Mekanisk dissociation: En metod för att erhålla livskraftiga celler från en vävnad

Overview

Denna video beskriver icke-enzymatiska dissociation av färsk mänsklig vävnad för att erhålla livskraftiga celler. Tekniken används för kvalitativ och kvantitativ analys av CD45 positiva celler (lymfocyter/leukocyter) finns i olika normala och maligna mänskliga vävnader.

Protocol

1. Beredning av vävnadshom homogenatet

1. Dissekera resected vävnader (maligna och normala vävnad resected från operationssalen) är i patologi lab av utbildad personal för omedelbar upphämtning. Tumör, NANT (tas längst bort från tumören som möjligt) och normala vävnad fragment behandlas rutinmässigt inom 1- 3 timmar av kirurgiska excision i ett BSL2 laboratorium med standard biosäkerhet förfaranden för mänskliga vävnader. Ett flödesschema för protokollet illustreras i figur 1.
2. Väg alla vävnadsfragment (normal, NANT och tumör) och mät längd, bredd och höjd (längd x bredd x höjd). Detta är ett viktigt steg för efterföljande normalisering av cell subpopulationer, extraherade RNA, etc.
   OBS: Provtagningsstorleken är 100 till 10 000 mm³ utan fett om möjligt.
3. Prägla tumörfragmentet på en glasrutschbana för H&E-färgning för att verifiera att vävnaden faktiskt är en del av tumören.
   1. Gör detta genom att trycka på ett glasmikroskop glid på tumörfragmentet och applicera försiktigt tryck med fingrarna i några sekunder.
   2. Fixera rutschkanan med isopropanol i 2 min följt av ett tvättsteg i vatten. Kontrahåll vävnaden i 30 sekunder med Mayers hematoxylin.
   3. Tvätta rutschkanan i sex bad vatten. Fläck i Phloxine B 2% i 15 sek.
   4. Tvätta i ett bad vatten följt av fyra bad av isopropanol och avsluta med ett bad vatten.
   5. Inkubera i isopropanol i 1 min och dränera. Klart i två bad av xylen.
   6. Montera med xylenbaserat monteringsmedium. Undersök för tumör cellularity (Figur 2).
      OBS: Huvudsakligen håller tumörcellerna fast vid den präglade bilden - de stromala, lymfoida eller fettcellerna kvarstår sällan, vilket lämnar utrymmen mellan tumörcellerna (Figur 2).
4. Placera vävnadsfragmentet i en liten odlingsfat som innehåller 1 ml av det kemiskt definierade, serumfria hematopoetiska cellmediet (nedan kallat medium) vid rumstemperatur och tärna det i små bitar (~ 1 - 2 mm²) med hjälp av en steril skalpell.
5. Överför allt (vävnadsfragment + medium) till ett mekaniskt dissociator C-rör.
6. Skölj petriskålen och skalpellen med 2 ml medium med en Pasteur-pipett och tillsätt den i C-röret (volym medium för dissociation = 3 ml).
7. Använd det mekaniska dissociatorprogrammet A.01 för C-rör (det mest skonsamma programmet) för att homogenisera vävnadsfragmenten till en enda cellupphängning. Placera C-röret i apparaten och kör programmet två gånger i följd (en cykel = 25 sek).
   OBS: Detta homogeniseringsförfarande har fastställts och validerats för mänskliga bröstvävnad, andra tumör- eller vävnadstyper kan behöva använda ett annat program och bör testas först.
8. Ta bort C-röret från apparaten och dekantera homogenatet direkt i en 40 μm cellsil sittande på ett 50 ml-rör. Använd samma Pasteurpipett som i steg 1.6, överför eventuell vätska som finns kvar i C-röret till cellsilen.
9. Överför den filtrerade vätskan till ett 15 ml-rör med en 1 ml mikropipettespets. Håll tillfälligt cellsilen och dess 50 ml rör.
10. Skölj C-röret med ytterligare 3 ml medium och överför detta, återigen med samma Pasteur-pipett som i steg 1.6, till cellsilen som fortfarande sitter på 50 ml-röret. Pressa en maximal mängd restvätska som fastnat i den oförminskade vävnaden i 50 ml-röret genom att försiktigt flytta den runt silen med en ren Pasteur-pipett eller 1 ml spets som sedan kastas bort för att undvika att förorena eluaten.
11. Placera cellsilen upp och ner på det ursprungliga C-röret och skölj med 3 ml medium så att den oförhomogeniserade vävnaden faller tillbaka i C-röret.
12. Homogenisera igen som i steg 1.7 för två cykler av A.01-programmet.
13. Häll denna andra homogenation genom cellsilen som sitter på 50 ml-röret, skölj C-röret igen med 3 ml medium (som i steg 1.10) och överför med Pasteur-pipetten till cellsilen som sitter på 50 ml-röret igen och klämmer en maximal mängd vätska från den återstående bindväven som är instängd i cellsilen.
14. Vid denna tidpunkt är en volym på ~ 2,5 ml i 15 ml-röret och ~ 9 ml i 50 ml-röret.

2. Separation av vävnadens supernatant och celler

1. Centrifugera homogenaterna i rören 15 ml och 50 ml i 15 minuter vid 600 x g vid rumstemperatur.
2. Dekanta SN från 15 ml-röret i ett rent rör och förvara tillfälligt vid 4 °C. Detta supernatant = primärtumör, NANT eller normal vävnad SN (slutlig volym 2, 5 ml) förtydligas därefter och aliquoted före lagring vid -80 °C för framtida analyser (se nedan).
3. Kassera supernaten från 50 ml-röret.
4. Återanvänd försiktigt båda cellpelletsen i en slutlig volym av 1 ml medium. Kort, bryt först försiktigt cellpelleten i båda rören (genom att knacka röret på en hård yta). Återanvänd den lösa cellpelleten i 50 ml med 500 μl medium och överför denna cellfjädring till 15 ml-röret för att återanvända den andra pelleten. Upprepa detta steg en gång med den andra 500 μl medium för maximal återhämtning av celler.
5. Överför 10 μl av cellfjädringen till ett litet rör, blanda med 10 μl trypanblått (utspädning 1:1) och räkna antalet livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometer.
   OBS: Vid denna tidpunkt kan en bråkdel av cellupphängningen också analyseras genom flödescytometri för att utvärdera cellstorlek, granularitet och om så önskas ett begränsat antal subpopulationsmarkörer för mer exakt bedömning av den relativa cellfördelningen i homogenatet före omfattande analys eller experiment. Alla analyser av flöde cytometri införliva CD45 märkning för normalisering av subpopulationer.
6. Pellet cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 10 min vid rumstemperatur. Cellerna från tumör, NANT, eller normal vävnad är nu redo för ytterligare rening eller analys. Dessa ytterligare steg är bäst när de utförs samma dag som kirurgi.
   OBS: För flödescytometrisk analys men inte cellsortering ska de återstående röda blodkropparna lysas efter antikroppsmärkning genom att 0, 4 ml lysbuffert för röda blodkroppar tillsätts till cellpelletsen, omedelbart virvla i 1 sekund och inkubera minst 10 minuter vid rumstemperatur (skyddad från ljus) före analys.

3. Förtydligande av vävnads supernatanten

1. Centrifugera 1,5 ml-rören med vävnad SN vid 15 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
2. Ta försiktigt bort supernaten utan att vidröra eller störa pelleten. Överför till ett rent rör (eller rör) beroende på antalet och volymen av önskade alikvoter.
3. Förvara supernaten vid -80 °C för framtida användning.

Representative Results

Figur 1: Protokollflödesschema. Vårt förfarande för bearbetning av färska mänskliga vävnader och vissa analytiska metoder som senare kan användas för att bedöma lymfocyter infiltrera mänskliga vävnader visas.

Figur 2: H&E-färgad bild av ett brösttumörvävnadsavtryck. Detta avtryck, taget från en färsk bröst tumör vävnad fragment, visar förekomsten av tumör celler med öppna utrymmen återspeglar områden som inte överfördes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain