דיסוציאציה מכנית: שיטה להשגת תאים בני קיימא מרקמה

Overview

סרטון זה מתאר את הניתוק הלא אנזימטי של רקמה אנושית טרייה כדי להשיג תאים בני קיימא. הטכניקה משמשת לניתוח איכותי כמותי של תאים חיוביים CD45 (לימפוציטים / לויקוציטים) הנמצאים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות.

Protocol

1. הכנת הרקמה הומוגנטית

1. ניתוח רקמות מנוכות (רקמות ממאירות ונורמליות שהושלכו מחדר הניתוח) נמצאות במעבדה הפתולוגית על ידי כוח אדם מיומן לאיסוף מיידי. גידול, NANT (נלקח את המרחק הרחוק ביותר מן הגידול ככל האפשר) שברי רקמות נורמלי מעובדים באופן שגרתי בתוך 1 - 3 שעות של כריתה כירורגית במעבדה BSL2 באמצעות הליכים biosafety סטנדרטי עבור רקמות אנושיות. תרשים זרימה של הפרוטוקול מאויר באיור 1.
2. שוקלים את כל שברי הרקמות (רגיל, NANT וגידול) ומודדים את האורך, הרוחב והגובה (אורך x רוחב x גובה). זהו צעד חשוב לנורמליזציה הבאה של תת-אוכלוסיות תאים, רנ"א שחולץ וכו '.
   שים לב: טווח גודל המדגם הוא 100 עד 10,000 מ"מ³ ללא שומן במידת האפשר.
3. להטביע את שבר הגידול על שקופית זכוכית עבור כתמי H&E כדי לוודא כי הרקמה היא למעשה חלק מהגידול.
   1. עשה זאת על ידי לחיצה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית על שבר הגידול והפעלת לחץ עדין עם האצבעות במשך כמה שניות.
   2. לתקן את המגלשה עם isopropanol במשך 2 דקות ואחריו שלב כביסה במים. נגד הכתים את הרקמה למשך 30 שניות עם המטוקסילין של מאייר.
   3. שטפו את המגלשה בשש אמבטיות מים. כתם בפלוקסין B 2% למשך 15 שניות.
   4. לשטוף באמבט אחד של מים ואחריו ארבע אמבטיות של isopropanol ולסיים עם אמבטיה אחת של מים.
   5. דגירה ב isopropanol במשך 1 דקות לנקז. נקי בשתי אמבטיות של קסילן.
   6. הרכבה עם מדיום הרכבה מבוסס xylene. בדוק אם יש תאיות גידולית (איור 2).
      שים לב: בעיקר, תאים סרטניים נדבקים לשקופית המוטבעת - תאי הסטרומל, הלימפה או השומן נשארים לעתים רחוקות, ומשאירים רווחים בין תאי הגידול(איור 2).
4. מניחים את שבר הרקמה בצלחת תרבות קטנה המכילה 1 מ"ל של מוגדר כימית, בינוני תא hematopoietic ללא סרום (להלן המכונה בינוני) בטמפרטורת החדר קוביות אותו לחתיכות קטנות (~ 1 - 2 מ"מ²) באמצעות אזמל סטרילי.
5. להעביר הכל (שברי רקמה + בינוני) לצינור ניתוק מכני C.
6. שוטפים את צלחת פטרי ואזמל עם 2 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף את זה צינור C (נפח של בינוני עבור דיסוציאציה = 3 מ"ל).
7. השתמש בתוכנית דיסוציאטור מכני A.01 עבור צינורות C (התוכנית העדינה ביותר) כדי הומוגניזציה שברי הרקמה לתוך השעיה תא יחיד. מניחים את צינור C במנגנון ולהפעיל את התוכנית פעמיים ברציפות (מחזור אחד = 25 שניות).
   שים לב: הליך הומוגניזציה זה הוקם ואמת עבור רקמת השד האנושית, סוגים אחרים של גידול או רקמות ייתכן שיהיה צורך להשתמש בתוכנית אחרת ויש לבדוק תחילה.
8. הסר את צינור C מהמנגנון ו decant הומוגנט ישירות לתוך מסננת תאים 40 מיקרומטר יושב על צינור 50 מ"ל. באמצעות אותו פיפטה פסטר כמו בשלב 1.6, להעביר כל נוזל שנותר בצינור C למסננת התא.
9. מעבירים את הנוזל המסונן לצינור של 15 מ"ל בעזרת קצה מיקרופיפט של 1 מ"ל. באופן זמני לשמור על מסננת התא שלה צינור 50 מ"ל.
10. לשטוף את הצינור C עם 3 מ"ל נוספים של בינוני ולהעביר את זה, שוב באמצעות פיפט פסטר אותו כמו בשלב 1.6, כדי מסננת התא עדיין יושב על הצינור 50 מ"ל. לסחוט כמות מקסימלית של נוזל שיורית לכודים ברקמה unhomogenized לתוך הצינור 50 מיליליטר על ידי בעדינות להזיז אותו סביב מסננת עם פיפטה פסטר נקי או 1 קצה מיליליטר כי הוא נזרק לאחר מכן משם, כדי למנוע זיהום ההבראה.
11. מניחים את מסננת התא במהופך על צינור C המקורי ולשטוף עם 3 מ"ל של מדיום, כך הרקמה unhomogenized טיפות בחזרה לתוך הצינור C.
12. הומוגניזציה מחדש כמו בשלב 1.7 עבור שני מחזורים של תוכנית A.01.
13. יוצקים את ההומוגנט השני דרך מסננת התאים היושבת על צינור 50 מ"ל, שוטפים שוב את צינור C עם 3 מ"ל בינוני (כמו בשלב 1.10)ומעבירים עם פיפט פסטר למסננת התא היושבת על צינור 50 מ"ל שוב סוחטת כמות מקסימלית של נוזל מרקמת החיבור השיורית שנלכדה במסננת התאים.
14. בשלב זה, נפח של ~ 2.5 מ"ל הוא בצינור 15 מ"ל ו ~ 9 מיליליטר בצינור 50 מ"ל.

2. הפרדת הרקמה Supernatant ותאים

1. צנטריפוגה homogenates בצינורות 15 מיליליטר ו 50 מ"ל במשך 15 דקות ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר.
2. דסנט SN מצינור 15 מ"ל לתוך צינור נקי ולאחסן באופן זמני ב 4 מעלות צלזיוס. זה supernatant = גידול ראשוני, NANT או SN רקמה נורמלית (נפח סופי 2.5 מיליליטר) לאחר מכן מובהר ו aliquoted לפני אחסון ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים (ראה להלן).
3. השלך את supernatant מצינור 50 מ"ל.
4. בעדינות resuspend שני כדורי התא בנפח סופי של 1 מ"ל בינוני. בקצרה, תחילה בעדינות לשבור את גלולת התא בשני הצינורות (על ידי הקשה על הצינור על משטח קשה). Resuspend גלולת התא רופף ב 50 מ"ל עם 500 μl של בינוני ולהעביר את ההשעיה תא זה צינור 15 מיליליטר כדי resuspend את הכדור השני. חזור על שלב זה פעם אחת עם השני 500 μl של בינוני להתאוששות מקסימלית של תאים.
5. העבר 10 μl של השעיית התא לצינור קטן, לערבב עם 10 μl של כחול trypan (דילול 1:1) ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer.
   שים לב: בשלב זה חלק קטן של השעיית התא יכול גם להיות מנותח על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את גודל התא, צפיפות ואם תרצה מספר מוגבל של סמני תת-אוכלוסין להערכה מדויקת יותר של התפלגות התאים היחסית בהומוגנט לפני ניתוח מקיף או ניסויים. כל הניתוחים על ידי cytometry זרימה לשלב תיוג CD45 לנורמליזציה של תת-אוכלוסין.
6. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התאים מהגידול, NANT, או רקמה נורמלית מוכנים כעת לטיהור נוסף או ניתוח. צעדים נוספים אלה הם הטובים ביותר כאשר מבוצע באותו יום כמו ניתוח.
   שים לב: עבור ניתוח ציטומטרי זרימה אבל לא תא מיון כדוריות הדם האדומות שיורית צריך להיות lysed לאחר תיוג נוגדן על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של מאגר תמוגה של תאי דם אדומים לכדור התא, מיד מערבולת במשך 1 שניות דגירה מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר (מוגן מפני אור) לפני הניתוח.

3. הבהרה של הרקמה Supernatant

1. צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל עם SN רקמה ב 15,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
2. בזהירות להסיר את supernatant מבלי לגעת או להפריע גלולה. העבר לצינור נקי (או צינורות) בהתאם למספר ונפח של aliquots הרצוי.
3. אחסן את supernatant ב -80 °C (60 °F) לשימוש עתידי.

Representative Results

איור 1: תרשים זרימת פרוטוקול. ההליך שלנו לעיבוד רקמות אנושיות טריות וכמה גישות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאחר מכן כדי להעריך לימפוציטים החודרים לרקמות אנושיות מוצגים.

איור 2: תמונה מוכתמת H&E של חותם רקמת גידול בשד. חותם זה, שנלקח מרסיס רקמת גידול שד טרי, מראה את נוכחותם של תאים סרטניים עם השטחים הפתוחים המשקפים אזורים שלא הועברו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain