Overview
Это видео описывает не-энзиматической диссоциации свежих человеческих тканей для получения жизнеспособных клеток. Методика используется для качественного и количественного анализа положительных клеток CD45 (лимфоцитов/лейкоцитов), присутствующих в различных нормальных и злокачественных тканях человека.
Protocol
1. Подготовка гомогената тканей
- Рассеченные ткани (злокачественные и нормальные ткани, ресектированные из операционной) находятся в лаборатории патологии обученным персоналом для немедленного пикапа. Опухоль, НАНТ (взятые на расстояние от опухоли, насколько это возможно) и нормальные фрагменты тканей обычно обрабатываются в течение 1 - 3 часов хирургического иссечения в лаборатории BSL2 с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Диаграмма потока протокола иллюстрируется на рисунке 1.
- Взвесьте все фрагменты тканей (нормальные, NANT и опухоли) и измерить длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализации подпопуляций клеток, извлеченной РНК и т.д.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон размера выборки составляет от 100 до 10000 мм3 без жира, если это возможно. - Отпечаток фрагмента опухоли на стеклянной горке для Окрашивания Н И Е, чтобы убедиться, что ткань на самом деле является частью опухоли.
- Сделайте это, нажав стеклянный микроскоп слайд на фрагмент опухоли и применения мягкого давления пальцами в течение нескольких секунд.
- Исправить слайд с изопропанолом в течение 2 минут, а затем стиральная шаг в воде. Счетчик ткани в течение 30 сек с гематоксилин Майера.
- Вымойте горку в шести ваннах с водой. Пятно в Phloxine B 2% в течение 15 сек.
- Вымойте в одной ванне воды следуют четыре ванны изопропанола и закончить с одной баней воды.
- Инкубировать в изопропанол в течение 1 мин и процедить. Очистить в двух ваннах ксилена.
- Гора с ксиленом на основе монтажа среды. Изучение клеточной опухоли(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Главным образом, опухолевые клетки прилипают к отпечатаемому слайду - стромальные, лимфоидные или жировые клетки редко остаются, оставляя пробелы между опухолевыми клетками(рисунок 2).
- Поместите фрагмент ткани в небольшую культурную тарелку, содержащую 1 мл химически определенной, без сыворотки гематопоэтической клеточной среды (далее именуемой средней) при комнатной температуре и нарежьте ее на мелкие кусочки (1 -2 мм 2)с помощью стерильного скальпеля.
- Перенесите все (фрагменты тканей и средний) в механическую диссоциаторную трубку C.
- Промыть чашку Петри и скальпель с 2 мл среды с помощью пастер пипетки и добавить это в трубку C (объем среды для диссоциации 3 мл).
- Используйте программу механического диссоциатора A.01 для C-труб (самая нежная программа) для гомогенизации фрагментов тканей в одноклеточную подвеску. Поместите трубку C в аппарат и запустите программу дважды подряд (один цикл - 25 сек).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура гомогенизации была создана и проверена для ткани молочной железы человека, других типов опухолей или тканей, возможно, потребуется использовать другую программу и должны быть проверены в первую очередь. - Удалите трубку C из аппарата и декантировать гомогенат непосредственно в 40 мкм ситечко клеток, сидящих на 50 мл трубки. Используя ту же трубу Pasteur, что и в шаге 1.6,перенесите любую жидкость, оставшуюся в трубке C, в ситечко клетки.
- Перенесите фильтрованную жидкость в трубку 15 мл с помощью наконечника микропипетта 1 мл. Временно держите клеточный ситечко и его 50 мл трубки.
- Промыть трубку C с дополнительными 3 мл среды и передать это, опять же с помощью той же трубы Пастера, как в шаге 1,6, к клетке ситечко еще сидит на 50 мл трубки. Сожмите максимальное количество остаточной жидкости, попав в неоднородную ткань, в трубку 50 мл, аккуратно перемещая ее вокруг ситечко с чистой трубой Pasteur или 1 мл наконечником, который впоследствии выбрасывается, чтобы избежать загрязнения элуата.
- Поместите ситечко клетки вверх дном на оригинальную трубку C и промойте 3 мл среды так, чтобы неоднородная ткань упала обратно в трубку C.
- Ре-гомогенизации, как в шаге 1.7 в течение двух циклов программы A.01.
- Налейте этот второй гомогенат через клеточный ситечко, сидящий на 50 мл трубки, промыть трубку C снова с 3 мл среды (как в шаге 1.10) и передачи с Пастер пипетки к клетке ситечко сидит на 50 мл трубки снова сжимая максимальное количество жидкости из остаточной соединительной ткани, оказавшихся в клетке ситечко.
- На данный момент объем 2,5 мл находится в трубке 15 мл и 9 мл в 50 мл трубки.
2. Разделение ткани supernatant и клеток
- Центрифуга гомогенатов в 15 мл и 50 мл труб в течение 15 мин при 600 х г при комнатной температуре.
- Decant SN из 15 мл трубки в чистую трубку и временно хранить при 4 градусов по Цельсию. Эта супернатантная первичная опухоль, НАНТ или нормальная ткань SN (окончательный объем 2,5 мл) впоследствии проясняется и алицитирована перед хранением при -80 градусов по Цельсию для будущих анализов (см. ниже).
- Откажитесь от супернатанта из 50 мл трубки.
- Аккуратно повторно посовекуйте обе клеточные гранулы в итоговом объеме 1 мл среды. Короче говоря, сначала осторожно разорвать ячейки гранулы в обеих трубках (нажав трубку на твердой поверхности). Resuspend свободные гранулы клетки в 50 мл с 500 мкл среды и передачи этой клеточной подвески на 15 мл трубки для повторного перерасхода второй гранулы. Повторите этот шаг один раз со вторыми 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
- Перенесите 10 мкл клеточной подвески в небольшую трубку, смешайте с 10 мкл трипан-голубого (разбавление 1:1) и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент часть клеточной суспензии также может быть проанализирована цитометрией потока для оценки размера клетки, детализации и при желании ограниченного числа маркеров субпопуляции для более точной оценки относительного распределения клеток в гомогенате до обширного анализа или экспериментов. Все анализы по цитометрии потока включают маркировку CD45 для нормализации субпопуляций. - Пеллет клеток центрифугации при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки опухоли, NANT или нормальной ткани теперь готовы к дальнейшей очистке или анализу. Эти дополнительные шаги лучше всего выполнять в тот же день, как операция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для цитометрического анализа потока, но не сортировки клеток остаточные красные кровяные тельца должны быть лизированы после маркировки антител, добавив 0,4 мл буфера лиза красных кровяных телец к клеточной грануле, немедленно вихревой в течение 1 сек и инкубации минимум 10 мин при комнатной температуре (защищенной от света) до анализа.
3. Уточнение ткани Supernatant
- Центрифуга 1,5 мл трубок с тканью SN при 15000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Аккуратно удалите супернатант, не касаясь и не нарушая гранулы. Передача в чистую трубку (или трубки) в зависимости от количества и объема желаемых алиментов.
- Храните супернатант при -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Диаграмма потока протокола. Показана наша процедура обработки свежих тканей человека и некоторые аналитические подходы, которые впоследствии могут быть использованы для оценки лимфоцитов, проникающих в ткани человека.
Рисунок 2: H и E окрашенных изображение отпечатка опухолевой ткани молочной железы. Этот отпечаток, взятый из свежего фрагмента опухолевой ткани молочной железы, показывает наличие опухолевых клеток с открытыми пространствами, отражающими области, которые не были переданы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
Bürker Chamber Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer | |
Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 510 | or standard single use sterile scalpel |
BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |