Mekanik Ayrışma: Dokudan Uygulanabilir Hücreler Elde Etme Yöntemi

Overview

Bu video, canlı hücreler elde etmek için taze insan dokusunun enzimatik olmayan ayrışmasını açıklamaktadır. Teknik, çeşitli normal ve kötü huylu insan dokularında bulunan CD45 pozitif hücrelerin (lenfositler/lökositler) nitel ve nicel analizi için kullanılır.

Protocol

1. Doku Homojenatının Hazırlanması

1. Diseksiyon resected dokular (malign ve ameliyathaneden resected normal doku) hemen almak için eğitimli personel tarafından patoloji laboratuvarındadır. Tümör, NANT (tümörden mümkün olduğunca uzak mesafe alınır) ve normal doku parçaları, insan dokuları için standart biyogüvenlik prosedürleri kullanılarak bir BSL2 laboratuvarında cerrahi eksizyonun 1 - 3 saat içinde rutin olarak işlenir. İletişim kuralının akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
2. Tüm doku parçalarını (normal, NANT ve tümör) tartın ve uzunluğu, genişliği ve yüksekliği (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçün. Bu, hücre alt nüfuslarının, çıkarılan RNA'nın vb.
   NOT: Numune boyutu aralığı 100 ila 10.000 mm^3'tür ve mümkünse yağsızdır.
3. Doku parçasının aslında tümörün bir parçası olduğunu doğrulamak için H&E lekesi için tümör parçasını cam bir kaydırağa yazdırın.
   1. Bunu, tümör parçasının üzerine cam mikroskop kaydırasına basarak ve parmaklarınızla birkaç saniye hafif basınç uygulayarak yapın.
   2. Kaydırağı izopropanol ile 2 dakika sabitleyin ve ardından suda bir yıkama adımı atın. Mayer'ın hematoksiliniyle dokuyu 30 saniye boyunca karşı koy.
   3. Kaydırağı altı banyo suda yıkayın. Phloxine B'deki leke 15 saniye boyunca% 2.
   4. Bir banyo suda yıkayın ve ardından dört banyo izopropanol yıkayın ve bir banyo su ile bitirin.
   5. İzopropanolde 1 dakika kuluçkaya yaslanın ve boşaltın. İki ksilen banyosunda temiz.
   6. Ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edin. Tümör hücreselliği için inceleyin (Şekil 2).
      NOT: Esas olarak, tümör hücreleri baskılı slayda yapışır - stromal, lenfoid veya yağ hücreleri nadiren kalır ve tümör hücreleri arasında boşluk bırakır (Şekil 2).
4. Doku parçasını oda sıcaklığında kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz hematopoetik hücre ortamının (bundan böyle orta olarak anılacaktır) 1 ml'yi içeren küçük bir kültür kabına yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak küçük parçalara (~1 - 2 mm²⁾zarlayın.
5. Her şeyi (doku parçaları + orta) mekanik bir dissosiyatör C tüpüne aktarın.
6. Petri kabını ve neşteri Pasteur pipet kullanarak 2 ml orta ile durulayın ve bunu C tüpüne ekleyin (ayrışma için ortam hacmi = 3 ml).
7. Doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonuna homojen hale getirmek için C tüpleri için mekanik ayrıştırıcı programı A.01'i (en nazik program) kullanın. C tüpünü cihaza yerleştirin ve programı art arda iki kez çalıştırın (bir döngü = 25 sn).
   NOT: Bu homojenizasyon prosedürü insan meme dokusu için belirlenmiş ve doğrulanmıştır, diğer tümör veya doku tipleri farklı bir program kullanmak zorunda kalabilir ve öncelikle test edilmelidir.
8. C tüpünü aparattan çıkarın ve homojenatı doğrudan 50 ml'lik bir tüpe oturtmuş 40 μm hücre süzgecine dekantasyona alın. Adım 1.6ile aynı Pasteur pipeti kullanarak, C tüpünde kalan herhangi bir sıvıyı hücre süzgecine aktarın.
9. Filtrelenmiş sıvıyı 1 ml mikropipette ucu kullanarak 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Hücre süzgecini ve 50 ml'lik tüpünü geçici olarak saklayın.
10. C tüpünü ek bir 3 ml orta ile durulayın ve bunu, yine 1.6 adımındaolduğu gibi aynı Pasteur pipeti kullanarak , hala 50 ml'lik tüpte oturan hücre süzgecine aktarın. 50 ml'lik tüpe, daha sonra elüatın kirlenmesini önlemek için atılan temiz bir Pasteur pipet veya 1 ml uçla hafifçe hareket ettirerek, 50 ml'lik tüpe maksimum miktarda artık sıvı sıkın.
11. Hücre süzgecini orijinal C tüpünün üzerine baş aşağı yerleştirin ve 3 ml ortamla durulayın, böylece unhomogenized doku C tüpüne geri düşer.
12. A.01 programının iki döngüsü için adım 1.7'deki gibi yeniden homojenize edin.
13. Bu ikinci homojenatı 50 ml'lik tüpe oturan hücre süzgecinden dökün, C tüpünü tekrar 3 ml orta (adım 1.10'daolduğu gibi) ile durulayın ve Pasteur pipeti ile 50 ml'lik tüpte oturan hücre süzgecine aktarın ve hücre süzgecine sıkışan artık bağ dokusundan maksimum miktarda sıvı sıkın.
14. Bu noktada, 15 ml'lik tüpte ~2,5 ml ve 50 ml'lik tüpte ~9 ml'lik bir hacim vardır.

2. Doku Süpernatant ve Hücrelerin Ayrılması

1. 15 ml ve 50 ml'lik tüplerdeki homojenatları oda sıcaklığında 600 x g'da 15 dakika santrifüj edin.
2. SN'yi 15 ml'lik tüpten temiz bir tüpe dekantlayın ve geçici olarak 4 °C'de saklayın. Bu süpernatant = primer tümör, NANT veya normal doku SN (son hacim 2.5 ml) daha sonra netleştirilir ve gelecekteki analizler için -80 °C'de depodan önce aliquoted edilir (aşağıya bakın).
3. Süpernatant'ı 50 ml'lik tüpten atın.
4. Her iki hücre peletini de 1 ml'lik son bir ortamda hafifçe yeniden sunun. Kısaca, önce her iki tüpteki hücre peletini hafifçe kırın (tüpü sert bir yüzeye dokunarak). Gevşek hücre peletini 50 ml'deki gevşek hücre peletini 500 μl orta ile yeniden ıslatın ve ikinci peletin yeniden ıslatılsın diye bu hücre süspansiyonu 15 ml'lik tüpe aktarın. Hücrelerin maksimum geri kazanımı için bu adımı ikinci 500 μl orta ile bir kez tekrarlayın.
5. Hücre süspansiyonunun 10 μl'lik kısmını küçük bir tüpe aktarın, 10 μl trippan mavisi (seyreltme 1:1) ile karıştırın ve hemositometre kullanarak uygulanabilir hücre sayısını sayın.
   NOT: Bu noktada hücre süspansiyonunun bir kısmı, hücre boyutunu, parçalılığı değerlendirmek için akış sitometrisi ile ve istenirse, kapsamlı analiz veya deneylerden önce homojendeki bağıl hücre dağılımının daha hassas bir şekilde değerlendirilmesi için sınırlı sayıda alt nüfus belirteci ile analiz edilebilir. Akış sitometrisine göre yapılan tüm analizler, alt nüfusların normalleştirilmesi için CD45 etiketlemesini içerir.
6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile hücreleri peletin. Tümör, NANT veya normal dokudan alınan hücreler artık daha fazla arınma veya analiz için hazırdır. Bu ek adımlar, ameliyatla aynı gün gerçekleştirildiğinde en iyisidir.
   NOT: Akış sitometrik analizi için, ancak hücre sıralama değil, kalıntı kırmızı kan hücreleri, hücre peletine 0,4 ml kırmızı kan hücresi lizis tamponu eklenerek antikor etiketlemesinden sonra, derhal 1 saniye boyunca girdaplanarak ve analizden önce oda sıcaklığında (ışıktan korunan) en az 10 dakika inkübe edilerek lizoz edilmelidir.

3. Doku ÜstNatantının Netleştirilmesi

1. 1.5 ml'lik tüpleri 15.000 x g'da doku SN ile 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
2. Peletin dokunmadan veya rahatsız etmeden süpernatant dikkatlice çıkarın. İstenen aliquot sayısına ve hacmine bağlı olarak temiz bir tüpe (veya tüplere) aktarın.
3. İleride kullanmak üzere süpernatant 'ı -80 °C'de saklayın.

Representative Results

Şekil 1: Protokol akış şeması. Taze insan dokularını işleme prosedürümüz ve daha sonra insan dokularına sızan lenfositleri değerlendirmek için kullanılabilecek bazı analitik yaklaşımlar gösterilmiştir.

Şekil 2: Meme tümörü dokusunun H&E lekeli görüntüsü. Taze bir meme tümörü doku parçasından alınan bu künye, transfer yapılmayan alanları yansıtan açık alanlarla tümör hücrelerinin varlığını göstermektedir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain