 붓고, 3ml 배지(1.10단계)로C 튜브를 다시 헹구고, 파스퇴르 파이펫으로 50ml 튜브에 앉은 셀 스트레이너로 다시 전달하여 셀 스트레이너에 갇힌 잔류 결합 조직에서 최대 양의 액체를 다시 짜냅니다.
14. 이 시점에서~ 2.5 ml의 부피는 15ml 튜브에, ~9ml는 50 ml 튜브에 들어있습니다.

2. 조직 수퍼네티및 세포의 분리

1. 원심분리기는 실온에서 600 x g에서 15 분 동안 15 ml 및 50ml 튜브의 균질화합니다.
2. 15ml 튜브에서 SN을 깨끗한 튜브로 데칸트하고 일시적으로 4 °C에 보관하십시오. 이러한 상피 = 1차 종양, 낭트 또는 정상 조직 SN(최종 부피 2.5 ml)은 향후 분석을 위해 -80°C에서 저장하기 전에 이후에 명확히 및 알리인용된다(아래 참조).
3. 50ml 튜브에서 상체를 버리십시오.
4. 1ml 배지의 최종 부피로 두 셀 펠릿을 부드럽게 재보일시 중단합니다. 간단히, 먼저 부드럽게 두 튜브에 세포 펠릿을 깰 (하드 표면에 튜브를 눌러). 50ml의 느슨한 셀 펠릿을 배지 500 μl로 재중단하고 이 셀 현탁액을 15ml 튜브로 이송하여 두 번째 펠릿을 재보펜한다. 세포의 최대 회복을 위해 배지의 두 번째 500 μl으로 이 단계를 한 번 반복합니다.
5. 세포 현탁액의 10 μl을 작은 튜브로 옮기고, 트라이판 블루(희석 1:1)의 10 μl과 혼합하고 혈류계를 사용하여 실행 가능한 세포의 수를 계산합니다.
   참고: 이 시점에서 세포 현탁액의 분획은 또한 세포 크기, 세분성 및 광범위한 분석 또는 실험 전에 균등에서 상대 세포 분포의 보다 정확한 평가를 위해 제한된 수의 하위 집단 마커를 평가하기 위해 혈중 세포 측정에 의해 분석될 수 있다. 흐름 세포측정에 의한 모든 분석에는 하위 채우기의 정규화를 위한 CD45 라벨링이 통합됩니다.
6. 실온에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리로 세포를 펠렛. 종양, NANT 또는 정상 조직에서 세포는 이제 추가 정화 또는 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이러한 추가 단계는 수술과 같은 날에 수행 될 때 가장 좋습니다.
   참고: 유동 세포 분석의 경우 잔류 적혈구를 분류하는 세포는 세포 펠릿에 적혈구 용해 완충제 0.4 ml를 첨가하고, 즉시 1 초 동안 소용돌이를 내고, 분석 전에 실온 (빛으로부터 보호)에서 최소 10 분 배양함으로써 항체 라벨링 후 용액되어야합니다.

3. 조직 상수의 해명

1. 4°C에서 15분 동안 15,000 x g에서 조직 SN이 있는 1.5 ml 튜브원심분리기.
2. 펠릿을 만지거나 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 원하는 알리쿼트의 수와 부피에 따라 깨끗한 튜브(또는 튜브)로 옮겨주세요.
3. 향후 사용을 위해 -80°C에 상체를 저장합니다.

Representative Results

그림 1: 프로토콜 흐름 차트입니다. 인간 조직에 침투하는 림프구를 평가하는 데 사용할 수있는 신선한 인간 조직 및 일부 분석 적 접근법을 처리하는 절차가 표시됩니다.

그림 2: 유방 종양 조직 각인의 H&E 염색 이미지. 신선한 유방 종양 조직 단편에서 취한 이 각인은, 전송되지 않은 지역을 반영하는 열린 공간으로 종양 세포의 존재를 보여줍니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain